胃癌組織Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)情況和微血管密度變化及其臨床意義

李菊霞，吳士茜，袁艷龍，孫 穎，張麗華，田云霄

·論著·

胃癌組織Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)情況和微血管密度變化及其臨床意義

李菊霞，吳士茜，袁艷龍，孫 穎，張麗華，田云霄

目的 觀察胃癌組織Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)情況及和微血管密度(MVD)變化，探討其臨床意義。方法 選取2010—2013年在邯鄲市中心醫(yī)院行胃癌切除術(shù)患者56例，收集其胃癌組織標(biāo)本56份和殘端正常胃黏膜組織標(biāo)本40份。采用EliVisionTM免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF表達(dá)情況和MVD(CD34標(biāo)記)。結(jié)果 正常胃黏膜組織Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率分別為27.5%、35.0%、12.5%，低于胃癌組織中的76.8%、83.9%、89.3%(P<0.05)。不同性別、年齡、腫瘤大小患者胃癌組織Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同腫瘤分化程度、TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者胃癌組織Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF陽(yáng)性表達(dá)者M(jìn)VD高于陰性表達(dá)者(P<0.05)。胃癌組織中Bmi-1蛋白表達(dá)與MMP-9蛋白表達(dá)(r=0.450)、VEGF表達(dá)(r=0.493)呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白和VEGF在胃癌組織中均呈高表達(dá)，且腫瘤分化程度較低、TNM分期較晚和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者胃癌組織Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白和VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，且與MVD密切相關(guān)。

胃腫瘤；Bmi-1；MMP-9；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A；微血管密度

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)癌癥，嚴(yán)重危害人們的生命健康。據(jù)調(diào)查資料顯示，我國(guó)胃癌病死率在各種惡性腫瘤病死率中排第3位，僅次于肺癌、肝癌[l]。Bmi-1基因是多梳基因(polycomb group genes，PcG)家族成員中的轉(zhuǎn)錄抑制因子，是一種公認(rèn)的原癌基因，其可協(xié)同c-myc基因共同作用，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成[2]。本研究采用微波EliVisionTM免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)情況和微血管密度(MVD)變化，探討其與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為揭示胃癌的發(fā)生機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料 選取2010—2013年在邯鄲市中心醫(yī)院行胃癌切除術(shù)患者56例，其中男35例，女21例：年齡40～77歲，中位年齡62.6歲。收集其胃癌組織標(biāo)本56份和殘端正常胃黏膜組織標(biāo)本40份，由2位高年資病理醫(yī)師按照WHO標(biāo)準(zhǔn)對(duì)全部病理切片進(jìn)行復(fù)核確診。

1.2 免疫組化檢測(cè)

1.2.1 主要試劑及儀器 EliVisionTM試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液及Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2.2 方法 采用微波EliVisionTM免疫組織化學(xué)法,參照文獻(xiàn)[3-4]方法操作，具體操作為石蠟切片脫蠟水化(烤箱56 ℃，30 min)；抗原修復(fù)：微波預(yù)熱5～10 min后自然冷卻，3%過氧化氫室溫孵育10 min，PBS沖洗3次；加一抗：滴加一抗工作液，4 ℃過夜，PBS沖洗3次；加二抗：滴加二抗工作液室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，滴加DAB顯色液5～20 min，鏡下觀察，適時(shí)終止；蘇木素復(fù)染；封固。取乳腺癌組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白和VEGF分別表達(dá)于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。參照Parenti等的操作標(biāo)準(zhǔn)，每張切片均隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為(-)，5%～25%為(+)，25%～50%為(++)，>50%為(+++)；(+)～(+++)均視為陽(yáng)性表達(dá)，(-)為陰性表達(dá)。MVD(CD34標(biāo)記)檢測(cè):參照Weidner等[5]的評(píng)判方法，先在低倍視野(×100)下找到癌組織間質(zhì)微血管密集部位，再換到高倍視野(×400)下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的微血管數(shù)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF陽(yáng)性表達(dá)情況 正常胃黏膜組織Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率分別為27.5%、35.0%、12.5%，低于胃癌組織的76.8%、83.9%、89.3%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為23.031、24.113、56.226，P<0.05)。

2.2 胃癌組織Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 不同性別、年齡、腫瘤大小患者胃癌組織Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同腫瘤分化程度、TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者胃癌組織Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.3 胃癌組織Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF表達(dá)與MVD的關(guān)系 Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF陽(yáng)性表達(dá)者M(jìn)VD高于陰性表達(dá)者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

Table 2 Relationship between the expressions of Bmi-1 protein，MMP-9 protein，VEGF of gastric carcinoma tissues and MVD

項(xiàng)目例數(shù)MVDt值P值Bmi-17 654<0 05陽(yáng)性4350 15±9 36陰性1315 62±5 14MMP-99 671<0 05陽(yáng)性4758 56±7 84陰性922 63±3 14VEGF 9 014<0 05陽(yáng)性5048 37±6 38陰性615 64±2 84

