杏鮑菇采后木質(zhì)化相關(guān)基因?qū)崟r定量PCR中內(nèi)參基因的選擇

秦曉藝，王 杰

(華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州 510642 )

杏鮑菇采后木質(zhì)化相關(guān)基因?qū)崟r定量PCR中內(nèi)參基因的選擇

秦曉藝，王 杰

(華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州 510642 )

【目的】 篩選出合適的內(nèi)參基因，為分析不同貯藏時期杏鮑菇(Pleurotuseryngii)子實體中木質(zhì)化相關(guān)基因的表達提供支持?！痉椒ā?以4 ℃低溫貯藏0，3，6，9，12，15和18 d的杏鮑菇子實體為材料，采用實時熒光定量 PCR(Quantitative real-time PCR，RT-qPCR)技術(shù)，分析了β-actin、18SrRNA、β-tubulin、ELF和GAPDH5個候選內(nèi)參基因在不同貯藏時期杏鮑菇的表達情況；通過GeNorm和NormFinder 2種軟件篩選出最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；選取最佳內(nèi)參基因，采用相對表達定量法對木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶，即苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Phenylalanina ammonia-lyse，PAL)基因的表達進行定量分析。【結(jié)果】 5個內(nèi)參基因均能特異擴增， 其中GAPDH基因表達豐度較低，不適合用作內(nèi)參基因；經(jīng)GeNorm 軟件分析計算，β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA表達穩(wěn)定度平均值M分別為0.527，0.527，0.584，0.875，最適內(nèi)參基因組合為β-actin、β-tubulin和ELF；由NormFinder 軟件分析計算，β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA穩(wěn)定值S分別為0.221，0.356，0.583，1.092，β-actin穩(wěn)定性最高；綜合分析認為β-actin的表達穩(wěn)定性最高，為最佳內(nèi)參基因；以β-actin為內(nèi)參基因，發(fā)現(xiàn)4 ℃低溫貯藏3，6，9，12，15和18 d的杏鮑菇子實體中PAL基因表達量分別比新鮮樣品(0 d)增加了11.3%，10.8%，11.3%，11.5%，11.4%，10.7%?！窘Y(jié)論】β-actin可作為杏鮑菇子實體采后貯藏條件下品質(zhì)變化相關(guān)基因表達研究的內(nèi)參基因。

杏鮑菇；采后木質(zhì)化；內(nèi)參基因；實時定量PCR

杏鮑菇(Pleurotuseryngii)又名刺芹側(cè)耳，隸屬于真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、無隔擔子菌亞綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，是近年來開發(fā)栽培成功的集食用、藥用、食療于一體的珍稀食用菌新品種[1]。隨著杏鮑菇栽培和供應量的大幅增加，如何在采后貯藏中保持鮮菇的品質(zhì)已成為杏鮑菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的問題。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)，采后貯藏條件下的杏鮑菇容易發(fā)生由木質(zhì)化引起的質(zhì)地劣變。發(fā)生木質(zhì)化劣變的杏鮑菇子實體中木質(zhì)素的含量顯著增加，硬度上升，韌性增強，嚴重影響其質(zhì)地和口感，降低其食用價值和商品價值。木質(zhì)化的發(fā)生與植物組織細胞壁中木質(zhì)素的沉積有關(guān)，而木質(zhì)素的生成由一系列酶來調(diào)控[2]。因此，研究不同貯藏時期杏鮑菇中與木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因的表達情況對闡明木質(zhì)化發(fā)生的分子機制尤為重要。

