人紅細胞生成素對高糖誘導腎近曲小管上皮細胞轉分化過程中炎性因子的影響及其可能機制

陳艷霞，楊麗萍，吳險峰，秦曉華，黃 翀，房向東，涂衛(wèi)平

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·論著·

人紅細胞生成素對高糖誘導腎近曲小管上皮細胞轉分化過程中炎性因子的影響及其可能機制

陳艷霞，楊麗萍，吳險峰，秦曉華，黃 翀，房向東，涂衛(wèi)平

目的 探討重組人紅細胞生成素(rhEPO)對高糖誘導的正常人腎小管上皮細胞(HK-2細胞)轉分化過程中炎性因子的變化及其可能機制。方法 體外培養(yǎng)HK-2細胞，采用隨機數字表法分為空白對照組(未加任何刺激物)、高糖誘導組(高糖終濃度為30 mmol/L)、甘露醇對照組(甘露醇為24.5 mmol/L)、rhEPO對照組(rhEPO終濃度為20 U/ml)、不同濃度rhEPO干預組(rhEPO終濃度分別為5、10、20 U/ml+高糖)及Rho激酶抑制劑(Y27632)組(Y27632終濃度為30 μmol/L，加入Y27632 30 min后加高糖，高糖終濃度為30 mmol/L)，以上各組均培養(yǎng)24 h。采用RT-PCR檢測各組細胞RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表達水平；采用細胞免疫熒光法檢測E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達水平；采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測人纖維連接蛋白(FN)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的蛋白表達水平。結果 各組RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表達比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中高糖誘導組與5 U/ml rhEPO組RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表達均高于空白對照組，10 U/ml rhEPO組、20 U/ml rhEPO組及Rho激酶抑制劑組RhoA、ROCK1 mRNA表達均低于空白對照組(P<0.05)；不同濃度rhEPO組RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表達均低于高糖誘導組(P<0.05)，Rho激酶抑制劑組ROCK1 mRNA表達低于高糖誘導組(P<0.05)；10 U/ml rhEPO組與20 U/ml rhEPO組RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表達均低于5 U/ml rhEPO組(P<0.05)；20 U/ml rhEPO組RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表達均低于10 U/ml rhEPO組(P<0.05)。各組α-SMA、E-cadherin、FN、IL-6及TNF-α蛋白表達比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中高糖誘導組、不同濃度rhEPO組、Rho激酶抑制劑組α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表達均高于空白對照組，E-cadherin均低于空白對照組(P<0.05)；不同濃度rhEPO組、Rho激酶抑制劑組α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表達均低于高糖誘導組，E-cadherin均高于高糖誘導組(P<0.05)；10 U/ml rhEPO組、20 U/ml rhEPO組α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表達均低于5 U/ml rhEPO組，E-cadherin均高于5 U/ml rhEPO組(P<0.05)；Rho激酶抑制劑組α-SMA、FN蛋白表達均低于5 U/ml rhEPO組，E-cadherin均高于5 U/ml rhEPO組(P<0.05)；20 U/ml rhEPO組α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表達均低于10 U/ml rhEPO組，E-cadherin均高于10 U/ml rhEPO組(P<0.05)；Rho激酶抑制劑組α-SMA、E-cadherin、FN蛋白表達均低于10 U/ml rhEPO組(P<0.05)。Pearson直線相關結果分析，高糖誘導組、不同濃度rhEPO干預組RhoA mRNA與ROCK1 mRNA表達水平呈正相關(r=0.885、0.901、0.886、0.868，P<0.05)。結論 rhEPO可抑制高糖誘導的HK-2細胞轉分化，rhEPO還可以通過減少炎性因子的產生，減輕炎性反應，從而延緩糖尿病腎病(DN)的進展，延緩腎間質纖維化，其機制可能與RhoA/ROCK信號通路有關。

糖尿病腎??；紅細胞生成素；細胞轉分化；白細胞介素6；腫瘤壞死因子α；RhoA/ROCK信號通路

陳艷霞，楊麗萍，吳險峰，等.人紅細胞生成素對高糖誘導腎近曲小管上皮細胞轉分化過程中炎性因子的影響及其可能機制[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(20)：2433-2438.[www.chinagp.net]

Chen YX,Yang LP,Wu XF，et al.Effect and possible mechanism of rhEPO in the transdifferentiation of human kidney proximal tubular epithelial cells induced by high glucose and the changes of inflammatory cytokines[J].Chinese General Practice，2015，18(20)：2433-2438.

