環(huán)氧化酶-2對(duì)骨折愈合的影響研究進(jìn)展

張先啟，劉亞軍，官建中

20世紀(jì)70年代，隨著前列腺素(PG)在炎癥、發(fā)熱和疼痛等過(guò)程中研究的不斷深入，英國(guó)Vane等學(xué)者發(fā)現(xiàn)了阿司匹林等非甾體類抗炎藥(NSALDs)是通過(guò)抑制前列腺素(PG)生成過(guò)程中的限速酶——環(huán)氧合酶(cyclooxygenase)而發(fā)揮作用的。20世紀(jì)90年代，基因表達(dá)證實(shí)兩種COX存在，其中COX－2對(duì)骨折愈合影響較明顯。

1 環(huán)氧化酶(COX-2)［1］

人類COX-2的基因位于1號(hào)染色體的1q25.2～q25.3，全長(zhǎng)8.3kb，它有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成，編碼604個(gè)氨基酸組成多肽。環(huán)氧化酶-1(COX-1)和環(huán)氧化酶-2(COX-2)兩種同分異構(gòu)體，COX-1是維持機(jī)體正常生理功能的管家基因，在胃腸道的保護(hù)、維持肝腎功能及凝血機(jī)制等方面起重要作用;COX-2是一種誘導(dǎo)型酶，在正常生理狀態(tài)下多數(shù)組織內(nèi)不表達(dá)，只有在細(xì)胞因子、內(nèi)毒素、白細(xì)胞介素-1(IL-1)及癌基因等因素的刺激下才能在某些細(xì)胞內(nèi)迅速產(chǎn)生，活化COX-2可以催化花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素H2(PGH2)，COX-2是這一過(guò)程的限速酶，而PGH2并不穩(wěn)定，可以轉(zhuǎn)化為幾種活性分子如:前列腺素E2(PGE2)、前列環(huán)素(PGI2)和血栓素(TXA)等［2］，COX-2的生物學(xué)功能是通過(guò)這幾種活性分子實(shí)現(xiàn)的。其中研究較多的是COX-2主要與腫瘤血管形成有密切關(guān)系。COX-1與COX-2具有61%的同源性，但表達(dá)出蛋白有明顯差異。COX-2主要分布于細(xì)胞核膜上，其主要調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平，誘導(dǎo)表達(dá)因素包括癌基因、IL-1、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等，而地塞米松等消炎藥物可抑制其表達(dá)［3］。