在現(xiàn)有的基因表達分析方法中，實時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)具有靈敏性高、特異性強、快速準確等特點[3-4]，已成為基因表達定量分析的首選方法，廣泛應用于生物體內(nèi)基因功能的研究[5-6]。然而，在基因表達分析中，有很多可變參數(shù)需要加以控制，如起始RNA的質(zhì)量和數(shù)量、反轉(zhuǎn)錄合成效率及擴增效率等，這些因素都有可能導致RT-qPCR分析結(jié)果產(chǎn)生差異[7]。因此，需要引入合適的內(nèi)參基因?qū)悠愤M行歸一化處理，然后再對目的基因的表達量進行分析。理想的內(nèi)參基因應在不同試驗條件下和不同細胞或組織中均能夠恒定表達。實際研究中通常選用持家基因作為內(nèi)參基因，如α微管蛋白和β微管蛋白基因(α-tubulin、β-tubulin)、β肌動蛋白基因(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)、延伸因子1(ELF)、多聚泛素酶基因(UBQ)以及18S核糖體RNA基因(18SrRNA)等[8]。但任何一種持家基因的穩(wěn)定表達都是在一定條件下相對穩(wěn)定，因此在應用RT-qPCR分析基因表達的研究時，必須根據(jù)不同樣品和不同的試驗條件，選擇出相對合適的內(nèi)參基因及其數(shù)目，進行數(shù)據(jù)的校正和標準化，才能對目的基因表達進行準確可靠的定量[9]。目前，內(nèi)參基因的篩選在靈芝(Ganodermalucidum)[10-11]、糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)和肺形側(cè)耳(Pleurotuspulmonarius)[12]、白靈側(cè)耳(Pleurotuseryngiivar.tuoliensisC.J. Mou)[13]、草菇(Volvariellavolvacea)[14-15]等食用菌上已有一些報道，但多是采用半定量RT-PCR技術(shù)分析食用菌液體培養(yǎng)或生長發(fā)育過程中候選內(nèi)參基因或目的基因的轉(zhuǎn)錄特征，尚未見與食用菌采后貯藏品質(zhì)變化相關(guān)內(nèi)參基因的研究報道。為此，本研究以不同貯藏時期的杏鮑菇子實體為材料，選擇β-actin、18SrRNA、β-tubulin、ELF和GAPDH5個常用的持家基因，采用RT-qPCR技術(shù)，結(jié)合GeNorm[7]和 NormFinder[16]分析軟件對5個候選基因在不同貯藏時期杏鮑菇中的表達穩(wěn)定性進行評價，篩選出表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，并分析本課題組克隆的木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因PAL(GenBank：KF938514)在不同貯藏期的相對表達模式，以期為后續(xù)杏鮑菇采后木質(zhì)化衰敗相關(guān)基因的表達研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗所用杏鮑菇采于廣東藍田農(nóng)業(yè)有限公司。選取大小均勻、品質(zhì)良好的杏鮑菇用保鮮袋包裝不密封，貯藏溫度為4 ℃，相對濕度為98%。每隔3 d取1次樣，取樣位置均為距離菌蓋1 cm處。取樣后立即用液氮速凍，于-80 ℃保存。

1.2 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

分別取 100 mg貯藏0，3，6，9，12，15，18 d的杏鮑菇子實體組織樣品，在無菌研缽中用液氮研磨成粉末，按照 E.Z.N.A.TMFungal RNA Kit(Omega公司)試劑盒說明書提取總 RNA，采用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳(6 V/cm，恒壓)檢測其完整性，并用NanoDrop核酸濃度測定儀測定其濃度，根據(jù)A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm確定 RNA 的純度。反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈 cDNA時，按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa 公司)試劑盒的操作說明，在10 μL的反應體系中依次加入dNTP Mixture(10 mmol/L) 1 μL，Oligo dT Primer(2.5 μmol/L) 1 μL，Total RNA(1 000 ng/μL) 1 μL，RNase Free dH2O 7 μL，瞬時離心混勻，65 ℃變性退火5 min，冰浴條件下再在上述反應液中加入5×PrimeScript?Buffer 4 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL) 0.5 μL，PrimeScript?RTase(for 2 step)0.5 μL，RNase Free dH2O 5 μL，30 ℃反應10 min，42 ℃反應30 min，95 ℃反應5 min使酶失活，所得產(chǎn)物即為初始cDNA，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)標準曲線和基因表達穩(wěn)定性的分析。