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病全身微血管病變的一部分，是糖尿病的嚴重慢性并發(fā)癥，已成為終末期腎病的重要原因。DN發(fā)病的分子機制主要包括多元醇通路的激活、蛋白激酶C(PKC)通路的激活、晚期糖基化終末產物的形成、炎性反應、氧化應激、腎素血管緊張素-醛固酮系統的激活。高血糖是引起DN的始動因素，使用控制血糖的藥物可以幫助調節(jié)血糖水平從而保護腎功能，進而延緩腎衰竭，但這也不能完全阻止DN的進展，因此，尋找新的藥物阻止DN的進展以及治療非常必要。目前DN的發(fā)病機制尚不完全清楚。越來越多的證據支持炎癥是DN的發(fā)病機制之一，慢性微炎癥狀態(tài)及免疫系統的激活在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不可或缺的作用[1-2]。白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)在DN的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。人紅細胞生成素(rhEPO)主要由腎皮質Ⅰ型間質細胞合成，具有潛在的組織和細胞保護作用，本實驗選取高糖誘導HK-2細胞模擬DN，并探討rhEPO對高糖誘導的HK-2細胞轉分化的作用，及其過程中炎性因子的變化，為延緩DN腎纖維化的進展尋找新的證據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 rhEPO(沈陽三生制藥股份有限公司惠贈)，DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Hyclone)，0.25%胰蛋白酶(美國Gibco)，高糖，甘露醇，Rho激酶抑制劑Y27632(美國Sigma)，RNA抽提試劑Trizol(美國Invitrogen)，RT-PCR試劑盒(美國Fermentas)，2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金)，聚合酶鏈反應引物由Invitrogen合成，鼠抗人單克隆α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體、鼠抗人單克隆E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、FITC標記抗小鼠IgG(北京中杉金橋)，人纖維連接蛋白(FN)、IL-6、TNF-α定量酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海森雄)。

1.2 主要儀器 核酸微量蛋白測定儀、PCR擴增儀、凝膠成像系統(美國Bio-Rad)，DYPC-31DN型電泳儀(北京市六一儀器廠)，熒光顯微鏡(日本Olym-pus)，酶標儀(美國Thermo公司)。

1.3 HK-2細胞培養(yǎng)及實驗分組 HK-2細胞株來源于美國ATCC細胞庫，由中山大學附屬第一醫(yī)院余學清教授惠贈。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HK-2細胞，細胞生長至70%～80%融合時傳代入6孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，至80%融合后改用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基同步24 h。采用隨機數字表法分組：空白對照組(未加任何刺激物)、高糖誘導組(高糖終濃度為30 mmol/L)、甘露醇對照組(甘露醇24.5 mmol/L)、rhEPO對照組(rhEPO終濃度為20 U/ml)、不同濃度rhEPO干預組(rhEPO終濃度分別為5、10、20 U/ml+高糖，高糖終濃度為30 mmol/L)及Rho激酶抑制劑(Y27632)組(Y27632終濃度為30 μmol/L，加入Y27632 30 min后加高糖，高糖終濃度為30 mmol/L)，以上各組均培養(yǎng)24 h。實驗重復3次。

1.4 RT-PCR檢測 加入干預后培養(yǎng)24 h收集細胞，用Trizol分別提取各組細胞總RNA，檢測RNA完整性后用核酸微量蛋白測定儀測定RNA濃度。取總RNA 1.5 μg進行反轉錄合成cDNA，取cDNA 2 μl在2×EasyTaq PCR SuperMix的作用下擴增目標基因(以人β-actin為內參照)，總反應體系為50 μl。RhoA引物序列：正義鏈5′-GGCTGGACTCGGATTCGTTG-3′，反義鏈5′-CGTTGGGACAGAAATGCTTGAC-3′，擴增產物356 bp。ROCK1引物序列：正義鏈5′-TGATGGCTATTATGGACGAG-3′，反義鏈5′-GGAGCGTTTCCCAAGC-3′，擴增產物293 bp。β-actin引物序列：正義鏈5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反義鏈5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，擴增產物434 bp。反應條件：94 ℃預變性5 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸7 min，共35個循環(huán)。配制2%瓊脂糖凝膠，PCR產物電泳儀內120 V，30 min完成電泳后應用凝膠成像系統成像并使用Quantity One軟件進行數據分析。