2 環(huán)氧化酶(COX-2)對(duì)骨折愈合影響機(jī)制

2.1 影響骨折愈合生理病理機(jī)制 骨折愈合過(guò)程中，破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡是維持骨骼完整性的關(guān)鍵因素，成骨細(xì)胞是一種對(duì)機(jī)械應(yīng)力較敏感的細(xì)胞，通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化成熟，并且參與骨吸收。在對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)中，骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)及骨保護(hù)素配體(OPGL)等系統(tǒng)起關(guān)鍵作用［4］。研究表明COX-2是一種酶，可以將花生四烯酸(AA)酶化成前列腺素E2(PGE2)，后者在炎癥反應(yīng)和疼痛方面起重要作用。同時(shí)COX-2在骨骼重建、骨質(zhì)吸收、骨折愈合以及成骨細(xì)胞力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中起重要作用，機(jī)械牽拉等機(jī)械因素刺激能引起成骨細(xì)胞COX-2 mRNA基因高水平表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致前列腺素(PG)產(chǎn)生增加，激活成骨細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2.2 國(guó)內(nèi)外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)影響骨折愈合相關(guān)機(jī)制 國(guó)外多項(xiàng)基因研究證實(shí)COX2蛋白和分子機(jī)制的基因療法:加速骨折愈合相關(guān)的研究已在老鼠脛骨骨折模型中實(shí)施。Zhang等［5］報(bào)道在小鼠體內(nèi)敲除COX-2基因，觀察到小鼠骨折處間充質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)不分化和成骨細(xì)胞的低生成，并最終導(dǎo)致較高概率的骨折不愈合及延遲骨折愈合。而對(duì)照組COX-1基因敲除的小鼠骨折不愈合情況較少。隨后他們分別對(duì)COX-2基因敲除的小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并觀察成骨細(xì)胞情況，結(jié)果提示COX-2缺失的小鼠骨結(jié)節(jié)生成較對(duì)照組減少了約50%，然后加入外源性PGE2后，骨結(jié)節(jié)生成減少得到恢復(fù)。研究表明，由于COX-2基因的缺失，阻礙了間充質(zhì)干細(xì)胞的募集與分化成為成骨細(xì)胞，從而阻礙了膜內(nèi)化骨和軟骨內(nèi)化骨。Kellinsalmi等［6］研究發(fā)現(xiàn)，選擇性COX-2抑制劑抑制干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化，也能夠促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化，但這一現(xiàn)象并沒(méi)有作出合理的解釋。Chikazu等［7］研究小鼠顱面骨折后COX-2在骨修復(fù)中的情況，從形態(tài)學(xué)、組織學(xué)以及計(jì)算機(jī)三維重建上結(jié)果表明COX-2在顱骨骨折修復(fù)中發(fā)揮著重要作用，且實(shí)驗(yàn)對(duì)照組使用非甾體抗炎，結(jié)果證實(shí)顱骨軟骨組織形成明顯快于對(duì)照組，并提出非甾體抗炎等藥物可能干擾骨折軟骨的修復(fù)。

國(guó)內(nèi)翁春輝等［8］研究低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)兔下頜骨骨折愈合COX-2表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)COX-2在骨骼重建、骨質(zhì)吸收及成骨細(xì)胞等力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中起重要作用。COX-2的表達(dá)促進(jìn)骨折愈合，成骨細(xì)胞是一種對(duì)機(jī)械應(yīng)力敏感的細(xì)胞，機(jī)械應(yīng)力可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞大量合成COX-2并通過(guò)催生的PGE2及其第二信使 cAMP對(duì)骨折愈合進(jìn)行正向調(diào)控。因此并提出誘導(dǎo)成骨細(xì)胞大量合成COX-2并通過(guò)催生成PGE2，作用于成骨細(xì)胞生物效應(yīng)的信號(hào)通路而促進(jìn)骨折愈合。

3 COX-2對(duì)細(xì)胞的增殖及新生血管的增生起重要作用

3.1 環(huán)氧化酶與新生血管增生相關(guān)機(jī)制 目前國(guó)內(nèi)外COX-2研究主要是致癌機(jī)制，認(rèn)為COX-2可促進(jìn)細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成等機(jī)制。血管生成取決于作用相反的促進(jìn)血管生成因子和血管生成抑制因子的動(dòng)態(tài)平衡。COX-2可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，BFGF)等［9］，從而促進(jìn)血管生成、骨膜覆蓋及血腫無(wú)菌性炎癥等反應(yīng)，加速骨折愈合及降低骨折不愈合率。其中VEGF是一種相對(duì)分子質(zhì)量為48000u，具有自分泌與旁分泌作用的同源二聚體糖蛋白，是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的促血管生成因子。研究表明COX-2與VEGF成正相關(guān)，且表達(dá)位置較一致。Masferrer等［10］通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了COX-2高表達(dá)可以促進(jìn)VEGF生成及血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，COX-2有促進(jìn)新生血管形成的作用，而COX-1與新生血管生成無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)研究大鼠脛骨骨折后大鼠體內(nèi)COX-2高表達(dá)促進(jìn)骨折愈合主要表現(xiàn)在在骨折內(nèi)軟骨形成的速度以及周圍軟組織新生血管生成增加，骨折后體內(nèi)炎性組織反應(yīng)導(dǎo)致體內(nèi)COX-2迅速提高，加速骨折愈合。同時(shí)Williams［11］利用遺傳學(xué)和藥理學(xué)的研究方法發(fā)現(xiàn)，COX-2特異性抑制劑可使大鼠膠質(zhì)瘤模型產(chǎn)生VEGF的潛能降低94%;并且使用選擇性COX-2抑制劑治療野生型纖維母細(xì)胞瘤的實(shí)驗(yàn)組，其VEGF生成減少92%，初步證明了 COX-2可能通過(guò)影響VEGF的合成來(lái)調(diào)節(jié)血管生成。腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移依主要依賴于新生血管的支持，若無(wú)血管供給氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，腫瘤直徑不會(huì)＞2mm［12］。一旦新生血管長(zhǎng)入腫瘤組織，腫瘤細(xì)胞迅速生長(zhǎng)，容易侵入血管發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞中COX-2的過(guò)度表達(dá)與新生血管的形成密切相關(guān)。COX-2可能通過(guò)以下3個(gè)關(guān)鍵途徑促進(jìn)新生血管生成［13］:(1)調(diào)節(jié)VEGF合成和VEGF生理功能的發(fā)揮;(2)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞移行;(3)抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

