微波輻射下槲皮素硅膠表面印跡聚合物的制備及其吸附性能分析*

微波輻射下槲皮素硅膠表面印跡聚合物的制備及其吸附性能分析*

★丁妍華*劉文琴白文婷謝一輝*

(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院南昌 330004)

摘要：目的：微波輻射下制備槲皮素硅膠表面印跡聚合物,并考察其吸附性能。方法：以槲皮素為模板分子，KH-570為硅烷化試劑，微波輔助條件下在硅膠表面合成了分子印跡聚合物。用正交試驗優(yōu)化了硅膠表面改性以及硅膠表面分子印跡的制備工藝。結(jié)合高效液相色譜法對制備得到的分子印跡聚合物特異性吸附進行驗證。結(jié)果：利用微波輻射將反應(yīng)時間縮短了十幾倍。Scatchard模型分析得到其平衡常數(shù)Kd=4.44mg/L，最大吸附量Qmax=2.87μmol/g。結(jié)論：確定了微波輻射下硅膠表面分子印記聚合物的制備工藝，吸附性能良好。

關(guān)鍵詞：表面分子印跡聚合物；槲皮素；微波輔助；正交試驗

經(jīng)典的植化分離分析模式需要多次過柱，耗費大量的時間以及人力物力。分子印跡聚合物(Molecular Imprinted Polymers，MIPs )具有與模板分子相匹配的空穴和由功能單體形成的特定識別位點[1],能夠特異性的吸附模板分子，而且環(huán)境適應(yīng)能力強、穩(wěn)定性好、可重復(fù)使用、靈敏度高[2]，廣泛應(yīng)用于固相萃取、傳感器、色譜、模擬酶催化等領(lǐng)域[3]，在中藥有效成分分離富集方面優(yōu)勢顯著。本課題組在商品硅膠表面進行印跡，其顆粒大，可作為中壓柱的固定相，目標(biāo)成分與母液可實現(xiàn)快速分離。本研究以覆盆子乙酸乙酯部位的有效成分槲皮素為模板分子，重點考察了微波輔助下硅膠表面硅烷化以及表面印跡的制備工藝，探索出硅膠表面印跡聚合物的制備方法。

1儀器和試劑

4-乙烯吡啶，乙二醇二甲基丙烯酸甲酯，硅烷偶聯(lián)劑KH-570(均購自阿拉丁試劑有限公司)；偶氮二異丁腈(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；硅膠(300~400目)(青島鼎康硅膠有限公司)；甲醇乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純。

槲皮素對照品(自制，純度為99.11%)。Agilent 1260 高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；微波萃取儀(上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)；Sartorius BS214-D天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；KQ3200超聲波清洗器(昆山超聲儀器廠)；自動三重蒸餾水器(上海亞榮生化儀器有限公司)；FT-IR Spectrometer(Spectrum Two PerkinElmer UATR Two)；UV-1750紫外分光光度計(島津科技有限公司)。

2方法

2.1硅膠酸活化300~400目硅膠200g過篩，選取粒徑40μm左右的硅膠，加入50%(V/V)的硝酸回流6h，冷卻靜置，用蒸餾水洗滌至中性，自然沉降12h，加入50%(V/V)的濃鹽酸，室溫浸泡6h，蒸餾水洗至中性，硝酸銀溶液檢驗后無氯離子，80℃真空干燥12h，保存于棕色試劑瓶中備用。

2.2硅膠表面硅烷化以硅膠表面硅烷化的得率為指標(biāo)，考察微波時間、KH-570用量和合成溫度對硅烷化實驗的影響。

取酸活化后的硅膠16份，每份50g，按表1條件，依次加入無水甲苯250mL，一定量的KH-570，置于微波萃取儀中，三頸燒瓶上方分別連接冷凝管，裝有攪拌棒的玻璃管，氮氣管路。設(shè)置溫度為規(guī)定溫度，以300r/min速度攪拌，氮氣保護下，用100w微波功率加熱回流至規(guī)定時間。抽濾，轉(zhuǎn)入索氏提取器中用無水乙醇抽提12h洗去雜質(zhì)。于80℃真空干燥12h，得到KH-570硅烷化硅膠。

表1　硅膠表面硅烷化正交試驗條件

2.3槲皮素硅膠表面印跡聚合物制備結(jié)合覆盆子乙酸乙酯部位的指紋圖譜，以槲皮素硅膠表面印跡聚合物特異性吸附槲皮素等黃酮類成分的量為優(yōu)化指標(biāo)，考察微波時間，乙二醇二甲基丙烯酸酯用量，4-乙烯吡啶用量，致孔劑氯仿用量，甲醇用量對槲皮素硅膠表面印跡聚合物合成效果的影響。