1.5 細胞免疫熒光 6孔培養(yǎng)板中的細胞用4%多聚甲醛固定20 min(放4 ℃冰箱)，用0.1% Triton穿孔15 min，5%牛血清清蛋白(BSA)封閉液室溫封閉30 min后，各孔中滴加鼠抗人單克隆α-SMA抗體(抗體按1∶200稀釋，5% BSA封閉液配制)或鼠抗人單克隆E-cadherin抗體4 ℃冰箱孵育過夜后取出，室溫恢復30 min，加入FITC標記抗小鼠IgG二抗置37 ℃孵箱孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察。每組細胞隨機選取10個視野攝像，熒光圖片用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，每個視野累計光密度值與測量面積的比值為平均熒光強度(即蛋白相對表達量)。

1.6 ELISA法檢測FN、IL-6、TNF-α蛋白的表達 收集細胞上清液后，嚴格按照ELISA試劑盒說明進行操作，讀取波長為450 nm時OD值，繪制標準曲線，根據標準曲線方程分別求出樣品FN、IL-6、TNF-α蛋白表達濃度。

2 結果

2.1 高糖、rhEPO對RhoAmRNA、ROCK1mRNA表達的影響 各組RhoAmRNA、ROCK1mRNA表達比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中高糖誘導組與5U/mlrhEPO組RhoAmRNA、ROCK1mRNA表達均高于空白對照組，10U/mlrhEPO組、20U/mlrhEPO組及Rho激酶抑制劑組RhoAmRNA、ROCK1mRNA表達均低于空白對照組；5U/mlrhEPO組、10U/mlrhEPO組及20U/mlrhEPO組RhoAmRNA、ROCK1mRNA表達均低于高糖誘導組，Rho激酶抑制劑組ROCK1mRNA表達低于高糖誘導組；10U/mlrhEPO組及20U/mlrhEPO組RhoAmRNA、ROCK1mRNA表達均低于5U/mlrhEPO組，Rho激酶抑制劑組RhoAmRNA高于5U/mlrhEPO組，ROCK1mRNA表達低于5U/mlrhEPO組，差異均有統計學意義(P<0.05)；20U/mlrhEPO組RhoAmRNA、ROCK1mRNA表達均低于10U/mlrhEPO組，Rho激酶抑制劑組RhoAmRNA高于10U/mlrhEPO組，ROCK1mRNA表達低于10U/mlrhEPO組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

Table1ComparisonofthemRNAlevelsofRhoAandROCK1amongallthegroups

組別株數RhoAmRNAROCK1mRNA空白對照組309446±0131510074±00020高糖誘導組314003±00217a19130±00109a甘露醇對照組309515±0003810033±00019rhEPO對照組309445±0010710044±000225U/mlrhEPO組312779±00055ab14176±00055ab10U/mlrhEPO組307703±00045abc09186±00035abc20U/mlrhEPO組303337±00093abcd04766±00022abcdRho激酶抑制劑組313904±00019acd02489±00046abcdF值682939731724282P值<001<001

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與高糖誘導組比較，bP<0.05；與5 U/ml rhEPO組比較，cP<0.05；與10 U/ml rhEPO組比較，dP<0.05

2.2 高糖與rhEPO對α-SMA、E-cadherin、FN、IL-6及TNF-α蛋白表達的影響 各組α-SMA、E-cadherin、FN、IL-6及TNF-α蛋白表達比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中高糖誘導組、不同濃度rhEPO組、Rho激酶抑制劑組α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表達均高于空白對照組，E-cadherin均低于空白對照組；不同濃度rhEPO組、Rho激酶抑制劑組α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表達均低于高糖誘導組，E-cadherin均高于高糖誘導組；10 U/ml rhEPO組與20 U/ml rhEPO組α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表達均低于5 U/ml rhEPO組，E-cadherin均高于5 U/ml rhEPO組；Rho激酶抑制劑組α-SMA、FN蛋白表達均低于5 U/ml rhEPO組，E-cadherin均高于5 U/ml rhEPO組；20 U/ml rhEPO組α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表達均低于10 U/ml rhEPO組，E-cadherin均高于10 U/ml rhEPO組；Rho激酶抑制劑組α-SMA、E-cadherin、FN蛋白表達均低于10 U/ml rhEPO組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3 相關性分析 Pearson直線相關分析顯示，高糖誘導組、不同濃度rhEPO干預組RhoA mRNA與ROCK1 mRNA表達水平呈正相關(r=0.885、0.901、0.886、0.868，P<0.05)。