3.2 環(huán)氧化酶與臨床相關(guān)癌癥研究相關(guān)進(jìn)展 國(guó)內(nèi)外研究者已應(yīng)用多種方法檢測(cè)相關(guān)癌癥患者體征中COX-2蛋白或基因的表達(dá)，并結(jié)合病理、臨床及隨訪資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)COX-2高表達(dá)與癌癥的一些惡性特征有關(guān)。同時(shí)COX-2的高表達(dá)，且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期，尤其是臨床分期顯著相關(guān)。顯示COX-2高表達(dá)的患者預(yù)后較差。同時(shí)發(fā)現(xiàn)COX-2高表達(dá)的患者比低表達(dá)患者的生存期短，可以認(rèn)為，COX-2表達(dá)對(duì)于未接受化放療及內(nèi)分泌治療的患者是一個(gè)有意義的預(yù)測(cè)指標(biāo)。國(guó)外學(xué)者運(yùn)用多因素生存分析顯示COX-2不是癌癥患者的獨(dú)立預(yù)后因素，它與參與腫瘤生成發(fā)展的各種因子相互影響、共同作用，同時(shí)證實(shí)COX-2與血管形成在腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，它受到一系列促進(jìn)和抑制因子的調(diào)節(jié)，其中最重要的促進(jìn)因子之一是腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的VEGF。

