委內(nèi)瑞拉馬腦炎疫苗研究進(jìn)展

曹增國(guó)，王化磊，王麗娜，楊松濤，夏咸柱

委內(nèi)瑞拉馬腦炎（Venezuelan equine encephalitis,VEE）是一種由蚊媒傳播的人獸共患病毒性傳染病[1]，可引起人和馬輕微發(fā)熱，或?qū)е聡?yán)重的腦炎癥狀[2]。該病主要經(jīng)蚊蟲(chóng)叮咬傳播，還可經(jīng)實(shí)驗(yàn)室感染[1]。也有研究證實(shí)氣溶膠也是一種重要的傳播途徑[3]。該病的病原為VEE病毒（VEE virus,VEEV），是披膜病毒科甲病毒屬的VEEV復(fù)合物中的一種。VEEV復(fù)合物由6種抗原上相關(guān)但又不完全相同的病毒組成，包括6種抗原亞型（Ⅰ～Ⅵ），Ⅰ和Ⅲ亞型又分別包括5個(gè)和3個(gè)變異株（即ⅠAB、ⅠC～ⅠF以及ⅢA～ⅢC）[1]。VEEV屬于Ⅰ亞型，是最主要的致病因素[4]。VEEV囊膜中含有2種糖蛋白E1和E2，其中E2蛋白是主要的保護(hù)性抗原，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和血凝抑制抗體[4]。

我國(guó)雖然尚未發(fā)現(xiàn)VEE病例，但有些地區(qū)陸續(xù)分離到與其同屬的東、西方馬腦炎病毒或在人群和動(dòng)物中檢測(cè)到相關(guān)抗體[5-9]，且隨著國(guó)際交流及人員往來(lái)的日益頻繁，該病傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。本病目前尚無(wú)特效藥及療法，疫苗免疫注射是控制該病的主要方法。目前尚無(wú)已獲批的人用及獸用疫苗，但滅活疫苗C-84和弱毒疫苗TC-83已處于新藥臨床研究階段[10-12]。本文綜述了VEE疫苗的最新研究進(jìn)展，旨在為該病的新型疫苗研究及防控策略制定提供參考。

1 滅活疫苗

最初制備的VEE疫苗是滅活疫苗，如福爾馬林滅活疫苗C-84，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其可刺激機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的抗體[4]，在制備之初通過(guò)對(duì)志愿者試驗(yàn)證明了其免疫原性，但由于少數(shù)志愿者出現(xiàn)輕微或全身臨床癥狀，提示仍存在一定的危險(xiǎn)性[13]。滅活疫苗較低的免疫原性也在一定程度上限制了該類(lèi)疫苗的發(fā)展[14]。由于C-84須多次免疫注射才能使中和抗體維持在有效保護(hù)水平，現(xiàn)基本已被弱毒疫苗所取代[4，10]。

2 弱毒疫苗

目前應(yīng)用最多的為弱毒疫苗，如利用強(qiáng)毒株（Trd株）通過(guò)豚鼠胎兒心臟細(xì)胞連續(xù)傳代研制的弱毒疫苗TC-83現(xiàn)已作為臨床研究用新藥被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)實(shí)驗(yàn)[15]。目前，TC-83主要應(yīng)用于馬的預(yù)防免疫中[16]，且已有很長(zhǎng)一段時(shí)間的安全史。相關(guān)研究表明，TC-83不僅可以預(yù)防ⅠAB和ⅠC亞型VEEV感染，對(duì)ⅠD和ⅠE亞型也有一定的預(yù)防作用[4]。有研究利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建了野毒株Trd的全長(zhǎng)cDNA感染性克隆，通過(guò)定點(diǎn)突變構(gòu)建出弱毒疫苗株 V3526[1，17]。Fine 等[18]在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中評(píng)估其免疫原性和神經(jīng)毒性，證明其不僅可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，且通過(guò)皮下途徑注射后基本無(wú)神經(jīng)毒性。馬的免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)皮下注射102PFU的弱毒疫苗V3526時(shí)，即可對(duì)強(qiáng)毒株Trd的攻擊產(chǎn)生有效保護(hù)[17]。Reed等[19]實(shí)驗(yàn)證明，弱毒疫苗株V3526不僅能使非人的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物如猴子產(chǎn)生對(duì)ⅠAB型病毒氣溶膠感染的保護(hù)，而且還能產(chǎn)生對(duì)ⅠE型病毒感染的保護(hù)，從而提示V3526作為預(yù)防VEEV氣溶膠感染的候選疫苗株的可能。但目前由于弱毒疫苗缺乏較好的免疫原性，并且可引起較為嚴(yán)重不良反應(yīng)，而未能廣泛應(yīng)用于人類(lèi)[10，20]。

