抗番茄黃化曲葉病毒病基因ty-5的功能標(biāo)記開發(fā)與利用

鄒虎成 李玉洪 覃柳蘭 莊映紅滕獻(xiàn)有 潘玲華

（桂林市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院桂林分院，廣西桂林 541006）

近年來(lái)，由番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）引起的病害是造成番茄減產(chǎn)的重要病害之一（Zhang et al.，2009；張前榮等，2017；胡榮 等，2020），因此選育抗番茄黃化曲葉病毒病的番茄品種很有必要，而利用抗病基因培育抗病品種是防治番茄黃化曲葉病毒最有效的策略（Palumbo et al.，2001；Lapidot &Friedmann，2012；Polston，2014；劉微 等，2018）。目前國(guó)內(nèi)外選育的抗番茄黃化曲葉病毒病的番茄品種以含有抗性基因-（宋建軍 等，2011；葛乃蓬 等，2014；周明 等，2020）、-（劉夢(mèng)姣 等，2018；趙麗萍 等，2018）、-（楊悅儉 等，2011）和-（楊曉慧 等，2012）為主，而-對(duì)番茄黃化曲葉病毒病具有很高的抗性，對(duì)抗番茄黃化曲葉病毒病的番茄育種具有重要意義（王銀磊 等，2014）。秘魯番茄（）TY-172攜帶1 個(gè)抗番茄黃化曲葉病毒的隱性基因-，其位于第4 號(hào)染色體，定位在425 bp 的區(qū)域（Anbinder et al.，2009；Hutton et al.，2012；Sade et al.，2012）；開發(fā)已經(jīng)克隆的-基因的功能性分子標(biāo)記對(duì)選育含抗病基因-的番茄品種具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

目前，對(duì)-基因克隆、數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTLs）以及從SSR（simple sequence repeats）標(biāo)記庫(kù)中篩選獲得的與-基因緊密連鎖的分子標(biāo)記很難在番茄材料育種上得到應(yīng)用。其原因是，一方面，即使目前分子標(biāo)記技術(shù)的第3 代測(cè)序已經(jīng)成熟，但是非自動(dòng)化PCR 擴(kuò)增與其檢測(cè)方法受到人力和物力的制約，很難全面地應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種（Andersen &Lubberstedt，2003；賀道華 等，2009）；另一方面，這些分子連鎖標(biāo)記只能檢測(cè)出種質(zhì)資源是否含有與分子標(biāo)記連鎖的基因，無(wú)法對(duì)基因的功能變化做出相應(yīng)的分子檢測(cè)驗(yàn)證，如楊歡歡等（2015，2016）篩選出與-基因緊密連鎖的SSR 標(biāo)記，可利用此標(biāo)記檢測(cè)番茄新品種中是否導(dǎo)入了抗番茄黃化曲葉病毒病基因-，但-基因會(huì)因環(huán)境變化而發(fā)生序列突變，進(jìn)而改變-基因的抗性；如繼續(xù)用此SSR 標(biāo)記進(jìn)行含抗番茄黃化曲葉病毒病-基因新品種的分子選育，就失去了原有育種目標(biāo)與意義。

功能標(biāo)記近年來(lái)已在很多作物中有應(yīng)用報(bào)道，如水稻堊白基因功能標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用（朱金燕 等，2017），水稻粒形相關(guān)變異位點(diǎn)的功能標(biāo)記開發(fā)及其應(yīng)用（王鳴森，2015），水稻稻瘟病基因-的共顯性功能標(biāo)記的開發(fā)與利用（李永聰?shù)龋?019），大豆耐鹽相關(guān)基因功能標(biāo)記的開發(fā)與驗(yàn)證（寧麗華 等，2017），白菜類作物開花時(shí)間相關(guān)基因的克隆及功能標(biāo)記開發(fā)（劉東讓 等，2019），等等。但目前關(guān)于抗番茄黃化曲葉病毒病-基因功能標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)針對(duì)-基因編碼序列的功能性SNP 突變位點(diǎn)開發(fā)1 個(gè)-基因的功能標(biāo)記，以期為定向改良番茄品種對(duì)番茄黃化曲葉病毒病的抗性提供分子輔助育種手段。

1 材料與方法

1.1 材料

供試番茄材料為番茄黃化曲葉病毒病抗病自交系t33-14、感病自交系t2301、t33-14 ×t2301 的F株系，以及不同來(lái)源的26 份番茄材料AZC1～AZC9、BZC1～BZC6、CZC12～CZC17、DZC1～DZC5，均由桂林市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心蔬菜所番茄課題組選育、收集與保存。