取3.2中表面硅烷化的硅膠16份，每份5g，分別加入槲皮素的丙酮溶液10mL(4 mg/mL)，充分?jǐn)嚢?，按?條件分別加入4-乙烯基吡啶氯仿溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯氯仿溶液、偶氮二異丁腈甲苯溶液3mL(13.5 mg/mL)、甲醇，用30mL四氯化碳轉(zhuǎn)移至三頸燒瓶。設(shè)置微波萃取儀功率100W，溫度60℃加熱回流至規(guī)定時間，無水乙醇洗滌數(shù)次，濾過，轉(zhuǎn)入索氏提取器中，甲醇乙酸(9∶1)抽提模板分子，直至抽提液在200~400nm范圍內(nèi)紫外吸收均小于0.01。 再用甲醇洗至中性，80℃真空干燥即得到槲皮素硅膠表面印跡聚合物。

表2　槲皮素分子印跡聚合物正交試驗條件

2.4樣品制備取覆盆子乙酸乙酯提取浸膏0.3g，加乙醇13mL溶解，加入1.75g槲皮素硅膠表面印跡聚合物，振搖1h。轉(zhuǎn)入色譜柱中，分別用17.5mL三蒸水、17.5mL 30%甲醇洗滌，再用27.5mL色譜甲醇洗脫。甲醇洗脫液氮吹水浴蒸干，加甲醇定容至2mL。

2.5紫外測定取最后的抽提液，以甲醇乙酸(9∶1)為空白對照液，在200~400nm范圍內(nèi)紫外掃描，記錄紫外吸收。

2.6紅外測定取過篩后的硅膠和槲皮素硅膠表面印跡聚合物分別進行紅外測定。

2.7HPLC法測定色譜條件：迪馬C18色譜柱，流動相為乙腈(A)∶0.1%甲酸溶液(B):(0~70min，A 3%~22%；70~90min，A 22%~30%；90~105min,A 30%~45%；105~115min，A 45%~100%)，檢測波長266nm，柱溫30℃，流速1mL/min，進樣量20μL。

2.8吸附性能測試取濃度分別為0.5,1,1.5,2,2.5mg/100mL的槲皮素乙腈溶液各100mL，精密稱取1.00g印跡聚合物5份分別混懸于上述槲皮素乙腈溶液中，室溫下混懸1h后靜置，取上清液373nm處測定吸光度。靜態(tài)飽和吸附量公式為Qe=(C0-Ce)V/M，其中Qe為吸附量(mg/g)即每克印跡聚合物吸附槲皮素的量；C0、Ce(mg/mL)分別為吸附前后槲皮素溶液的濃度，V(mL)為溶液的體積；M(g)為加入印跡聚合物的質(zhì)量。

根據(jù)Scatchard方程Q/Ce=(Qmax-Q)/Kd推算出結(jié)合平衡常數(shù)Kd及最大吸附量Qmax。式中Q和Qmax分別為平衡吸附量和最大吸附量，Ce為平衡時溶液中槲皮素的濃度；Kd為平衡時結(jié)合位點的平衡解離常數(shù)，以Q/Ce對Q作圖，公式轉(zhuǎn)換成Q/Ce= (-1/Kd)Q+Qmax/Kd，根據(jù)線性關(guān)系斜率和截距可以求得Kd和Qmax兩個參數(shù)。

3結(jié)果和討論

3.1硅膠表面硅烷化實驗結(jié)果分析以硅烷化后增加的重量除以加入的硅烷化試劑量為得率，計算各實驗條件下產(chǎn)物得率。結(jié)果見表3。實驗結(jié)果用SPSS19.0分析，結(jié)果見表4。由表4可知，考察的3個因素中，微波輔助時間和硅烷化試劑用量有顯著性差異，反應(yīng)溫度沒有顯著性差異。影響因素順序為：微波反應(yīng)時間>硅烷化試劑用量>反應(yīng)溫度。各因素水平均值顯示最佳條件為：微波輔助時間2h，硅烷化試劑用量20mg，反應(yīng)溫度95℃。以該條件重復(fù)合成3次，得率分別為：89.02%、88.08%和88.37%。

表3　硅膠表面硅烷化正交試驗結(jié)果

表4　正交試驗各因素顯著性分析結(jié)果

3.2FT-IR結(jié)果圖1虛線部分放大后顯示，硅烷化硅膠：在1635.52 cm-1處有一吸收峰，為硅烷化支鏈上烯烴的碳碳雙鍵伸縮振動吸收。在1059.43 cm-1處硅烷化硅膠和槲皮素硅膠表面印跡聚合物均有的硅氧鍵伸縮振動吸收峰。槲皮素硅膠表面印跡聚合物在1717.25 cm-1有羰基吸收峰，為交聯(lián)劑分子中的酯鍵。MIPs中1637.30 cm-1吸收峰較硅烷硅膠的1635.05 cm-1明顯減小，幾乎不可見，說明硅烷化硅膠的雙鍵與功能單體及交聯(lián)劑中的雙鍵已基本聚合。而且聚合后形成的脂肪鏈的碳?xì)涿鎯?nèi)彎曲振動吸收在MIPs圖譜中可見于1454.05 cm-1。MIPs中754.50 cm-1和666.72 cm-1雙峰，為苯環(huán)單取代吸收峰，說明功能單體4-乙烯吡啶已聚合于MIPs分子中。上述紅外光譜提示槲皮素硅膠表面印跡聚合物合成成功。

