黃曲霉菌感染小鼠角膜動(dòng)物模型的建立及組織病理學(xué)變化*

張偉宏，蔣莉莉，汪曉凱，趙秋民，楊東斌，黃貫峰，張煥云，楊　陽(yáng)，梁　芳，韓　雷，吳細(xì)丕

1)鄭州大學(xué)護(hù)理學(xué)院 鄭州 450001　2) 鶴壁市人民醫(yī)院 鶴壁 458030　3) 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部 鄭州 450001　4)鄭州大學(xué)附屬中心醫(yī)院 鄭州 450052　5)河南省眼科研究所 鄭州 450003

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黃曲霉菌感染小鼠角膜動(dòng)物模型的建立及組織病理學(xué)變化*

張偉宏1，2)，蔣莉莉1)，汪曉凱1)，趙秋民3)，楊東斌2)#，黃貫峰2)，張煥云2)，楊陽(yáng)2)，梁芳4)，韓雷5)，吳細(xì)丕5)

1)鄭州大學(xué)護(hù)理學(xué)院 鄭州 4500012) 鶴壁市人民醫(yī)院 鶴壁 4580303) 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部 鄭州 4500014)鄭州大學(xué)附屬中心醫(yī)院 鄭州 4500525)河南省眼科研究所 鄭州 450003

關(guān)鍵詞角膜炎；黃曲霉菌；小鼠

摘要目的：建立黃曲霉菌感染小鼠角膜動(dòng)物模型，并觀察病變后不同時(shí)期角膜組織病理學(xué)變化。方法：用培養(yǎng)接種棒對(duì)40只C57BL/6小鼠進(jìn)行仿真臨床角膜劃痕導(dǎo)致真菌感染。在第1、3、5、7和14天行裂隙燈顯微鏡檢查評(píng)分，隨后處死小鼠制作角膜鋪片，免疫熒光染色后進(jìn)行激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果：術(shù)后第1、3和5天，接種眼臨床評(píng)分升高迅速，在第5天達(dá)到峰值，隨后第7和14天臨床評(píng)分逐漸降低；術(shù)后第1天接種眼角膜緣組織已有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、角膜鞏膜緣血管擴(kuò)張充血等明顯急性炎癥變化，第3天角膜鞏膜緣出現(xiàn)新生血管芽，中性粒細(xì)胞向角膜中央潰瘍?cè)罱?rùn)、聚集，第5天中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)一步加重，見(jiàn)侵入角膜基質(zhì)層放射狀生長(zhǎng)的新生血管，第7天中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)仍較嚴(yán)重，新生血管向角膜中央潰瘍?cè)钌L(zhǎng)明顯，管腔增粗，第14天中性粒細(xì)胞明顯減少，新生血管萎縮、減少。結(jié)論：成功建立黃曲霉菌角膜炎小鼠動(dòng)物模型；感染第5天可能是角膜炎癥過(guò)程中的關(guān)鍵時(shí)間窗。

AbstractAim: To establish an effective mouse model of simulated clinical corneal fungal infections and observe the pathological changes of corneal tissue lesions after different periods of fungal keratitis.Methods: Forty C57BL/6 mice models were inoculated with a culture stick simulated clinical corneal scratches which caused fungal infections.On the 1st,3rd, 5th,7th and 14th day, infectious corneas were observed and given clinical scoring by slit-lamp biomicroscope，and then the mice were killed to make corneal stretched preparation. After immunofluorescence staining, the corneal tissue were observed with laser scanning confocal microscope. Results: The clinical scoring increased sharply on the 1st,3rd and 5th day after inoculation and peaked on the 5th day, then decreased on the 7th and 14th days. On the 1st day,the eye limbal tissue had neutrophil infiltration,corneal limbal vascular dilatation and congestion and other significant acute inflammatory changes.On the 3rd day,there were limbal corneal neovascularization buds, and neutrophil infiltration to gather corneal ulcer lesions. On the 5th day neutrophil infiltration further aggravated and invasive corneal stroma radial growth of new blood vessels could be seen. On the 7th day neutrophil infiltration was still severe, neovascularization obvious grew to the central cornea ulcer lesions,and luminal enlargement could be found on the 14th day neutropenia decreased significantly, and neovascularization atrophy reduced. Conclusion: An animal model of aspergillus keratitis has been successfully established. The key time window is the 5th day during the inflammation process of fungal keratitis.