3 重組活載體疫苗

重組活載體疫苗是把保護(hù)性外源基因插入到病毒或細(xì)菌基因組中，構(gòu)建表達(dá)該外源基因的重組病毒或細(xì)菌，用該重組病毒或細(xì)菌免疫動(dòng)物后可表達(dá)外源目的蛋白，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。腺病毒、痘病毒和皰疹病毒等是常用的病毒表達(dá)載體。Rosas等[21]將VEEV的結(jié)構(gòu)基因插入到Ⅰ型馬皰疹病毒（EHV-1）疫苗株RacH中，構(gòu)建出重組病毒rH-VEEV，該重組病毒可使小鼠對(duì)致死性VEEV的攻擊產(chǎn)生完全保護(hù)力，且在不產(chǎn)生中和抗體的情況下，該保護(hù)力主要與細(xì)胞毒性T細(xì)胞和VEEV特異性IgG抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān)。Williams等[22]通過(guò)對(duì)重組腺病毒活載體疫苗的VEEV結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)增加密碼子的使用率和提高信使RNA的水平，使蛋白表達(dá)水平得以提高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明優(yōu)化VEEV結(jié)構(gòu)基因的重組腺病毒活載體疫苗，小鼠的特異性抗體水平提高10倍，亦可提高攻毒保護(hù)。研究還證明此疫苗可聯(lián)合制備多聯(lián)疫苗。Rossi等[23]將腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site,IRES）插入到VEEV弱毒株上，構(gòu)建了1株不穩(wěn)定的定點(diǎn)突變株，此毒株免疫小鼠可產(chǎn)生抗體，并對(duì)致死性氣溶膠VEEV感染有一定的保護(hù)力，但是該突變株的免疫原性及保護(hù)效率有待進(jìn)一步提高。在上述研究的基礎(chǔ)上，Guerbois等[24]將亞基因組啟動(dòng)子應(yīng)用于弱毒疫苗株TC-83中，并且使IRES僅調(diào)控VEEV衣殼蛋白的表達(dá)，構(gòu)建了VEEV/IRES/C疫苗候選株。該疫苗株在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代仍可保持穩(wěn)定的減毒性狀，且對(duì)乳鼠的毒力更低，但對(duì)VEEV的強(qiáng)毒保護(hù)水平與TC-83弱毒疫苗株相當(dāng)，該研究將有效的免疫原性和保護(hù)力同更低的毒力結(jié)合在一起，同時(shí)降低毒株在自然狀態(tài)下傳播的可能。

4 DNA疫苗

DNA疫苗又稱(chēng)基因疫苗，是指將編碼某種蛋白抗原的重組真核表達(dá)質(zhì)粒直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，宿主細(xì)胞攝取后轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性和特異性2種免疫應(yīng)答，從而起到免疫保護(hù)作用。Ljungberg等[25]研制出一種由質(zhì)粒介導(dǎo)的以VEEV復(fù)制子為載體的DNA疫苗，即將現(xiàn)有的安全模式和加強(qiáng)了免疫原性的病毒復(fù)制子結(jié)合起來(lái)的新型基因工程疫苗，該DNA復(fù)制子可通過(guò)轉(zhuǎn)入的VEEV 26S啟動(dòng)子表達(dá)高水平蛋白，并且在小鼠體內(nèi)通過(guò)維持糖蛋白的細(xì)胞免疫，同時(shí)啟動(dòng)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。該疫苗的使用劑量比其他疫苗小很多，從而說(shuō)明其具有更好的免疫原性。Dupuy等[14]在體外重組了VEEVⅠAB、VEEVⅠE、穆坎博病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒的E1或E2蛋白基因，在巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的介導(dǎo)下使嵌合基因表達(dá)多種蛋白。該研究通過(guò)定向分子進(jìn)化制備了重組突變株DNA疫苗，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。