4 COX-2抑制劑等相關(guān)鎮(zhèn)痛藥物在骨折患者使用相關(guān)分析

非甾體類抗炎藥是全球最常用的藥物之一。新上市的第二代COX-2抑制劑可產(chǎn)生顯著的消炎和鎮(zhèn)痛作用，COX-2是與疼痛及炎癥有關(guān)的COX同工酶。大量的研究和臨床應(yīng)用證明，新一代的非甾體類抗炎藥，高選擇性COX-2抑制劑具有鎮(zhèn)痛和抗炎作用，相當(dāng)于或優(yōu)于傳統(tǒng)非甾體類抗炎藥，減少胃腸道不良事件的發(fā)生率。國(guó)內(nèi)外通過(guò)不同動(dòng)物(如大鼠、兔等)和體外的報(bào)道研究，證明骨折的愈合及愈合率與非甾體抗炎藥使用有關(guān)［14］。Naik等［15］將雄性 Wistar大鼠的左側(cè)脛骨骨折建模，不同藥物干預(yù)，21d處死進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)等計(jì)量分析，結(jié)果表明:長(zhǎng)期使用雙氯酚酸鈉的干預(yù)組雖然達(dá)到了骨折愈合，但骨痂生成延緩、軟骨數(shù)量增多、成熟骨組織減少，明顯延緩了骨折愈合的時(shí)間。Bergenstock等［16］在藥物對(duì)SD大鼠骨折愈合影響的研究中，證實(shí)塞來(lái)昔布組骨折不愈合率約26%，部分愈合率約53%，完全愈合率約21%;而對(duì)照組中沒(méi)有骨折不愈合，部分愈合率約27%，完全愈合率約73%。研究同樣證明COX-2特異性抑制劑能明顯增加骨折不愈合及骨折不愈合率的發(fā)生率。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果在臨床也得到證實(shí):Bhattacharyya等［17］分析了老年人群中肱骨干骨折不愈合與使用NSALD之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)骨折后90d內(nèi)應(yīng)用NSALD會(huì)明顯增加骨折不愈合的可能性。Boursinos等［18］回顧了過(guò)去50年關(guān)于對(duì)非甾體類抗炎藥和選擇性COX-2抑制劑對(duì)骨折愈合的影響和其使用的臨床意義，證實(shí)非甾體類抗炎藥，特別是選擇性COX-2抑制劑在術(shù)后鎮(zhèn)痛方面大幅減少阿片類藥物的需要，但COX-2抑制劑的大量使用導(dǎo)致骨折愈合及不愈合率增加，并提出主要可能是時(shí)間和劑量依賴性，持續(xù)時(shí)間較短，可能不超過(guò)10d，但長(zhǎng)期使用COX-2抑制劑可能導(dǎo)致骨折愈合及不愈合率增加。國(guó)內(nèi)張超和董英海［19］總結(jié)最近相關(guān)文獻(xiàn)并提出NSAID對(duì)骨折愈合的影響主要表現(xiàn)在延緩骨折愈合時(shí)間、增加骨折不愈合率及降低骨折愈合的強(qiáng)度，并提出骨折愈合過(guò)程中NSAID的合理應(yīng)用需正確把握用藥時(shí)間和劑量、及時(shí)停藥及治療異位骨化。

綜上所述，雖然實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用證實(shí)COX-2在軟組織修復(fù)和軟骨形成過(guò)程中起重要作用，但目前文獻(xiàn)對(duì)COX-2抑制劑是否影響骨折愈合有著不同觀點(diǎn)，實(shí)踐上目前缺乏長(zhǎng)期、大規(guī)模、系統(tǒng)的隨機(jī)臨床試驗(yàn)。從理論上和現(xiàn)有研究資料讓人更傾向于認(rèn)為COX-2抑制劑影響骨折愈合，這種影響只停留在理論水平，所以應(yīng)當(dāng)趨利避害，合理使用，才能發(fā)揮NSAID的最大功效。雖然COX-2在骨折方面臨床及基礎(chǔ)研究較少，但目前COX-2主要研究多關(guān)于腫瘤與血管生成方面，多項(xiàng)研究證實(shí)COX-2在腫瘤患者體內(nèi)高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤新生血管生成，促進(jìn)腫瘤迅速增生及轉(zhuǎn)移。所以臨床可能通過(guò)檢查COX-2變化間接監(jiān)測(cè)腫瘤是否復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的一項(xiàng)指標(biāo)，但組織炎癥也可促使COX-2升高。另一方面，通過(guò)研究骨折患者體內(nèi)COX-2變化，得出COX-2與骨折不愈合及延遲愈合患者之間的關(guān)系，從而通過(guò)早期監(jiān)測(cè)骨折患者體內(nèi)COX-2變化，早期干預(yù)，減少骨折不愈合及降低骨折不愈合率，減輕患者疼痛及負(fù)擔(dān)，尤其對(duì)那些非手術(shù)治療的骨折患者提供新的非手術(shù)治療，但這可能還需進(jìn)一步大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床研究。

［1］Xie C，Ming X，Wang Q，et al.COX-2 from the injury milieu is critical for the initiation of periosteal progenitor cell mediated bone healing［J］.Bone，2008，43(22):1075 －1083.