角膜外傷尤其是植物性外傷引發(fā)的真菌性角膜炎是一種嚴(yán)重致盲性眼病。中國(guó)是真菌性角膜炎發(fā)病大國(guó)，致病真菌以鐮刀菌和曲霉菌為主[1-2]。近年來(lái)，真菌性角膜炎發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)，由于缺少理想的動(dòng)物模型，導(dǎo)致真菌性角膜炎發(fā)病機(jī)制的研究相對(duì)滯后。盡管以往研究[3-5]中有通過(guò)角膜基質(zhì)注射法、角膜接觸鏡法及免疫抑制法等建立真菌性角膜炎動(dòng)物模型的報(bào)道，但因其不符合真菌性角膜炎的自然發(fā)病過(guò)程而制約該病發(fā)病機(jī)制的研究。已有研究[6-7]表明：白細(xì)胞尤其中性粒細(xì)胞作為機(jī)體內(nèi)初始免疫活性細(xì)胞，能迅速吞噬、消滅入侵的病原微生物。但是中性粒細(xì)胞向感染部位的遷徙是一把雙刃劍，過(guò)度的浸潤(rùn)常造成炎癥組織的損傷甚至破壞。因此，該實(shí)驗(yàn)擬模擬臨床角膜外傷建立近似自然真菌感染小鼠角膜動(dòng)物模型，并對(duì)其病變過(guò)程及真菌感染后不同時(shí)期小鼠角膜中性粒細(xì)胞和新生血管等病理學(xué)變化進(jìn)行觀察。

1材料與方法

1.1材料40只體重17~20 g雌性C57BL/6純系小鼠，6～8周齡，健康無(wú)眼疾(河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK豫2005-0001)；動(dòng)物的飼養(yǎng)與使用均按照科研動(dòng)物使用規(guī)范進(jìn)行。中國(guó)真菌菌種保藏中心提供黃曲霉菌(編號(hào)：3.2758)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的Gr-1抗中性粒細(xì)胞抗體和PE標(biāo)記的CD31血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體(美國(guó)Baylor醫(yī)學(xué)院李志杰教授惠贈(zèng))。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1真菌菌種制備將標(biāo)準(zhǔn)菌種溶于生理鹽水，轉(zhuǎn)接在新鮮的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基斜面上孵育，連續(xù)轉(zhuǎn)接2次培養(yǎng)。28 ℃培養(yǎng)3 d后，將已滅菌的接種棒置于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基斜面上28 ℃培養(yǎng)3 d。

1.2.2動(dòng)物模型的制作40只C57BL/6純系小鼠左眼設(shè)為手術(shù)對(duì)照，右眼接種黃曲霉菌。妥布霉素點(diǎn)眼，3次/d，持續(xù)3 d后小鼠腹腔內(nèi)注射2 g/L戊巴比妥鈉溶液行全身麻醉(劑量為20 mL/kg)，利多卡因點(diǎn)眼表面麻醉，然后用5 mg/L慶大霉素溶液沖洗右眼結(jié)膜囊，常規(guī)消毒鋪巾，眼科手術(shù)用顯微鏡下，2 mm環(huán)鉆在角膜中央用亞甲藍(lán)標(biāo)記定位后，取已培養(yǎng)好的接種棒在定位的區(qū)域內(nèi)作“*”形劃痕，深度為破壞角膜上皮到達(dá)淺基質(zhì)層，結(jié)膜囊內(nèi)涂抹紅霉素眼膏，3-0絲線縫合上下眼瞼。對(duì)照眼用已滅菌未培養(yǎng)的接種棒劃痕接種，余同模型眼。術(shù)后妥布霉素點(diǎn)眼，3次/d。造模后隨機(jī)分為第1、3、5、7和14天組，每組8只。

1.2.3真菌感染角膜的臨床評(píng)分相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)每組小鼠進(jìn)行裂隙燈顯微鏡檢查，參照Hiraoka等[8]制定的評(píng)分系統(tǒng)對(duì)感染眼進(jìn)行綜合盲評(píng)。①角膜潰瘍范圍：病灶直徑<2 mm評(píng)為1分，≥2 mm但未累及全角膜評(píng)為2分，病灶累及全角膜評(píng)為3分。②角膜混濁度：輕度角膜水腫評(píng)為1分，角膜水腫大于50%評(píng)為2分，全角膜混濁評(píng)為3分。③角膜新生血管形成：角膜鞏膜緣少量新生血管形成評(píng)為1分，新生血管向角膜中央生長(zhǎng)小于50%區(qū)域評(píng)為2分，新生血管向角膜中央生長(zhǎng)大于50%區(qū)域評(píng)為3分。④前房積膿：前房?jī)?nèi)少量灰白色膿性滲出評(píng)為1分，前房積膿可看到液平、但未連接角膜病灶部位評(píng)為2分，前房積膿連接角膜病灶部位或出現(xiàn)連接角膜病灶的內(nèi)皮斑評(píng)為3分。有下列癥狀的加上相應(yīng)的得分：后彈力膜膨出加1分，角膜穿孔加1分，眼前房出血加1分，虹膜炎加1分。感染的嚴(yán)重程度以每只眼的總得分作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4角膜刮片及真菌培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)每組小鼠行角膜刮片，行KOH濕片與Giemsa染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察；并在小鼠角膜病灶部位鉗取少量組織，采用新鮮的薩氏培養(yǎng)基進(jìn)行接種。