1.3 引物設計及qPCR

根據(jù)相關(guān)研究文獻[10-11,15]，選取了5個候選內(nèi)參基因，包括β-肌動蛋白基因(β-actin)、18S核糖體RNA基因(18SrRNA)、β-微管蛋白基因(β-tubulin)、延伸因子 1(ELF)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)。根據(jù)NCBI中已公布的杏鮑菇及與其同源性較高的序列，用 Primer Premier 5.0 軟件設計5個內(nèi)參基因以及PAL基因特異性引物序列(表1)，并驗證引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等。引物合成和擴增產(chǎn)物的基因序列測定均由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

RT-qPCR 反應體系為 20 μL：熒光染料iQTMSYBR?Green Supermix (2×)10 μL ，雙蒸水7.2 μL，10 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，混勻。反應在熒光定量PCR管(TLS-0851， BIO-RAD公司)和CFX96 Connect實時熒光定量PCR 儀(BIO-RAD公司)上進行，經(jīng)摸索和優(yōu)化，最終確定的實時熒光定量 PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性 10 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸15 s，50 個循環(huán)；最后在 65～95 ℃監(jiān)測熔解曲線過程，每 0.5 ℃進行 1 次熒光監(jiān)測。經(jīng)熔解曲線分析確認所設計的引物無非特異擴增及引物二聚體后，將cDNA 模板按 1∶5 梯度稀釋成 5 個濃度梯度進行標準曲線分析，并計算不同引物的擴增效率。每個處理進行 3 次重復，對照用已經(jīng)處理過的滅菌水代替模板。數(shù)據(jù)讀取由實時熒光定量PCR儀自動完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

依據(jù)公式Q=EΔCt，應用 Excel 2003軟件，計算每個擴增樣品的Ct值所對應的相對表達量Q值。其中E為基因擴增效率(一般情況下將基因擴增設為理想擴增，E值默認為2)，ΔCt=Ctmin-Ct樣品(Ctmin為全部樣品中最低Ct值，Ct樣品為各樣品的Ct值)[17]。

將相對定量數(shù)據(jù)導入 GeNorm軟件(http://medgen.ugentbe/～jvdesomp/genorm)，分析得到不同貯藏期杏鮑菇中各內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定度平均值(M)并進行排序(M值越低，基因表達越穩(wěn)定)。此外，用GeNorm軟件分析內(nèi)參基因標準化因子的配對變異值Vn/(n+1)值，以 0.15 為默認取舍值[18]，確定所需內(nèi)參基因的最適數(shù)目(即當Vn/(n+1)大于0.15，則有必要引入第n+1個基因作為RT-qPCR 定量分析的內(nèi)參基因，反之，則不必使用 ≥n+1 個基因作為內(nèi)參基因)[19]。將數(shù)據(jù)導入NormFinder軟件(http://www.mdl.dk/publicationsnorm finder.htm)，分析得到不同貯藏期杏鮑菇中各內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值(S)并得出最穩(wěn)定的基因(S值越小，基因表達越穩(wěn)定)[20]。綜合2種軟件分析結(jié)果，確定不同貯藏期杏鮑菇中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。選取最佳內(nèi)參基因，采用相對表達定量法(2-ΔΔCt法)對目的基因PAL在不同貯藏期杏鮑菇中的基因表達進行定量分析，其中，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)處理組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏鮑菇子實體總 RNA 的提取及品質(zhì)檢測

不同貯藏期杏鮑菇子實體總RNA的電泳結(jié)果見圖1。

圖1結(jié)果顯示28S rRNA、18S rRNA 和 5S rRNA 3 條帶，其中 28S rRNA和 18S rRNA 條帶明亮，5S rRNA 條帶較暗淡，說明RNA 完整性較好。測定其濃度時，A260 nm/A280 nm為1.8～2.2，A260 nm/A230 nm為2.0～2.4，說明所測定貯藏0，3，6，9，12，15，18 d的7種杏鮑菇的RNA純度和質(zhì)量均較好。綜上所述，提取的杏鮑菇子實體總 RNA可以用于后續(xù)標準曲線和基因表達穩(wěn)定性的分析