表1 胃癌組織Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.4 Bmi-1蛋白與MMP-9蛋白、VEGF的相關(guān)性 胃癌組織中Bmi-1蛋白表達(dá)與MMP-9蛋白表達(dá)(r=0.450)、VEGF表達(dá)(r=0.493)呈正相關(guān)(P<0.05)。

3 討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展不僅與遺傳因素有關(guān)，還與環(huán)境、幽門螺桿菌(Hp)感染等諸多因素有關(guān)。胃黏膜在相關(guān)因素作用下受損，如Hp感染、不良飲食習(xí)慣或攝入某些致癌物質(zhì)如亞硝胺、亞硝酸鹽類等，黏膜細(xì)胞啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序以修復(fù)損傷，該過程易發(fā)展為萎縮性胃炎，如不加以控制則會(huì)進(jìn)展為腸上皮化生-不典型增生-腫瘤形成[6]。多種基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中互相協(xié)同、相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤惡性轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移[7-8]。1991年有學(xué)者在癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了Bmi-1基因，該基因是轉(zhuǎn)錄抑制因子PcG家族的核心成員之一，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、預(yù)后等病理指標(biāo)密切相關(guān)[9]。

3.1 Bmi-1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)和意義 原癌基因Bmi-1在組織中廣泛表達(dá)，多在胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞等較為幼稚的成體細(xì)胞中和白血病、惡性腫瘤中呈陽(yáng)性表達(dá)，有研究認(rèn)為Bmi-1蛋白的高表達(dá)是預(yù)后差的一個(gè)危險(xiǎn)因素，如在鼻咽癌[10]、乳腺癌[11]、非小細(xì)胞肺癌[12]、結(jié)腸癌[13]等均呈高表達(dá)，并且高水平表達(dá)與腫瘤的惡性程度相關(guān)，早期檢測(cè)Bmi-1蛋白表達(dá)水平有助于推斷腫瘤惡性程度。推測(cè)Bmi-1蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制可能如下[11]：PcG家族成員Bmi-1可以結(jié)合PcG反應(yīng)元件，使特定靶基因轉(zhuǎn)錄沉默；也可以同c-myc等癌基因有效合作激活周期素E，參與細(xì)胞周期調(diào)控，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡過程中發(fā)揮作用，維持正常干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞自我更新，促進(jìn)腫瘤形成和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，Bmi-1蛋白均可表達(dá)于正常胃黏膜組織及腫瘤組織，但Bmi-1蛋白在正常胃黏膜中陽(yáng)性表達(dá)率為27.5%，低于胃癌組織中的76.8%；同時(shí)分析了Bmi-1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，Bmi-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與胃癌患者性別、年齡、腫瘤大小均無關(guān)；而與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，即Bmi-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)可以反映腫瘤分化程度和TNM分期；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中Bmi-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移胃癌組織，提示Bmi-1蛋白在胃癌侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。因此可認(rèn)為Bmi-1蛋白在胃癌組織中的過表達(dá)能夠作為胃癌診斷及預(yù)后判斷的有效指標(biāo)之一，也可以作為胃癌治療潛在的新靶點(diǎn)，為研制新的胃癌針對(duì)性藥物提供方向。

3.2 MMP-9蛋白在胃癌組織中的表達(dá)和意義 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)主要作用是降解絕大部分細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分，突破基底膜組織屏障，為惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移提供條件[14]。目前已發(fā)現(xiàn)其成員28個(gè)，構(gòu)成MMPs家族。MMP-9是MMPs家族中分子量最大的一種酶，由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞及惡性腫瘤細(xì)胞以酶原形式分泌產(chǎn)生，作用為降解ECM中的Ⅳ、Ⅴ型膠原和明膠等主要成分，破壞ECM和基底膜結(jié)構(gòu)，促使腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤(rùn)，因此被認(rèn)為是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的新指標(biāo)[15]。本研究結(jié)果顯示，MMP-9蛋白在正常胃黏膜組織中呈低表達(dá)，在胃癌組織中的表達(dá)明顯上升，MMP-9蛋白在不同腫瘤分化程度、TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的胃癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率不同，因此推斷MMP-9蛋白的異常高表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