1.3角膜組織中性粒細(xì)胞和新生血管的免疫熒光染色檢測(cè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別處死每組小鼠，取眼球，在眼球赤道用手術(shù)刀穿透性切取帶角膜緣的眼前節(jié)后，置于新鮮配制的PBS中進(jìn)行虹膜的剝離；已分離干凈的眼前節(jié)組織置于10 g/L多聚甲醛-PBS溶液中固定30 min后，使用PBS對(duì)已固定組織漂洗3次；漂洗干凈的組織在20 g/L BSA-PBS溶液中浸泡15 min，然后用體積分?jǐn)?shù)2%的Triton X-100-PBS溶液對(duì)其透膜15 min；最后將組織置于抗Gr-1單克隆熒光抗體和CD31血管內(nèi)皮細(xì)胞熒光抗體液中(均按1200稀釋)，4 ℃冰箱內(nèi)避光孵育過(guò)夜后使用PBS漂洗未結(jié)合抗體3次；手術(shù)刀放射狀切開(kāi)后平鋪于載玻片上，使用膠水固定，蓋玻片壓平，常溫避光過(guò)夜[9-10]；將載玻片放入觀察區(qū)域，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察中性粒細(xì)胞和新生血管的變化。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)接種眼臨床評(píng)分結(jié)果的比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1裂隙燈顯微鏡下臨床表現(xiàn)及臨床評(píng)分小鼠接種眼全部形成真菌性角膜炎。接種后第1天可見(jiàn)角膜水腫混濁，表面粗糙不平，角膜鞏膜緣血管擴(kuò)張充血。第3天整個(gè)角膜呈現(xiàn)灰白色混濁，其中央部位有灰白色菌絲苔覆蓋的浸潤(rùn)潰瘍病灶，角膜鞏膜緣血管充血減輕，有新生血管出現(xiàn)。第5天真菌感染角膜炎癥達(dá)到峰值，角膜中央出現(xiàn)后彈力膜的膨出率為50%，角膜穿孔率為21%；角膜鞏膜緣出現(xiàn)明顯的向心性生長(zhǎng)的新生血管以及前房積膿。第7天病灶化膿壞死逐漸減少，潰瘍壞死區(qū)出現(xiàn)肉芽組織，潰瘍病灶逐漸縮小，放射狀向心性生長(zhǎng)的新生血管接近病灶區(qū)。第14天角膜中央病灶已經(jīng)瘢痕修復(fù)，深入到病灶的新生血管已逐漸退化。病灶周?chē)悄そM織恢復(fù)正常。在上述時(shí)間點(diǎn)對(duì)接種眼進(jìn)行臨床評(píng)分，造模后第1、3、5天臨床評(píng)分升高迅速，在第5天達(dá)到峰值(圖1)，然后逐漸降低，評(píng)分分別為4.38±1.30、7.13±0.99、10.13±1.36、8.63±1.19和2.38±0.92；不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)臨床評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.475，P<0.001)。對(duì)照眼第1天角膜組織已基本恢復(fù)正常。

圖1　黃曲霉菌感染后小鼠角膜裂隙燈顯微鏡檢查結(jié)果

A：接種后第3天，評(píng)分為7分；B：接種后第5天，評(píng)分為11分；C：接種后第7天，評(píng)分為9分。

2.2角膜刮片檢查和真菌培養(yǎng)情況接種后第1、3、5、7和14天角膜刮片行KOH濕片和Giemsa染色。接種眼KOH濕片顯微鏡下可看到明顯的菌絲及孢子；Giemsa染色鏡下可見(jiàn)明顯菌絲，并且沒(méi)有觀察到細(xì)菌。真菌培養(yǎng)見(jiàn)相應(yīng)菌屬菌落且鑒定為所接種菌種(圖2)。在第1和3天，KOH濕片、Giemsa染色和真菌培養(yǎng)陽(yáng)性率未見(jiàn)明顯差異，隨后第5、7、14天各時(shí)間點(diǎn)角膜刮片檢查和真菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率逐漸降低(表1)。對(duì)照眼未見(jiàn)病原菌感染。