2.2 杏鮑菇5個候選內(nèi)參基因的qPCR標準曲線

對5個候選內(nèi)參基因的熔解曲線進行分析，結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)其熔解曲線均為單峰，反應過程中無非特異性擴增和引物二聚體，說明這5個基因引物特異性良好。將7個不同貯藏期杏鮑菇cDNA 模板按 1∶5 梯度分別稀釋成相同倍數(shù)的濃度梯度，以Ct值為縱坐標，相對拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標進行相應的標準曲線分析，結(jié)果(表2)表明，除GAPDH外其他基因的擴增效率為 99.4%～105.0%，決定系數(shù)為 0.999～1.000。非變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖3)表明，5個候選內(nèi)參基因的擴增片段條帶整齊，無可見引物二聚體。

經(jīng)熔解曲線和標準曲線的共同分析，除GAPDH外，所設計的 4 個內(nèi)參基因引物均符合 RT-qPCR 試驗要求。而GAPDH經(jīng)普通PCR擴增后在110 bp左右有1條單一較亮的帶，說明引物特異性良好，但在RT-qPCR中直到33個循環(huán)后才起峰，擴增效率低，分析其原因可能是GAPDH為糖酵解、糖異生和卡爾文循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶[22]，GAPDH主要是在物質(zhì)合成時表達較高，而在貯藏階段主要以降解為主，基因表達豐度較低，不適合用作內(nèi)參基因。

2.3 杏鮑菇4個候選內(nèi)參基因的Ct值穩(wěn)定性評價

以不同貯藏期的杏鮑菇cDNA為模板進行RT-qPCR，得Ct值如圖4所示。從圖4可以看出， 不同貯藏期的杏鮑菇在擴增同一基因，或同一貯藏期的杏鮑菇在擴增4種不同基因時，Ct值均有明顯差異，其原因主要是不同組織同一基因以及同一組織不同基因的表達強度均有所不同。用Excel 2003對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示同一擴增反應的3個重復的標準差很小，Ct值非常接近，說明擴增反應重復性好，能準確反映基因的轉(zhuǎn)錄水平。

2.4 杏鮑菇4個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評價

經(jīng)GeNorm 軟件分析計算，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA表達穩(wěn)定度平均值M由低到高分別為0.527，0.527，0.584，0.875。由此可見，穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因是β-actin和β-tubulin，而ELF和18SrRNA穩(wěn)定性較差。分析內(nèi)參基因標準化因子的配對變異值Vn/(n+1)，結(jié)果(圖6)表明：Vn/(n+1)均大于 0.15，其中V2/3=0.185>0.15，所以若選用多個內(nèi)參基因校正杏鮑菇不同貯藏期 mRNA 的表達水平，理想的內(nèi)參基因數(shù)目為 3個，由此建議選用β-actin、β-tubulin和ELF組合。

用NormFinder 軟件分析內(nèi)參基因的原理是根據(jù)基因表達穩(wěn)定值S的大小衡量，與GeNorm 軟件分析類似，穩(wěn)定值S越小，其內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性越大，但該軟件不能預測內(nèi)參基因組合的數(shù)目。 NormFinder軟件分析結(jié)果(圖7)顯示，在杏鮑菇7個不同貯藏期，4 個內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值S為β-actin(0.221)<β-tubulin(0.356)

由于軟件間的算法和判斷標準不同，不同軟件得出同一內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性不一致，因此評估內(nèi)參基因時宜綜合分析后進行排序比較[23]。由GeNorm軟件分析得出表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是β-actin、β-tubulin和ELF，最合適的內(nèi)參基因數(shù)目為3個；通過NormFinder軟件評價得到的最穩(wěn)定內(nèi)參基因為β-actin，所以結(jié)合2種軟件分析結(jié)果確定選用β-actin作為內(nèi)參基因,用于校正實時熒光定量分析中目的基因PAL的表達。

