超聲波輔助植物復(fù)合酶提取中藥茯苓多糖的工藝優(yōu)化研究

陳小紅，馬芳，林標(biāo)聲，沈紹新　(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012)

超聲波輔助植物復(fù)合酶提取中藥茯苓多糖的工藝優(yōu)化研究

陳小紅，馬芳，林標(biāo)聲，沈紹新(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012)

[摘要]比較了單獨(dú)超聲提取與超聲輔助植物酶法提取茯苓多糖的效果,結(jié)果表明,超聲輔助酶法能顯著地提高多糖的浸出率和提取率(P<0.05),其最大多糖浸出率、提取率分別為5.54%、4.72%,明顯地提高了水溶性茯苓多糖的提取效率。通過正交試驗,確定了超聲輔助酶法提取茯苓多糖的最優(yōu)工藝條件:粉碎粒度20~60目、料水比1∶5、提取次數(shù)1次、提取功率90W、提取時間30min、提取溫度50℃、加酶量2.0%、酶解溫度50℃、酶解pH5.0、酶解時間120min。超聲輔助植物酶法是提取水溶性茯苓多糖的有效方法。

[關(guān)鍵詞]茯苓多糖;超聲波;植物復(fù)合酶;優(yōu)化

茯苓(Poriacocos)是我國傳統(tǒng)的藥食同源食用真菌，在許多種藥品配方中都見其身影，主要起到安神、利尿、健脾、和胃、滲濕等功效[1]。茯苓多糖是茯苓起主要功效的活性成分，主要結(jié)構(gòu)為β-(1→3)-D-葡聚糖，含量最高可達(dá)84.2%[2]。茯苓多糖分為水溶性和堿溶性多糖，一直以來，通過多種方法獲得的水溶性多糖提取率很低，最高產(chǎn)率大約在2.0%左右[3]，嚴(yán)重影響了茯苓多糖的開發(fā)與利用。茯苓中茯苓多糖含量高、提取率低的原因可能與茯苓細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)，茯苓多糖主要存在于細(xì)胞壁中，由于受到細(xì)胞壁纖維素成分的阻遏，因而提取率低[4]。近年來，國內(nèi)外報到了多種茯苓多糖的提取方法，有熱水浸提法、酸堿浸提法、酶法、微波輔助提取、超聲波輔助提取等方法[5]，但一般報道的多為單一使用的方法，相互結(jié)合的提取方法較少報道[6~7]。超聲波能增強(qiáng)分子的運(yùn)動速度和頻率，使溶劑到物質(zhì)之間的穿透力增強(qiáng)，從而提高物質(zhì)有效成分溶出的次數(shù)和速度，提高活性物質(zhì)的提取率[8]。植物復(fù)合酶中含有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、中性蛋白酶等成分，各酶系之間有較好的協(xié)同作用，有利于破解植物細(xì)胞壁，快速溶解果膠及各類易渾物質(zhì)，且不破壞植物細(xì)胞內(nèi)的各活性成分，因此有助于縮短生產(chǎn)周期，提高提取率[9]。因此，本研究將超聲波提取與植物復(fù)合酶提取相結(jié)合提取中藥茯苓水溶性多糖，并對其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高水溶性茯苓多糖的提取率，為茯苓多糖的有效開發(fā)與利用提供參考。

1材料與方法

1.1　試驗材料及儀器

茯苓：市場購買的中藥茯苓塊；植物復(fù)合酶：購自寧夏夏盛實業(yè)集團(tuán)有限公司，1kg/袋；主要儀器有YF-103型手提高速中藥粉碎機(jī)、86-2型磁力加熱攪拌器、7DL80-2B型低速臺式離心機(jī)、HH-S1數(shù)顯恒溫水浴鍋、KH-1000TDE數(shù)控超聲波清洗器。

1.2　方法

1.2.1水溶性茯苓多糖的提取工藝流程及方法

茯苓→粉碎→過篩→加水、超聲提取→過濾得濾液、濾渣→濾渣再超聲提取1～3次→合并幾次濾液，苯酚硫酸法測定濾液中多糖含量[10]，計算濾液多糖總質(zhì)量、多糖的浸出率→濾渣用溫水溶解、加復(fù)合酶酶解→過濾得酶解液、濾渣→濾渣再酶解1次→合并酶解液，并與原超聲提取液合并，用苯酚硫酸法測定合并液中多糖含量→計算合并液多糖總質(zhì)量、多糖的浸出率。