圖2　接種眼角膜刮片檢查和真菌培養(yǎng)結(jié)果

表1　接種眼角膜刮片KOH濕片、

2.3角膜組織中中性粒細(xì)胞和新生血管觀察結(jié)果

見(jiàn)圖3。造模后第1天接種眼角膜緣組織已有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、角膜鞏膜緣血管擴(kuò)張充血等明顯急性炎癥變化；第3天角膜鞏膜緣出現(xiàn)呈毛刺狀新生血管芽，大量中性粒細(xì)胞向角膜中央潰瘍?cè)罱?rùn)聚集；第5天中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)一步加重，見(jiàn)侵入角膜基質(zhì)層放射狀生長(zhǎng)的新生血管；第7天中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)仍然較重，新生血管向角膜中央潰瘍?cè)钌L(zhǎng)明顯，管腔增粗；第14天中性粒細(xì)胞明顯減少，新生血管萎縮、減少。對(duì)照眼第1天在角膜鞏膜緣可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞散在分布，但未見(jiàn)新生血管的形成。A：接種后第3天，角膜鞏膜緣向心性生長(zhǎng)的新生血管以及新生血管周?chē)拭虪畹男律苎?×400)；B：接種后第5天，向角膜中央病灶遷移的大量中性粒細(xì)胞以及病灶部位密布尚有輪廓的中性粒細(xì)胞(×200)；C：接種后第7天，角膜鞏膜緣向心性生長(zhǎng)粗大的新生血管以及從角膜鞏膜緣向角膜中央遷移的大量中性粒細(xì)胞(×200)。

圖3　接種眼角膜平鋪片激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果

3討論

真菌性角膜病是嚴(yán)重致盲性眼病之一。調(diào)查結(jié)果[2]顯示，近年來(lái)，該病在我國(guó)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。由于治療效果較差，致盲及致殘率居高不下[11]。目前，研究者已經(jīng)認(rèn)識(shí)到真菌性角膜炎的發(fā)生主要由外傷(植物性占多數(shù))、角膜手術(shù)、配戴接觸鏡和異物等原因造成角膜上皮組織的損傷和缺損，真菌可通過(guò)損傷和缺損部位侵入到角膜內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，引起角膜組織的壞死以及炎癥反應(yīng)；但由于缺乏重復(fù)性及敏感性良好的哺乳動(dòng)物模型，導(dǎo)致對(duì)該病的深入研究比較欠缺，許多基礎(chǔ)研究以及應(yīng)用基礎(chǔ)研究尚屬空白。建立理想的模擬人角膜真菌感染的動(dòng)物模型已成為眼科基礎(chǔ)及臨床研究亟待解決的首要課題。

目前動(dòng)物模型制作多采用兔或大鼠，均是非近交系動(dòng)物；但近交系動(dòng)物遺傳的均質(zhì)性和反應(yīng)的一致性能使實(shí)驗(yàn)結(jié)果精準(zhǔn)可靠，有利于真菌性角膜炎免疫學(xué)及分子水平的研究[12]，故該實(shí)驗(yàn)選擇近交系C57BL/6小鼠建立動(dòng)物模型。作者制作動(dòng)物模型時(shí)用接種棒劃破小鼠角膜上皮組織，仿真臨床患者角膜的真菌感染自然過(guò)程，且不需應(yīng)用免疫抑制劑，成功制作小鼠動(dòng)物模型。用2 mm環(huán)鉆進(jìn)行角膜中央定位，使病變部位與周?chē)M織對(duì)比明顯，易于觀察；用在真菌中培養(yǎng)的接種棒劃痕模仿人角膜真菌感染的植物性外傷；接種后縫合眼瞼，給接種真菌提供適宜生長(zhǎng)的溫度與濕度，且能減少淚液及瞬目對(duì)真菌的沖刷，為真菌黏附創(chuàng)建有利環(huán)境，并能避免環(huán)境污染，這些環(huán)節(jié)能有效提高模型的成功率。在角膜真菌感染過(guò)程中，角膜局部的免疫功能非常重要，但對(duì)機(jī)體進(jìn)行免疫抑制會(huì)嚴(yán)重影響真菌性角膜炎的病程及炎癥發(fā)展過(guò)程。與現(xiàn)有的動(dòng)物模型相比，該研究制作的動(dòng)物模型不需要對(duì)小鼠應(yīng)用免疫抑制劑，真菌感染從角膜上皮破損面開(kāi)始，真正仿真臨床上真菌性角膜炎自然感染的過(guò)程，并且制作成功率高。模型判定時(shí)間點(diǎn)選擇在中期以前進(jìn)行，鈣熒光白染色、Giemsa染色和真菌培養(yǎng)同時(shí)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中該模型臨床表現(xiàn)和模型檢測(cè)結(jié)果顯示成功率為100%，為研究真菌性角膜炎病變發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。該研究結(jié)果顯示了造模后由淺入深發(fā)展的自然病變進(jìn)程，展現(xiàn)了真菌性角膜炎典型的臨床癥狀，并經(jīng)裂隙燈顯微鏡臨床檢查評(píng)分、角膜刮片及真菌培養(yǎng)證實(shí)了模型的穩(wěn)定性和可靠性。但接種后縫合小鼠眼瞼與臨床真菌性角膜炎患者感染過(guò)程還存在差異，還需在接種方法上進(jìn)一步改進(jìn)。