［2］Damrongsri D，Geva S，Salvi GE，et al.Cyclooxygenase－2 inhibition selectively attenuates bone morphogenetic protein－6 synthesis and bone formation during guided tissue regeneration in a rat model［J］.Clin Oral Implants Res，2006，17(1):38 －47.

［3］Xie C，Liang B，Xue M，et al.Rescue of impaired fracture healing in COX-2－/－ mice via activation of prostaglandin E2 receptor subtype 4［J］.Am J Pathol，2009，175(2):772 －785.

［4］Wu YL，Wiltbank MC.Transcriptional regulation of the cyclooxygenase-2 gene changes from protein kinase(PK)A-to PKC-dependence after luteinization of granulosa cells［J］.Biol Reprod，2012，66:1505－1514.

［5］Zhang X，Schwarz EM，Young DA，et al.Cyclooxygenase －2 regulates mesenchymal cell differentiation into the osteoblast lineage and is critically involved in bone repair［J］.J Clin Invest，2002，109(11):1405－1415.

［6］Kellinsalmi M，Parik ka V，Risteli J，et al.Inhibition of cyclooxygenase－2 down－regulates osteoclast and osteoblast differentiation and favours adipocyte formation in vitro［J］.Eur J Pharmacol，2007，572(23):102－110.

［7］Chikazu D，F(xiàn)ujikawa Y，F(xiàn)ujihara H，et al.Lyllo oxygenase-2 activity is importomt in craniofacial fracture repair［J］.Int J oral Maxillofac Surg，2011，40(3):322 －326.

［8］翁春輝，賴曉宇，詹春華，等.使用低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)兔下頜骨骨折愈合中OPG/OPGL及COX-2表達(dá)的影響［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2011，11(2):181 －184.

［9］Ferrara N，Gerber HP，LeCouter J.The biology of VEGF and its receptors［J］.Nat Med，2003，9(6):669 －676.

［10］Masferrer JL，Leahy KM，Koki AT，et al.Antiangiogenic and antitumor activities of cyclooxygenase － 2 inhibitors［J］.Cancer Res，2000，60(5):1306 －1311.

［11］Williams GW.An update on nonsteroidal anti－ inflammatory drugs and cyclooxygenase － 2 inhibitors［J］.Curr Pain Headache Rep，2005，9(6):377 －389.

［12］Hirakawa S，Brown LF，et al.VEGF － C induced lymphangiogenesis insentinel lymph nodes promotes tumor metastasis to distant sites［J］.Blood，2007，109(3):1010 －1017.

［13］Vuolteenaho K，Moilanen E.Non-steroidal anti-inflammatory drugs，cyclooxygenase － 2 and the bone healing process［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2012，55:69 － 102.

［14］Dimmen S，Nordsletten L，Engebretsenl，et al.Negative effect of parecoxib on bone mineral during fracture healing in rats［J］.Acta Orthop，2008，79(3):438 －444.

［15］Naik AA，Xie C，Zuscik MJ，et al.Reduced COX-2 expression in aged mice is associated with impaired fracture healing［J］.J Bone Miner Res，2009，24:251 －264.

［16］Bergenstcok M，Min W，Simon AM，et al.A compairson between the effects of acetaminophen and celecoxib on bone fracture healing in rats［J］.OtrhopTrauma，2005，19(10):717 －723.

［17］Bhattaehalyya T，Levin R，Vrahas MS，et al.Nonsteroidal antiinflammatory durgs and nonunion of humeral shaft fractures［J］.Arthritis Rheum，2005，53(3):364 －367.

［18］Boursinos LA，Karachalios T，Poultsides L，et al.Do steroids，conventional non-steroidal anti-inflammatory drugs and selective COX-2 inhibitors adversely affect fracture healing［J］.Musculskelet Neuronal Inter，2009，9(1):44 －45.

［19］張超，董英海.非甾體類消炎藥對(duì)骨折愈合影響的研究進(jìn)展［J］.臨床骨科雜志，2009，12(2):226 －228.