1.2 番茄黃化曲葉病毒病抗病性鑒定

利用溫室集體接種法進(jìn)行病毒接種。每份材料種植30 株，當(dāng)溫室內(nèi)溫度為25～30 ℃，番茄幼苗3～4 片真葉時(shí)，每天驅(qū)蟲2 次使其均一受毒，接種30 d 后調(diào)查發(fā)病情況，并取樣（葉片）提取DNA?？共⌒澡b定期間，不使用殺蟲劑。病情級(jí)別分為0～4 級(jí)：0 級(jí)，無(wú)明顯癥狀；1 級(jí)，葉片只表現(xiàn)有黃色斑點(diǎn)或斑駁癥狀；2 級(jí)，葉片黃化，比正常植株略微矮小且輕微變形；3 級(jí)，植株矮化，葉片變小、卷曲且邊緣黃化；4 級(jí)，植株嚴(yán)重矮化，葉片皺縮、黃化、卷曲并導(dǎo)致葉片面積大大減小。0～1 級(jí)歸為抗病，2～4 級(jí)歸為感?。ㄅ硐檎?，2012）。

1.3 序列比對(duì)

Lapidot 等（2015）研究表明在-基因的編碼區(qū)域，存在1 個(gè)堿基替換的情況，其第47 位點(diǎn)處的堿基T 被替換為G，從而導(dǎo)致翻譯的蛋白質(zhì)由纈氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼?，?duì)番茄黃化曲葉病毒病由感病變?yōu)榭共　８鶕?jù)Lapidot 等（2015）提供的-基因登錄號(hào)kc447285，在NCBI 上查找到-基因的編碼序列，并在NCBI 上進(jìn)行blast 比對(duì)，得到了6 個(gè)-基因在對(duì)應(yīng)6 個(gè)番茄種質(zhì)資源（LA0441、PI126926、PI126930、PI390681、TY172 和M82）上的轉(zhuǎn)錄本（NCBI 上的登錄號(hào)分 別 為kc567256.1、kc567249.1、kc447285.1、kc567254.1、kc567248.1 和kc447288.1）以及6個(gè)轉(zhuǎn)錄本翻譯的氨基酸序列（NCBI 上的登錄號(hào)分別為agl43089.1、agl43082.1、agj52120.1、agl43087.1、agl43081.1 和agj52123.1）。將上述6個(gè)-基因轉(zhuǎn)錄本和6 個(gè)轉(zhuǎn)錄本翻譯的氨基酸序列，在DNAMAN 軟件上分別進(jìn)行基因和氨基酸序列比對(duì)。

1.4 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

采用CTAB 法提取番茄基因組DNA（王關(guān)林 和方宏筠，2002）。PCR 反應(yīng)體系為20 μL：2.0 μL 的10 × PCR buffer、0.5 μL 的10 mmol·LdNTPs、1 μL 的10 μmol·L的Ty-5-f1 引物、1 μL 的10 μmol·L的Ty-5-f2 引 物、1 μL 的10 μmol·L的Ty-r引物、0.2 μL的DNA聚合酶、1.5 μL 的模板DNA 和12.8 μL 的ddHO。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，33 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.5 番茄材料功能標(biāo)記驗(yàn)證

將TySNP 功能標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，銀染完畢后，記錄帶型，感病雜合材料擴(kuò)增的片段大小為119 bp/114 bp，并與番茄表型抗病性進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

序列比對(duì)結(jié)果顯示（圖1），番茄材料LA0441、PI126926、PI126930、PI390681、TY172和M82 的-基因編碼區(qū)域的第47 位點(diǎn)處的堿基為T，使翻譯蛋白質(zhì)為纈氨酸（V），而番茄材料TY172 的-基因編碼區(qū)域的第47 位點(diǎn)處的堿基為G，使翻譯蛋白質(zhì)為甘氨酸（G），與Lapidot 等（2015）的研究結(jié)果一致。因此開發(fā)-基因表型變異的功能性突變位點(diǎn)（G/T）的功能標(biāo)記對(duì)番茄黃化曲葉病毒病抗病品種的分子選育具有重要應(yīng)用價(jià)值。

圖1 6 份番茄材料的ty-5 基因編碼序列（a）與氨基酸序列（b）片段的比對(duì)

2.2 ty-5 基因功能標(biāo)記的開發(fā)及檢測(cè)

本試驗(yàn)在-基因功能性SNP 突變位點(diǎn)（G/T）及所在的基因編碼序列上設(shè)計(jì)功能標(biāo)記的3 條引物：1 條公共的反向引物和2 條擴(kuò)增等位基因的正向引物，即TySNP-r 和TySNP-f1、TySNP-f2；并在-基因功能性SNP 突變位點(diǎn)（G/T）處的倒數(shù)第2 個(gè)或者第4 個(gè)堿基處進(jìn)行人為的錯(cuò)配，TySNP-f1 由G 錯(cuò)配為A；TySNP-f2 由G 錯(cuò)配為C（圖2-a）。

