胃癌組織中三磷酸腺苷酶家族蛋白2的表達變化及意義

楊薇，徐梅梅，夏鳳宇，姜東春，劉紅利

(秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島066000)

三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATAD2)基因在一些腫瘤中參與調控染色質動力活性、基因組轉錄活性和細胞凋亡過程［1～3］，其編碼蛋白質具有AAA區(qū)域和溴區(qū)結構域。AAA區(qū)域作為分子伴侶，執(zhí)行裝配、操作、分解蛋白復合物的功能;溴區(qū)結構域參與基因轉錄調控、細胞周期調控、信號轉導，其表達異常導致惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展，提示ATAD2極可能為一個腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關基因［4～6］。因此，我們觀察了胃癌組織及癌旁正常組織中的ATAD2表達變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2005～2009年秦皇島市第一醫(yī)院收集的配對胃癌標本和癌旁組織標本129例，均經病理證實，患者均未經術前放療及化療。其中，男97例、女32例，年齡26～78歲、中位年齡56歲;高分化15例，中分化47例，低分化67例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期44例，Ⅲ～Ⅳ期85例。

1.2 ATAD2 mRNA檢測 采用Real-time PCR法。TRIzol試劑提取癌組織和癌旁組織細胞總RNA，按TRIzol試劑盒說明書進行操作。使用NanoDrop? ND-1000檢測RNA濃度和純度，應用DEPC水將RNA濃度調到500 ng/μL。反轉錄條件:37℃ 15 min，85℃5 s，4℃保存;30 s 95℃，40個循環(huán);5 s 95℃，30 s 62℃。引物序列:ATAD2和β-actin基因的引物設計均購自沈陽立信生物技術有限公司。ATAD2上游引物為5＇-GGAATCCCAAACCACTGGACA-3＇，下游引物為5＇-GGTAGCGTCGTCGTAAAGCACA-3＇;GAPDH上游引物為5＇-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3＇，下游引物為5＇-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3＇。ATAD2 mRNA相對表達以2-ΔΔCT表示，＞1.0為高表達，＜1.0為低表達。

1.3 ATAD2蛋白檢測 所有標本組織經常規(guī)甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚4μm。高溫抗原修復，PBS沖洗3次，每次5 min。每張切片滴加50μL的鼠抗人ATAD2單克隆抗體一抗，4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min;滴加50μL的二抗，室溫孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min;DAB顯色，中性樹膠封片。陰性對照采用PBS代替一抗。光鏡下每張切片選取癌細胞較多的10個高倍視野，計數100個細胞中的陽性細胞數，無陽性細胞為陰性，陽性細胞數≤5%為弱陽性，6%～20%為陽性，＞20%為強陽性;其中強陽性和陽性為高表達，弱陽性和陰性為低表達。

1.4 隨訪與資料收集 對患者進行隨訪，截止時間為2011年12月，記錄患者的生存期以及腫瘤浸潤深度、腫瘤部位、分化程度、TNM分型、淋巴結轉移數、腫瘤大小情況。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較用配對t檢驗。ATAD2 mRNA表達與臨床病理因素的關系采用χ2檢驗;生存分析采用Kaplan-Meier法，Log-rank檢驗判斷差異性。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌及癌旁組織ATAD2 mRNA和蛋白表達比較 胃癌組織ATAD2 mRNA相對表達量為7.67± 2.09，癌旁組織為1.00±0.11，P＜0.01。胃癌組織ATAD2蛋白定位在細胞核，其中高表達77例、低表達52例，癌旁組織中未見ATAD2蛋白表達。

2.2 ATAD2 mRNA表達與胃癌患者預后的關系隨訪時間1～66個月，中位隨訪時間為36個月;32例失訪，隨訪率75%。胃癌組織ATAD2 mRNA高表達患者生存時間為(22±2)個月，低表達患者為(34±5)個月，P＜0.05。

2.3 ATAD2蛋白表達與胃癌患者臨床因素的關系見表1。

表1 ATAD2蛋白表達與胃癌患者臨床因素的關系［例(%)］

3 討論

ATAD2位于染色體8q24上，是新近發(fā)現的重要轉錄因子，多種人類腫瘤在這個區(qū)域都有異常。它是c-MYC、雄激素受體和ER-a的輔助因子，并受雌雄激素的控制［7，8］。目前，關于ATAD2影響腫瘤細胞增殖及細胞周期的分子機制還不清楚。有研究表明，ATAD2與c-MYC形成共表達復合物，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，對腫瘤增殖起重要的驅動作用［9］。近年來國內外一些研究顯示，ATAD2高表達可能與某些人類實體腫瘤的局部侵潤、轉移及影響染色體的穩(wěn)定性有關;ATAD2蛋白的表達與腫瘤患者的預后有關，是判斷腫瘤患者總生存率的獨立預后指標。在乳腺癌中，ATAD2通過控制B-Myb和EZH2促進細胞的增殖;在結腸癌、胃癌、前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌、骨肉瘤和非小細胞肺癌等惡性腫瘤中，ATAD2通過與c-MYC、E2F等轉錄因子的相互作用，增強了腫瘤與增殖、抗凋亡等相關基因的表達［10～15］。在肝癌中，ATAD2基因發(fā)現新的外顯子—外顯子連接復合體，并呈現過表達。