多糖的提取：將合并液真空濃縮，利用Savage法除蛋白后加入3倍量95%乙醇沉淀，4℃冰箱靜置過夜，離心取沉淀，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，再用大孔樹脂純化、透析、冷凍干燥得茯苓多糖，稱重[11]。

按下述公式計算多糖的浸出率和提取率。

多糖的浸出率=測定的溶液中多糖總質(zhì)量/原取的茯苓塊質(zhì)量×100%

多糖的提取率=稱重的茯苓多糖質(zhì)量/原取的茯苓塊質(zhì)量×100%

1.2.2超聲提取茯苓多糖的工藝條件優(yōu)化

表1　Plackett-Burman試驗設(shè)計的因素水平表和編碼

藥材的粉碎粒度、藥材溶解的料水比、超聲提取的次數(shù)、超聲提取的功率、超聲提取的時間、超聲提取的溫度6個因素對超聲提取茯苓多糖影響較大，采用響應(yīng)面分析法中Plackett-Burman試驗設(shè)計，以茯苓多糖的浸出率為響應(yīng)值考察影響提取效果的顯著因素，6個因素Plackett-Burman試驗設(shè)計如表1所示。

在Plackett-Burman試驗設(shè)計的基礎(chǔ)上，選擇對響應(yīng)值影響顯著的關(guān)鍵因素進(jìn)行正交試驗的優(yōu)化試驗，同樣以茯苓多糖的浸出率為指標(biāo)確定影響超聲提取多糖效果的最佳工藝條件，并進(jìn)行最佳工藝條件下的驗證性試驗。

1.2.3超聲輔助植物酶法提取茯苓多糖的工藝條件優(yōu)化

在上述超聲提取茯苓多糖工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選擇最佳的工藝條件進(jìn)行輔助酶法的后續(xù)試驗，影響酶法提取的因素條件有加酶量、酶解溫度、酶解pH、酶解時間，選定上述4個因素進(jìn)行正交試驗的優(yōu)化試驗，以茯苓多糖的浸出率為確定影響超聲輔助酶法提取多糖效果的最佳工藝條件，并進(jìn)行最佳工藝條件下的驗證性試驗。

分別在最佳工藝條件下，對比分析單獨(dú)超聲提取和超聲輔助植物酶法提取茯苓多糖的浸出率和提取率。

2結(jié)果與分析

2.1　超聲提取茯苓多糖的工藝條件優(yōu)化

利用Minitab 15軟件對表1的Plackett-Burman試驗設(shè)計進(jìn)行擬合和方差分析，結(jié)果如表2、表3所示。結(jié)果表明：影響超聲提取茯苓多糖效果的因素重要性依次排序是粉碎粒度(目)(X1)﹥提取功率(X4)﹥提取溫度(X6)﹥提取次數(shù)(X3)﹥料水比(X2)﹥提取時間(X5)。其中，粉碎粒度(目)(X1)、提取功率(X4)、提取溫度(X6)對響應(yīng)值的影響達(dá)到了顯著水平，因而選定此3個水平做進(jìn)一步的正交試驗分析。

表2　Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應(yīng)值

表3　Plackett-Burman試驗設(shè)計各因素影響結(jié)果分析

粉碎粒度(目)、提取功率、提取溫度3個因素對超聲茯苓多糖提取的正交試驗結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明：3因素的重要性依次為為A>B>C，即粉碎粒度(目)>提取功率>提取溫度，該結(jié)果與Plackett-Burman試驗設(shè)計各因素顯著性分析一致，最優(yōu)的組合為A2B3C2，即粉碎粒度20～60目、提取功率90W、提取溫度50℃。