5 病毒樣顆粒（virus-like particles,VLPs）疫苗

VLPs 是由某種病毒的一個(gè)或多個(gè)蛋白的多拷貝自主包裝形成的空衣殼結(jié)構(gòu)，擁有與天然病毒或亞病毒粒子相同的抗原結(jié)構(gòu)，能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，免疫原性好[26-27]。由于VLPs不含遺傳物質(zhì)，不能自主復(fù)制，所以具有良好的安全性?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所已開(kāi)展針對(duì)VEEV VLPs疫苗的研究，并取得階段性成果，為研制安全、高效的新型疫苗提供了技術(shù)儲(chǔ)備。

6 小 結(jié)

國(guó)際交流的日趨頻繁大大增加了VEE傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)，且我國(guó)部分地區(qū)已有東方馬腦炎、西方馬腦炎等與VEEV同屬病毒所引起病例的出現(xiàn)，提示必須提高警惕。本著“關(guān)口前移，人病獸防”的原則，應(yīng)從源頭做好人獸共患病的防控工作，對(duì)外來(lái)動(dòng)物疫病應(yīng)嚴(yán)防嚴(yán)控[28]。目前，對(duì)于VEE的防控還主要依靠弱毒疫苗和滅活疫苗，隨著分子生物學(xué)技術(shù)及基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，新型疫苗的研發(fā)取得突破性進(jìn)展，但多種前景良好的疫苗仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，要實(shí)現(xiàn)應(yīng)用及商品化還有很長(zhǎng)的路要走。隨著研究的不斷深入，VEE疫苗研究領(lǐng)域必將迎來(lái)新的階段。

[1] 林祥梅，韓雪清，王景林，等.外來(lái)動(dòng)物疫病［M］.北京：科學(xué)出版社，2014：226-236.

[2]OIE.Venezuelan equine encephalitis［EB/OL］.［2015-01-31］.http://www.oie.int/international-standard-setting/terrestrial-mannual/access-online/.

[3]Reed DS,Lind CM,Sullivan LJ,etal.Aerosol infection of cynomolgusmacaqueswith enzootic strains of venezuelan equine encephalitis viruses［J］.J Infect Dis,2004,189(6):1013-1017.

[4] 殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，1997：605-611.

[5] 李其平，梁國(guó)棟，謝吉處.東方馬腦炎病毒的分離與初步鑒定［J］.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，1992，6(1):58-59.

[6] 呂新軍，付士紅，楊益良，等.我國(guó)分離的XJ-90206病毒鑒定為西方馬腦炎病毒［J］.病毒學(xué)報(bào)，2001，17(4):307-312.

[7] 潘亮，潘敏楠，嚴(yán)延生，等.福建首次從臨床病例中發(fā)現(xiàn)東部馬腦炎病毒感染者［J］.海峽預(yù)防醫(yī)學(xué),2003,9(4):31-32.

[8] 何海懷，呂新軍，楊益良，等.我國(guó)分離的兩株病毒為重組甲病毒［J］.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2001，15(2):120-124.

[9] 陳立，梁國(guó)棟，陳伯權(quán)，等.我國(guó)一些地區(qū)人血清中抗辛德畢斯病毒和抗東方馬腦炎病毒的抗體檢測(cè)［J］.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，1994，8(4):371-372.

[10]Pittman PR,Makuch RS,Mangiafico JA,etal.Long-term duration of detectable neutralizing antibodies after administration of liveattenuated VEE vaccine and following booster vaccination with inactivated VEE vaccine［J］.Vaccine,1996,14(4):337-343.

[11]Atasheva S,Kim DY,Akhrymuk M,et al.Pseudoinfectious Venezuelan equine encephalitis virus:a new means of alphavirus attenuation［J］.JVirol,2013,87(4):2023-2035.

[12]Sharma A,Gupta P,Glass PJ,etal.Safety and protective efficacy of INA-inactivated Venezuelan equine encephalitis virus:implication in vaccine development［J］.Vaccine,2011,29(5):953-959.