胃癌是人類實體腫瘤的一種，目前對ATAD2和胃癌關系的研究較少。本研究應用免疫組織化學和Real-time PCR法對胃癌及其癌旁組織中ATAD2表達情況進行檢測，結果顯示，胃癌組織ATAD2的表達較高，與在乳腺癌的研究中得到的結果相似［15，16］。上述研究結果提示，ATAD2的高表達可能與胃癌的局部浸潤和淋巴結轉移有關。胃癌的治療原則是以手術為主，輔助化療可以提高胃癌患者的生存率。阻斷ATAD2的表達能否提高胃癌患者的生存率及生活質量，有待進一步研究。

ATAD2高表達與胃癌患者預后不良有關。本研究對129例胃癌患者用Kaplan-Meier生存分析，Log-rank檢驗顯示，ATAD2高表達患者預后較差。并且，ATAD2表達與胃癌腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移數和腫瘤大小有關。提示ATAD2可以作為判斷胃癌預后的獨立指標之一，對胃癌患者預后具有指導意義。血清中ATAD2蛋白檢測尚未研究，檢測血清中ATAD2蛋白有望成為胃癌早期診斷的新方向。

［1］Yang L.Incidence and mortality of gastric cancer in China［J］.World JGastroenterol，2006，12(1):17-20.

［2］Yamasaki T，Nakazaki Y，Yoshida M，et al.Roles of conserved arginines in ATP-binding domains of AAA+chaperone ClpB from Thermus thermophilus［J］.FEBS J，2011，278(13):2395-2403.

［3］Nouet C，Truan G，Mathieu L，et al.Functional analysis of yeast bcs1 mutants highlights the role of Bcs1p-specific amino acids in the AAA domain［J］.JMol Biol，2009，388(2):252-261.

［4］Prinjha RK，Witherington J，Lee K.Place your BETs:the therapeutic potential of bromodomains［J］.Trends Pharmacol Sci，2012，33(3):146-153.

［5］Haynes SR，Dollard C，Winston F，et al.The bromodomain:a conserved sequence found in human，Drosophila and yeast proteins［J］.Nucleic Acids Res，1992，20(10):2603.

［6］Dlakic M，Mushegian A.Prp8，the pivotal protein of the spliceosomal catalytic center，evolved from a retroelement-encoded reverse transcriptase［J］.RNA，2011，17(5):799-808.

［7］Zou JX，Guo L，Revenko AS，etal.Androgen-induced coactivator ANCCA mediates specific androgen receptor signaling in prostate cancer［J］.Cancer Res，2009，69(8):3339-3346.

［8］Ciro M，Prosperini E，Quarto M，et al.ATAD2 is a novel cofactor for MYC，overexpressed and amplified in aggressive tumors［J］.Cancer Res，2009，69(21):8491-8498.

［9］Fouret R，Laffaire J，Hofman P，etal.A comparative and integrative approach identifies ATPase family，AAA domain containing 2 as a likely driver of cell proliferation in lung adenocarcinoma［J］.Clin Cancer Res，2012，18(20):5606-5616.

［10］Zou JX，Revenko AS，Li LB，et al.ANCCA，an estrogen-regulated AAA+ATPase coactivator for ERalpha，is required for coregulator occupancy and chromatin modification［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2007，104(46):18067-18072.

［11］Revenko AS，Kalashnikova EV，Gemo AT，et al.Chromatin loading of E2F-MLL complex by cancer-associated coregulator ANCCA via reading a specific histone mark［J］.Mol Cell Biol，2010，30 (22):5260-5272.

［12］Castle JC，Loewer M，Boegel S，et al.Immunomic，genomic and transcriptomic characterization of CT26 colorectal carcinoma［J］.BMCGenomics，2014，(15):190.

［13］Murakami H，Ito S，Tanaka H，etal.Establishmentof new intraperitoneal paclitaxel-resistant gastric cancer cell lines and comprehensive gene expression analysis［J］.Anticancer Res，2013，33 (10):4299-4307.

［14］Wan WN，Zhang YX，Wang XM，et al.ATAD2 is highly expressed in ovarian carcinomas and indicates poor prognosis［J］.A-sian Pac JCancer Prev，2014，15(6):2777-2783.

［15］果海娜，李良，黃錦葉，等.乳腺浸潤性導管癌中ATAD2的表達及其臨床意義［J］.臨床與實驗病理學雜志，2014，30(1):15-18.

［16］Salhia B，Kiefer J，Ross JT，et al.Integrated genomic and epigenomic analysis of breast cancer brain metastasis［J］.PLoSOne，2014，9(1):e85448.