圖2 TySNP 功能標(biāo)記的開發(fā)和檢測(cè)

利用TySNP 功能標(biāo)記對(duì)抗病自交系t33-14 和感病自交系t2301 進(jìn)行基因型檢測(cè)。結(jié)果顯示（圖2-b），TySNP 功能標(biāo)記在抗病自交系t33-14 中擴(kuò)增的-基因片段大小為114 bp，與標(biāo)記設(shè)計(jì)的大小一致，表明該番茄材料-基因編碼區(qū)域的第47 位點(diǎn)處的堿基為G，-基因功能正常，具有對(duì)番茄黃化曲葉病毒病的抗性；感病自交系t2301 擴(kuò)增的-基因片段大小為119 bp，與標(biāo)記設(shè)計(jì)的大小一致，表明該番茄材料-基因編碼區(qū)域的第47 位點(diǎn)處的堿基為T，-基因編碼區(qū)域發(fā)生堿基替換，對(duì)番茄黃化曲葉病毒病由抗病變?yōu)楦胁　?/p>

2.3 ty-5 基因功能標(biāo)記的驗(yàn)證

利用本試驗(yàn)開發(fā)的功能標(biāo)記TySNP 對(duì)番茄黃化曲葉病毒病抗病自交系t33-14 與感病自交系t2301 及其雜交F分離群體后代株系進(jìn)行基因型鑒定（圖3），其中tf2-10、tf2-17 鑒定為抗病材料，tf2-4、tf2-7、tf2-8、tf2-15、tf2-16 為感病材料。將基因型與表型抗病性進(jìn)行相關(guān)性分析，可知功能標(biāo)記TySNP 抗病基因型有56 份，其中38 份表型鑒定為抗病，18 份為感??；功能標(biāo)記TySNP 感病基因型有96 份，其中83 份表型鑒定為感病，13 份為抗病?？傮w上看，152 份F分離群體中有121 份（80%）標(biāo)記基因型與表型一致，31 份（20%）與表型不一致。經(jīng)卡平方測(cè)驗(yàn)，χ=2.834 ＜χ=3.84。因此，功能標(biāo)記TySNP 對(duì)t33-14 × t2301 的F分離群體抗感病的相關(guān)性達(dá)到顯著水平（表1）。

表1 t33-14×t2301 的F2 分離群體功能標(biāo)記TySNP 基因型與抗病性的相關(guān)性分析

圖3 功能標(biāo)記TySNP 在父母本及部分F2 株系中的電泳檢測(cè)結(jié)果

2.4 利用ty-5 基因功能標(biāo)記對(duì)番茄黃化曲葉病毒病抗性的鑒定

對(duì)番茄黃化曲葉病毒病抗病自交系t33-14、感病自交系t2301 以及不同來(lái)源的26 份番茄材料田間（表型）調(diào)查結(jié)果和利用本試驗(yàn)開發(fā)的功能標(biāo)記TySNP 對(duì)番茄黃化曲葉病毒病抗性鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，自交系t33-14 表型鑒定結(jié)果為抗病，基因型跟表型吻合；自交系t2301 表型鑒定結(jié)果為感病，基因型跟表型吻合；AZC1、AZC2、AZC5、AZC6、AZC9、BZC1、BZC4、CZC12、DZC1、DZC3 和DZC5 擴(kuò)增的-基因片段大小跟番茄黃化曲葉病毒病抗病自交系t33-14 一致，片段長(zhǎng)度為114 bp，表明該12 份番茄材料為黃化曲葉病毒病抗病純合基因型，番茄黃化曲葉病毒病表型鑒定結(jié)果為抗病，基因型跟表型吻合；AZC4、AZC7、BZC5、BZC6、CZC13、CZC14、CZC15和DZC2 擴(kuò)增的-基因片段大小跟番茄黃化曲葉病毒病感病自交系t2301 一致，片段長(zhǎng)度為119 bp，表明該9 份番茄材料為黃化曲葉病毒病感病純合基因型，番茄黃化曲葉病毒病表型鑒定結(jié)果為感病，基因型跟表型吻合；由于-基因?qū)儆陔[性基因，AZC3、AZC8、BZC2、BZC3、CZC16、CZC17 和DZC4 擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為119 bp/114 bp，表明該7 份番茄材料為感病雜合基因型，番茄黃化曲葉病毒病表型鑒定結(jié)果中AZC3、AZC8、CZC16、CZC17 和DZC4 為感病，基因型跟表型吻合，而BZC2、BZC3 為抗病，表明材料可能含有除-以外的其他抗黃化曲葉病毒的抗性基因。因此，功能標(biāo)記TySNP 能夠準(zhǔn)確地區(qū)分番茄黃化曲葉病毒病抗病材料和感病材料的純合基因型以及感病雜合基因型，且不同的基因型跟表型能較好地對(duì)應(yīng)吻合。