[13]Edelman R,Ascher MS,Oster CN,etal.Evaluation in humans of a new,inactivated vaccine for Venezuelan equine encephalitis virus(C-84)［J］.J Infect Dis,1979,140(5):708-715.

[14]Dupuy LC,Locher CP,Paidhungat M,et al.Directed molecular evolution improves the immunogenicity and protective efficacy of a Venezuelan equine encephalitis virus DNA vaccine［J］.Vaccine,2009,27(31):4152-4160.

[15]Erwin-Cohen R,Porter A,Pittman P,etal.Host responses to liveattenuated Venezuelan equine encephalitis virus (TC-83):comparison of na?ve,vaccine responder and nonresponder to TC-83 challenge in human peripheral blood mononuclear cells［J］.Hum Vaccin Immunother,2012,8(8):1053-1065.

[16]O'Brien L,Perkins S,Williams A,et al.Alpha interferon as an adenovirus-vectored vaccine adjuvant and antiviral in Venezuelan equine encephalitis virus infection［J］.JGen Virol,2009,90(Pt 4):874-882.

[17]Fine DL,Roberts BA,Teehee ML,etal.Venezuelan equine encephalitis virus vaccine candidate(V3526)safety,immunogenicity and efficacy in horses［J］.Vaccine,2007,25(10):1868-1876.

[18]Fine DL,Roberts BA,Terpening SJ,etal.Neurovirulence evaluation of Venezuelan equine encephalitis(VEE)vaccine candidate V3526 in nonhuman primates［J］.Vaccine,2008,26(27-28):3497-3506.

[19]Reed DS,Lind CM,LackemeyerMG,etal.Genetically engineered,live,attenuated vaccines protect nonhuman primates against aerosol challenge with a virulent IE strain of Venezuelan equine encephalitis virus［J］.Vaccine,2005,23(24):3139-3147.

[20]Alevizatos AC,McKinney RW,Feigin RD.Live,attenuated Venezuelan equine encephalomyelitis virus vaccine.I.Clinical effects inman［J］.Am JTrop Med Hyg,1967,16(6):762-768.

[21]Rosas CT,Paessler S,Ni H,et al.Protection of mice by equine herpesvirus type 1 based experimental vaccine against lethal Venezuelan equine encephalitis virus infection in the absence of neutralizing antibodies［J］.Am JTrop Med Hyg,2008,78(1):83-92.

[22]Williams AJ,O'Brien LM,Phillpotts RJ,etal.Improved efficacy of a gene optimised adenovirus-based vaccine for venezuelan equine encephalitis virus［J］.Virol J,2009,6:118.

[23]Rossi SL,Guerbois M,Gorchakov R,etal.IRES-based Venezuelan equine encephalitis vaccine candidate elicits protective immunity in mice［J］.Virology,2013,437(2):81-88.

[24]Guerbois M,Volkova E,Forrester NL,etal.IRES-driven expression of the capsid protein of the Venezuelan equine encephalitis virus TC-83 vaccine strain increases its attenuation and safety［J］.PLoSNegl Trop Dis,2013,7(5):e2197.

[25]Ljungberg K,Whitmore AC,Fluet ME,et al.Increased immunogenicity ofa DNA-launched Venezuelan equine encephalitis virusbased replicon DNA vaccine［J］.JVirol,2007,81(24):13412-13423.

[26]Jennings GT,Bachmann MF.The coming of age of virus-like particle vaccines［J］.Biol Chem,2008,389(5):521-536.

[27]胡桂秋，梁紅茹，馮昊.病毒樣顆粒疫苗研究新進(jìn)展［J］.中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2013，8(2):175-177.

[28]夏咸柱.關(guān)口前移，從源頭防控人獸共患?。跡B/OL］.［2015-01-30］.http://wenku.baidu.com/link?url=_cTNP2WkI_8aTh1Wy-Fs-BeO-FH09cFdfPRIEjcr9VgwbglPP5MYyJJnexdPZzf5K7suTXb5y4 PR0zYqxSOIphEVWJbwrHi70XuTWhatK2Uu.