在角膜建立真菌感染的前提是角膜存在上皮層的損傷和缺損，同時(shí)伴有真菌孢子或菌絲的種植。針對(duì)創(chuàng)傷的反應(yīng)，首先進(jìn)入感染角膜的炎癥細(xì)胞是中性粒細(xì)胞[12-13]，它與臨床上最常見(jiàn)的炎癥性疾病發(fā)生與發(fā)展的細(xì)胞機(jī)制和分子機(jī)制關(guān)系密切，其功能和數(shù)量以及生存周期嚴(yán)重影響炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。角膜感染或創(chuàng)傷后形成的新生血管可導(dǎo)致視力顯著下降，造成角膜疤痕，改變角膜的局部免疫狀況，是角膜感染或創(chuàng)傷后最常見(jiàn)的特征之一[14-16]。該實(shí)驗(yàn)利用角膜平鋪片技術(shù)在激光掃描共聚焦顯微鏡下，從角膜上皮層開(kāi)始一直到內(nèi)皮細(xì)胞層逐層觀察了接種眼不同時(shí)期的中性粒細(xì)胞和新生血管變化，清楚地觀察到中性粒細(xì)胞作為非常重要的初始免疫細(xì)胞向角膜中央潰瘍?cè)顒?dòng)態(tài)遷移的過(guò)程，最終在病灶聚集、死亡；同時(shí)也觀察到新生血管在炎癥反應(yīng)中的發(fā)生以及向病灶發(fā)展的過(guò)程，這與裂隙燈顯微鏡下相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的臨床檢查及臨床評(píng)分結(jié)果相符。上述結(jié)果也表明，在黃曲霉菌感染小鼠角膜的炎癥反應(yīng)和角膜組織破壞過(guò)程中，第5天是關(guān)鍵的時(shí)間窗；在時(shí)間窗前募集而來(lái)的中性粒細(xì)胞對(duì)于阻止微生物感染起著極其重要的作用，在時(shí)間窗后募集以及先前聚集的中性粒細(xì)胞在角膜真菌感染后炎癥病灶的組織破壞中起關(guān)鍵作用。由此說(shuō)明中性粒細(xì)胞向感染部位的遷徙是一把雙刃劍，大量浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞造成角膜炎癥組織的損傷甚至破壞。但病變部位募集的中性粒細(xì)胞的作用機(jī)制，以及它與真菌感染、組織破壞之間的關(guān)系是研究者需要深入探索的重點(diǎn)。

綜上所述，不需要對(duì)宿主進(jìn)行免疫抑制，用接種棒破壞角膜表面上皮組織，即可成功建立仿真臨床真菌性角膜炎自然感染過(guò)程的小鼠模型。

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*河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才工程項(xiàng)目4120；河南省醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)帶頭人出國(guó)培訓(xùn)計(jì)劃項(xiàng)目201201053；河南省科技創(chuàng)新杰出人才計(jì)劃資助項(xiàng)目104200510007；河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才工程科技領(lǐng)軍人才基金20100304

Establishment of mouse aspergillus keratitis model and changes of mouse corneal histopathology

ZHANGWeihong1，2),JIANGLili1),WANGXiaokai1),ZHAOQiumin3),YANGDongbin2)，HUANGGuanfeng2),ZHANGHuanyun2),YANGYang2),LIANGFang4),HANLei5),WUXipi5)

1)SchoolofNursing，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)ThePeople’sHospitalofHebiCity,Hebi4580303)EditorialBoardofJournalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500014)TheAffiliatedZhengzhouCentralHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500525)InstituteofOphthalmologyofHenanProvince,Zhengzhou450003

Key wordskeratitis；aspergillus；mouse

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.024

中圖分類(lèi)號(hào)R772.21

通信作者#，男，1974年2月生，博士，在站博士后，研究方向：慢性病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail：dongbinyang@126.com