表2 利用功能標(biāo)記TySNP 鑒定28 份番茄材料基因型及其與田間鑒定結(jié)果比較

3 結(jié)論與討論

分子標(biāo)記輔助選擇育種能有效提高對(duì)目的基因和性狀的選擇效率，開發(fā)抗番茄黃化曲葉病毒病基因-緊密連鎖的分子標(biāo)記可以加快番茄抗病育種進(jìn)程。近年來(lái)，相繼報(bào)道了抗性基因-的分子連鎖標(biāo)記被開發(fā)與利用，如姜靜等（2017）設(shè)計(jì)了-基因的分子連鎖標(biāo)記ty-5-17，可用于抗TYLCV 番茄品種的分子輔助育種，但是由于在遺傳過(guò)程中基因重組而導(dǎo)致重要遺傳信息的丟失及連鎖累贅的問(wèn)題，且容易受到環(huán)境條件的影響，很難在育種上得到應(yīng)用；姚祝平等（2015）設(shè)計(jì)了-基因的CAPS 標(biāo)記，但在檢測(cè)大批量基因型時(shí)，需要酶切，成本較高，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。相比于傳統(tǒng)的連鎖分子標(biāo)記和其他類型標(biāo)記，功能標(biāo)記是基于基因內(nèi)部序列變化引起表型變異的一種分子標(biāo)記，其和性狀完全連鎖，具有很大的優(yōu)越性，可直接利用而不需要對(duì)世代群體作圖，從而在一定程度上避免了由于遺傳過(guò)程中的基因重組而導(dǎo)致重要遺傳信息的丟失及連鎖累贅的問(wèn)題，功能標(biāo)記無(wú)需酶切，省時(shí)、省力、簡(jiǎn)單且節(jié)約成本（賀道華 等，2009）。

本試驗(yàn)針對(duì)-基因編碼序列的功能性SNP突變位點(diǎn)（G/T）（Lapidot et al.，2015）開發(fā)了1個(gè)功能標(biāo)記TySNP，并對(duì)番茄黃化曲葉病毒病抗病自交系t33-14、感病自交系t2301，及其雜交F株系和不同來(lái)源的26 份番茄材料進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果表明番茄黃化曲葉病毒病抗病自交系t33-14擴(kuò)增的-基因片段大小為114 bp，表型鑒定結(jié)果為抗病，基因型與表型吻合；感病自交系t2301 擴(kuò)增的-基因片段大小為119 bp，表型鑒定結(jié)果為感病，基因型與表型吻合。152 份F分離后代中有121 份（80%）標(biāo)記基因型與表型一致。經(jīng)卡平方測(cè)驗(yàn)，功能標(biāo)記TySNP 與t33-14 × t2301 的F分離群體抗感病的相關(guān)性達(dá)到顯著水平。

不同來(lái)源的26 份番茄材料中，11 份番茄材料為黃化曲葉病毒病抗病純合基因型，表型鑒定結(jié)果為抗病，基因型與表型吻合；8 份番茄材料擴(kuò)增的-基因片段大小與感病自交系t2301 一致，片段長(zhǎng)度為119 bp，為番茄黃化曲葉病毒病感病純合基因型，表型鑒定結(jié)果為感病，基因型與表型吻合；由于-基因?qū)儆陔[性基因，7 份番茄材料擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為119 bp/114 bp，為感病雜合基因型，表型鑒定結(jié)果中AZC3、AZC8、CZC16、CZC17和DZC4 為感病，基因型跟表型吻合，而BZC2、BZC3 為抗病，表明材料可能含有除-以外的其他抗TYLCV 的抗性基因。

綜上所敘，功能標(biāo)記TySNP 能準(zhǔn)確地區(qū)分和鑒定育種親本以及雜交后代群體的番茄黃化曲葉病毒病抗病材料純合基因型、感病材料純合基因型以及感病雜合基因型，且不同的基因型跟表型能較好對(duì)應(yīng)吻合，可對(duì)雜交后代進(jìn)行有效選擇，為定向改良番茄品種黃化曲葉病毒病的抗性提供分子標(biāo)記輔助育種手段。