圖1　紅外圖譜對比

3.3HPLC分離效果取條件優(yōu)化實驗中所得每份槲皮素硅膠表面印跡聚合物，分別按2.4樣品制備方法分離覆盆子乙酸乙酯提取液中槲皮素，各洗脫液分別按指紋圖譜條件進行分析。結(jié)果顯示(圖2)：槲皮素硅膠表面印跡聚合物能有效地從覆盆子乙酸乙酯提取液中分離出槲皮素。同時被分離的少量其它成分，經(jīng)檢測初步鑒定為黃酮類成分。

3.4槲皮素硅膠表面印跡聚合物正交實驗的結(jié)果與分析根據(jù)指紋圖譜分析結(jié)果，分別累計黃酮類成分的峰面積，作為槲皮素硅膠表面印跡聚合物吸附黃酮成分總量。以黃酮成分總量為優(yōu)化指標(biāo)，用SPSS19.0進行分析。分析結(jié)果(表5-6)顯示：考察的各因素均有非常顯著的差異，影響因素順序為：甲醇用量>氯仿用量>4-乙烯吡啶>交聯(lián)劑>反應(yīng)時間。各因素水平均值顯示最佳條件為：甲醇用量1 mL，氯仿用量6mL，4-乙烯吡啶28mg，交聯(lián)劑23.6mg，微波輔助時間1.5h。以最優(yōu)條件合成槲皮素硅膠表面印跡聚合物，按樣品分離方法分離覆盆子乙酸乙酯提取液中黃酮類成分，經(jīng)HPLC檢測，峰面積分別為837.428, 798.584, 853.938，表明該工藝基本穩(wěn)定。

圖2　槲皮素印跡聚合物分離效果指紋圖譜比較

編號面積1面積2面積3編號面積1面積2面積31708.939739.477751.6849613.425668.866672.6382543.938537.879557.20910570.778572.593573.7423498.584504.71472.95411837.428859.191851.7524774.546776.989777.39812751.149818.31824.135671.16642.341663.38813774.199782.006783.9476702.739698.561714.13514383.647849.346846.2077766.595774.481774.06615724.244687.383764.3288501.898503.66504.58716619.095621.923679.221

表6　正交實驗各因素顯著性分析結(jié)果

3.5吸附性能分析根據(jù)2.8實驗步驟得出吸附等溫線見圖3，線性關(guān)系良好。Scatchard分析圖見圖4。由圖4可見，槲皮素硅膠表面印跡聚合物的Scatchard吸附曲線基本上是一條直線，表明在該濃度范圍內(nèi)硅膠表面印跡聚合物對模板分子槲皮素存在特異的結(jié)合位點。線性方程為：Y=-0.2251X+0.1953,r=0.9992。根據(jù)方程可以算出平衡解離常數(shù)Kd=4.44mg/L 最大吸附量Qmax=2.87μmol/g。

圖3　吸附等溫線圖

圖4　Scatchard分析曲線圖

4結(jié)論

聚合反應(yīng)中，微波輻射大大縮短了反應(yīng)時間，提高了反應(yīng)效率，為工業(yè)化生產(chǎn)進行了有益探索。微

波輔助的非熱效應(yīng)可有效的降低有機化合物反應(yīng)的溫度。一般硅膠表面硅烷化需要在較高的溫度進行。該研究表明，溫度對硅烷化效率無顯著性影響，而且溫度在95℃最佳。這可能是微波改變了反應(yīng)動力學(xué)，降低了反應(yīng)活化能即微波輔助的非熱效應(yīng)所致。前期沒有微波輻射下的硅膠表面改性以及表面印跡實驗往往需要反應(yīng)12 h以上，尤其硅烷化實驗需要油浴110℃加熱才能完成，最大吸附量也只達到0.6μmol/g，微波輻射大大縮短了反應(yīng)時間，使最佳制備工藝的考察成為可能。

溶劑系統(tǒng)對硅膠表面印跡聚合物的合成有決定性的影響，適宜的溶劑系統(tǒng)，有利于印跡聚合反應(yīng)在硅膠表面進行，當(dāng)溶劑對模板分子的溶解度過大、交聯(lián)劑過量，均有可能使印跡聚合物在溶液中進行，而不是聚合在硅膠表面。

參考文獻

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收稿日期：(2015-05-18)編輯：曾文雪

中圖分類號：TQ317.5

文獻標(biāo)識碼：A

通信作者：謝一輝(1958—)，男，教授。研究方向：中藥有效成分分析。E-mail:243619851@qq.com。

基金項目：第一作者：丁妍華(1990—)，女，在讀碩士研究生。研究方向：中藥有效成分分離與富集。E-mail:dyh1107@126.com。