結(jié)合上述Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果，按照經(jīng)濟(jì)和效益的原則，選定單獨(dú)超聲提取茯苓多糖的最佳工藝條件為粉碎粒度20～60目、料水比1︰5、提取次數(shù)1次、提取功率90W、提取時間30min，提取溫度50℃。在上述最優(yōu)條件下進(jìn)行3次的超聲提取的驗證試驗，所得的多糖浸出率均值為4.21%。

表4　單獨(dú)超聲提取正交試驗結(jié)果

2.2　超聲輔助植物酶法提取茯苓多糖的工藝條件優(yōu)化

加酶量、酶解溫度、酶解pH、酶解時間是使用植物酶提取茯苓多糖的4個影響因素，因此同樣選定L934正交試驗表進(jìn)行優(yōu)化試驗，結(jié)果如表5所示，結(jié)果表明：4因素的重要性依次為為C>A>B>D，即酶解pH>加酶量>酶解溫度>酶解時間，最優(yōu)的組合為C2A3B2D3，即酶解pH5.0、加酶量2.0%、酶解溫度50℃、酶解時間120min。在上述最優(yōu)條件下進(jìn)行3次的超聲植物酶輔助提取的驗證試驗，所得的多糖浸出率均值為5.54%。

表5　超聲輔助酶法提取正交試驗結(jié)果

2.3　2種提取方法的對比分析

單獨(dú)超聲提取和超聲輔助植物酶法提取茯苓多糖3次驗證試驗浸出率、對應(yīng)提取率的均值比較結(jié)果如表6所示，結(jié)果表明：2種提取方法多糖浸出率和對應(yīng)提取率均存在顯著差異，超聲輔助酶法提取效果要明顯好于單獨(dú)超聲提取，且差別明顯(P<0.05)。超聲輔助酶法的多糖提取率均值可以達(dá)到4.72%，比報道的水溶性茯苓多糖最高提取率在2.0%左右有了明顯的提高，超聲輔助酶法提取水溶性茯苓多糖取得了較好的結(jié)果。

表6　2種多糖提取方法比較

3小結(jié)

本研究比較了單獨(dú)超聲提取與超聲輔助植物酶法提取茯苓多糖的效果，結(jié)果表明超聲輔助酶法能顯著提高多糖的浸出率和提取率(P<0.05)，其最大多糖浸出率、提取率分別為5.54%、4.72%，明顯地提高了水溶性茯苓多糖的提取效率。通過正交試驗，優(yōu)化得到了超聲輔助酶法提取茯苓多糖的最優(yōu)工藝條件為：粉碎粒度20～60目、料水比1∶5、提取次數(shù)1次、提取功率90W、提取時間30min、提取溫度50℃、加酶量2.0%、酶解溫度50℃、酶解pH5.0、酶解時間120min。

茯苓多糖難溶于水，導(dǎo)致其水溶性多糖的提取率較低[12]。植物復(fù)合酶可以降低多糖的分子質(zhì)量和

分子間粘度，提高其水溶性；且植物復(fù)合酶在常溫和非有機(jī)溶劑條件下進(jìn)行提取，不易破壞多糖結(jié)構(gòu)，有利于保持生物活性[13]。而超聲波提取天然活性成分具有效率高、周期短、活性損失低等特點(diǎn)[14]。因此，本研究選定超聲輔助植物酶法提取水溶性茯苓多糖，有效地結(jié)合了超聲波提取與酶法提取2種方法，使得茯苓中多糖的浸出更為充分，提取率更高，且該提取方法操作較為溫和、多糖的活性及立體結(jié)果更不容易被破壞，是一種較好的茯苓多糖提取方法。

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[引著格式]陳小紅，馬芳，林標(biāo)聲，等.超聲波輔助植物復(fù)合酶提取中藥茯苓多糖的工藝優(yōu)化研究[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版)，2015，12(27)：38～41,59.

[中圖分類號]TQ91

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]16731409(2015)27003804

通信作者：

[作者簡介]陳小紅(1979-)，女，實驗師，研究方向為生物工程。沈紹新，s8917@163.com。

[基金項目]龍巖學(xué)院百名青年教師攀登項目(LQ2013024)；龍巖學(xué)院產(chǎn)學(xué)研合作項目(LC2013010)；福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(S20141018)。

[收稿日期]2015-06-05