2.5 杏鮑菇中PAL相對表達模式

苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶，是木質(zhì)素和多酚類物質(zhì)合成途徑的關(guān)鍵酶[2]。根據(jù)杏鮑菇內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價結(jié)果，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用相對表達定量法(2-ΔΔCt法)，檢測杏鮑菇不同貯藏時間(3，6，9，12，15 和18 d)PAL基因相對于新鮮樣品(0 d)基因表達量(默認為 1)的變化，結(jié)果如圖8 所示。由圖8可以看出，與新鮮樣品相比，PAL在貯藏期間(3，6，9，12，15 和18 d)的相對表達量均顯著增加(P<0.05)。其中在0～3 d的相對表達量升高到1.11，3～6 d又有所降低，之后又開始上升，至12 d升至最高值1.12，12～18 d又有一定幅度的下降，貯藏終點時相對表達量為1.11，其變化趨勢與試驗中測得的木質(zhì)素含量的變化趨勢相似。此外，低溫貯藏期間杏鮑菇中多酚含量也顯著高于新鮮樣品，這可能是PAL基因表達量在貯藏期間一直處于較高水平的原因之一。

圖7 候選內(nèi)參基因在不同貯藏期杏鮑菇中表達穩(wěn)定值的NormFinder分析
Fig.7 Stability values of candidate reference genes ofPleurotuseryngiiat different storage periods analyzed by NormFinder

圖8 不同貯藏期杏鮑菇中PAL基因相對表達量的比較
Fig.8 Relative expression levels ofPALinPleurotuseryngiiat different storage periods

3 結(jié)論與討論

實時熒光定量PCR是分析基因表達的一種有效方法，選用一種合適的內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻谋磉_量進行校正可以提高該方法的靈敏度和重復性[6]，因此在基因相對表達研究中選擇合適的內(nèi)參基因十分關(guān)鍵?？捎糜谠u價內(nèi)參基因穩(wěn)定性的方法較多，如qBasePlus軟件[24]、REST軟件[25]、BestKeeper軟件[26]等。由于穩(wěn)定的內(nèi)參基因并不多，多數(shù)內(nèi)參基因在不同的組織、細胞及不同條件下的轉(zhuǎn)錄量并不恒定，甚至差別很大[27]，因此為了保證定量 PCR 結(jié)果的準確性，內(nèi)參基因轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定性非常重要。本試驗采用RT-qPCR技術(shù)，并結(jié)合GeNorm 、NormFinder 2種軟件，對β-actin、ELF、β-tubulin、18SrRNA和GAPDH5個常用內(nèi)參基因在不同貯藏期杏鮑菇中的表達穩(wěn)定性進行綜合評估，篩選出最佳內(nèi)參基因，用于木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因——PAL相對表達模式的分析。

本試驗選用GeNorm 、NormFinder 2種軟件對經(jīng)杏鮑菇qPCR分析后的β-actin、ELF、β-tubulin和18SrRNA4 種候選內(nèi)參基因在不同貯藏時期的表達穩(wěn)定性進行綜合評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，18SrRNA、β-tubulin和ELF在杏鮑菇不同貯藏期的表達穩(wěn)定性均較差，不適合作為內(nèi)參基因，而β-actin表達最穩(wěn)定，為理想的內(nèi)參基因。本研究中選用β-actin作為內(nèi)參基因，建立了一種杏鮑菇不同貯藏時期基因相對表達量的研究體系，通過木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因PAL的 RT-qPCR 分析，發(fā)現(xiàn)PAL在貯藏期間(3，6，9，12，15，18 d)表達顯著上調(diào)，說明PAL可能在采后杏鮑菇木質(zhì)素合成過程中發(fā)揮著重要作用。