3.3 VEGF在胃癌組織中的表達(dá)和意義 VEGF是一種能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白因子，VEGF可以增加血管通透性，有助于腫瘤的生長(zhǎng)。VEGF具體作用機(jī)制如下[16]：(1)直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，促使血管生成；(2)促進(jìn)血漿蛋白原外滲；(3)通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生蛋白酶以降解ECM，使內(nèi)皮細(xì)胞向外遷移形成新的血管。腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移的前提是血管生成，腫瘤的營(yíng)養(yǎng)、代謝產(chǎn)物均需要新生成的血管提供，同時(shí)還可作為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移路徑。VEGF不僅可以促進(jìn)血管生成，同時(shí)還可以誘導(dǎo)淋巴管形成，以此為腫瘤細(xì)胞提供養(yǎng)分[17]，因此降解或破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜，增加滲透作用在腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，VEGF在正常胃黏膜組織中陽(yáng)性表達(dá)率為12.5%，低于胃癌組織中的89.3%，且在腫瘤低分化和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率高，充分說明在腫瘤的生成、轉(zhuǎn)移過程中扮演著不可替代的角色。

3.4 胃癌組織中MVD的變化分析 腫瘤的轉(zhuǎn)移與新生血管形成關(guān)系密切，不管是淋巴轉(zhuǎn)移還是血管轉(zhuǎn)移均需要新生毛細(xì)血管參與。有研究證實(shí)，胃癌的轉(zhuǎn)移和MVD緊密相關(guān)，MVD亦是目前判斷胃癌新生血管形成的常用指標(biāo)[16]。本研究結(jié)果顯示，Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF陽(yáng)性表達(dá)患者M(jìn)VD高于陰性表達(dá)者，且Bmi-1蛋白表達(dá)與MMP-9蛋白表達(dá)、VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，表明胃癌組織中MMP-9蛋白破壞腫瘤ECM的同時(shí)，Bmi-1蛋白調(diào)控VEGF促進(jìn)腫瘤周圍血管生成，三者相互協(xié)同，共同作用于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移；在腫瘤分化程度較低、TNM分期較晚和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者胃癌組織中Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，且與MVD密切相關(guān)，檢測(cè)Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白和VEGF表達(dá)情況可以預(yù)測(cè)胃癌發(fā)展及預(yù)后。

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(本文編輯：毛亞敏)

Expressions of Bmi-1 Protein，MMP-9 Protein，VEGF and MVD Changes of Gastric Carcinoma Tissues and Their Clinical Significances

LIJu-xia，WUShi-qian，YUANYan-long，etal.DepartmentofOutpatient，HandanMiningGroupLimitedCompanyofJizhongEnergyResources，Handan056000，China

Objective To investigate the expressions of Bmi-1 protein，MMP-9 protein，VEGF and MVD changes of gastric carcinoma tissues and their clinical significances.Methods From 2010 to 2013，a total of 56 patients undergoing gastric cancer resection in the Central Hospital of Handan were selected，56 samples of gastric carcinoma tissues and 40 samples of normal gastric mucosa tissues were collected.EliVisionTMimmunohistochemical method was used to detect the expressions of Bmi-1 protein，MMP-9 protein，VEGF and MVD(CD34signed).Results The positive expression rate of Bmi-1 protein，MMP-9 protein and VEGF of normal gastric mucosa tissues was 27.5%，35.0%，12.5%，respectively，was statistically significantly lower than that of gastric carcinoma tissues of 76.8%，83.9%，89.3%，respectively(P<0.05).No statistically significant differences of positive expression rate of Bmi-1 protein，MMP-9 protein or VEGF of gastric carcinoma tissues was found in patients with different gender，ages，tumor sizes(P>0.05)；while there were statistically significant differences of positive expression rates of Bmi-1 protein，MMP-9 protein and VEGF of gastric carcinoma tissues in patients with different tumor differentiation grades，TNM stages，with or without lymphatic metastasis(P<0.05).MVD of patients with positive expressions of Bmi-1 protein，MMP-9 protein and VEGF of gastric carcinoma tissues were statistically significantly higher than those of patients with negative expressions(P<0.05).The expression of Bmi-1 protein of gastric carcinoma tissues was positively correlated with expression of MMP-9 protein(r=0.450)，expression of VEGF(r=0.493)，respectively.Conclusion Expressions of Bmi-1 protein，MMP-9 protein，VEGF of gastric carcinoma tissues are high，and they are relatively higher in patients with poorly differentiated tumor grades，advanced TNM stages and lymphatic metastasis，and are closely related with MVD.

Stomach neoplasms；Bmi-1；MMP-9；Vascular endothelial growth factor A；Correlation microvessel

河北省衛(wèi)生廳計(jì)劃內(nèi)項(xiàng)目(ZD20140490)

056000河北省邯鄲市，冀中能源邯鄲礦業(yè)集團(tuán)有限公司機(jī)關(guān)門診部(李菊霞)；邯鄲市中心醫(yī)院(吳士茜，袁艷龍，孫穎，張麗華，田云霄)

李菊霞，吳士茜，袁艷龍，等.胃癌組織Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)情況和微血管密度變化及其臨床意義[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志，2015，23(6)：38-41.[www.syxnf.net]

R 735.2

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.06.011

2015-03-05；

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