Jain等[28]通過對水稻(Oryzasativa)中10個常用內(nèi)參基因的考察，發(fā)現(xiàn)eEF-1α在不同組織中的表達較一致，18SrRNA在不同環(huán)境處理下表達較穩(wěn)定；李冉等[29]發(fā)現(xiàn)，水稻經(jīng)機械損傷處理、二化螟處理、稻縱卷葉螟處理后最穩(wěn)定的內(nèi)參基因依次為eEF-1α、25SrRNA和Actin；蔣曉梅等[30]以柳枝稷根組織為材料，同樣發(fā)現(xiàn)在不同的非生物環(huán)境脅迫條件下，最適合的內(nèi)參基因各不相同；Reid等[31]發(fā)現(xiàn)，在葡萄漿果發(fā)育期間GAPDH表達水平總是保持一致，Gu等[32]在高溫脅迫處理下的菊花中也得到相似的結(jié)論。孫美蓮等[33]利用熒光定量PCR分析茶樹不同器官組織中的基因表達差異時，發(fā)現(xiàn)α-tubulin和18SrRNA的穩(wěn)定性都不如β-actin，而比較不同成熟度的葉片和愈傷組織時，GAPDH比18SrRNA和β-actin表達更穩(wěn)定。侯志強等[34]對不同脅迫條件下鮮切馬鈴薯中 4 個常用內(nèi)參基因的表達分析表明，β-actin基因表達相對穩(wěn)定，EF1α最不穩(wěn)定。由此可見，在實際研究中內(nèi)參基因只是細胞處于特定條件下的相對穩(wěn)定表達[35]。

本研究結(jié)果表明，傳統(tǒng)內(nèi)參基因β-actin在不同貯藏時期杏鮑菇組織中的表達相對穩(wěn)定，而18SrRNA、ELF、β-tubulin和GAPDH4種候選基因表達則不穩(wěn)定。同時，應用GeNorm、NormFinder 2種軟件篩選出低溫貯藏杏鮑菇最合適的內(nèi)參基因，對后續(xù)研究杏鮑菇木質(zhì)化相關(guān)酶基因以及其他未知功能基因與木質(zhì)化的聯(lián)系具有重要意義。

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Selection of reference gene for quantitative real-time PCR analysis of lignification related genes in postharvestPleurotuseryngii

QIN Xiao-yi,WANG Jie

(CollegeofFoodScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong510642,China)

【Objective】 The objective of this experiment was to select suitable reference gene to support analysis of the expression of lignification related genes inPleurotuseryngiiat different storage periods.【Method】 In this study,quantitative real-time PCR (RT-qPCR) was used to analyze the mRNA expression of five candidate reference genes,β-actin,18SrRNA,β-tubulin,ELFandGAPDH,inPleurotuseryngiistored at 4 ℃ for different periods (0,3,6,9,12,15 and 18 d).The most stable genes were selected by GeNorm and NormFinder.Then,with the relative quantification method,the expression of Phenylalanina ammonia-lyse (PAL),a key enzyme in lignin biosynthesis pathway,was valuated.【Result】 All of the five reference genes could amplify specially.GAPDHwas unsuitable because of its less abundant expression.Mean stabilities ofβ-actin,β-tubulin,ELF,and 18SrRNAwere 0.527,0.527,0.584,and 0.875,analyzed by GeNorm,respectively.The optimum reference genes were a combination ofβ-actin,β-tubulinandELF.Stability values ofβ-actin,β-tubulin,ELF,and 18SrRNAanalyzed by NormFinder were 0.221,0.356,0.583,and 1.092,andβ-actinwas the most stable one.Comprehensive analysis showed thatβ-actinwith the highest stability was the most suitable gene.Then usingβ-actinas the reference gene,relative changes ofPALexpression inPleurotuseryngiiat different storage periods (3,6,9,12,15 and 18 d) increased significantly (11.3%,10.8%,11.3%,11.5%,11.4%,and 10.7%,respectively) compared to fresh sample (0 d).【Conclusion】β-actinwas the most suitable reference gene to normalize mRNA levels of quality related genes inPleurotuseryngii.

Pleurotuseryngii;postharvest lignification;reference gene;quantitative real-time PCR

2014-04-18

國家自然科學基金項目(31101589)；廣東省科技計劃項目(2011B020310006)

秦曉藝(1990-)，女，河南三門峽人，碩士，主要從事食用菌生理生化及分子生物學研究。 E-mail：qinxiaoyi0503@163.com

王 杰(1978-)，女，河南駐馬店人，副教授，博士，碩士生導師，主要從事食藥用真菌生物工程研究。 E-mail：wjcasey@scau.edu.cn

時間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.024

Q789;S646

A

1671-9387(2015)07-0219-09

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.024.html