3 討論

DN纖維化主要發(fā)生于腎小球及腎小管間質[3]，其腎纖維化貫穿于早期DN至臨床期DN。一些患者在糖尿病早期即有腎間質纖維化，但最主要是與DN患者腎功能下降有密切關系[4]。以往研究顯示，低氧誘導因子1(HIF-1)與RhoA/ROCK信號通路存在相關性[5]，而EPO是HIF-1主要的靶基因之一，因此推測EPO與RhoA/ROCK信號通路也存在著一定聯系。ROCK抑制劑Y27632和法舒地爾阻斷糖尿病鼠腎組織中的RhoA/ROCK通路后，可以改善腎小球通透性、腎臟血流動力學、代謝指標及延緩腎小球硬化進展、抑制活性氧自由基的形成，減少細胞外基質蛋白的沉積。意味著RhoA/ROCK信號通路可能參與DN進展的過程。本實驗發(fā)現，給予不同濃度rhEPO(5、10、20 U/ml)干預后，RhoA mRNA、ROCK1 mRNA顯著下調，且隨著rhEPO濃度升高，抑制作用更加明顯；給予抑制劑Y27632后，ROCK1 mRNA表達明顯下調，免疫熒光及ELISA結果顯示，Rho激酶抑制劑組E-cadherin蛋白表達較高糖誘導組明顯增加，α-SMA、FN表達明顯減少。Pearson直線相關分析顯示，不同濃度rhEPO干預組RhoA mRNA與ROCK1 mRNA呈正相關。因此，筆者推測rhEPO可能通過抑制RhoA/ROCK信號通路抑制上皮間質轉化(EMT)過程，而發(fā)揮延緩腎纖維化的作用。

表2 各組α-SMA、E-cadherin、FN、IL-6及TNF-α蛋白表達水平的比較

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與高糖誘導組比較，bP<0.05；與5 U/ml rhEPO組比較，cP<0.05；與10 U/ml rhEPO組比較，dP<0.05;FN=纖維連接蛋白，IL-6=白介素6，TNF-α=腫瘤壞死因子α

DN患者腎活檢證實發(fā)生EMT，并發(fā)現其與腎間質纖維化及膠原蛋白的表達密切相關[6]。E-cadherin是一種存在于各種類型上皮細胞中的跨膜糖蛋白，α-SMA是一種表達于血管平滑肌細胞的骨架蛋白，正常情況下在腎組織中的表達僅見于平滑肌源性細胞，正常成熟HK-2細胞主要表達角蛋白、E-cadherin等上皮細胞標志物，幾乎不表達α-SMA。α-SMA蛋白可作為DN腎纖維化發(fā)生的標志[7]。HK-2細胞EMT過程的特征是E-cadherin蛋白的丟失和α-SMA蛋白、FN表達的升高。根據Tang等[8]研究，本研究選擇30 mmol/L D-葡萄糖體外培養(yǎng)HK-2細胞為誘導濃度，以作用24 h為誘導時間。免疫熒光結果顯示，空白對照組HK-2細胞形態(tài)呈現典型的上皮細胞表型：E-cadherin高表達，α-SMA弱表達；高糖誘導組上皮細胞標志物E-cadherin蛋白表達顯著較少，肌成纖維細胞標志物α-SMA蛋白表達顯著增加，證實高糖可誘導HK-2細胞EMT的發(fā)生。rhEPO除具有刺激造血作用外，還是擁有許多器官保護作用的多效性糖蛋白激素[9]，其可以通過降低血肌酐及尿素氮，從而改善藥物如慶大霉素等誘導的小鼠腎小管損傷性腎功能損害[10]，對脂多糖誘導的急性腎功能損害模型也具有保護作用[11]。本實驗發(fā)現，給予高糖誘導HK-2細胞發(fā)生EMT過程的同時加入不同濃度rhEPO(5、10、20 U/ml)干預，干預組E-cadherin蛋白的表達較高糖誘導組明顯增加，α-SMA蛋白的表達明顯下降，并且隨著rhEPO濃度的升高，其抑制轉分化的作用更加明顯，表明rhEPO可抑制高糖誘導的EMT過程，延緩腎間質纖維化的進展，與鄭開元[12]研究結果一致。

傳統觀念認為，DN是非免疫性疾病，20世紀90年代末首次提出免疫系統的激活及微炎性反應與DN密切相關[13]。現在越來越多的證據顯示，免疫及炎癥機制在DN中發(fā)揮著重要作用[1，14]。多項研究證實，IL-6、TNF-α、超敏C反應蛋白在DN患者體內均升高[15-17]。因此，進一步探討炎癥及促炎因子在DN發(fā)展中的作用，可以從改善微炎癥角度尋找延緩DN進展的新藥物作用靶點。

TNF-α的表達不僅限于血源性細胞與腎臟的固有細胞，如系膜細胞、內皮細胞、HK-2細胞等均能表達TNF-α[18]。1991年，Hasegawa等[19]首次提出促炎細胞因子TNF-α能顯著促進DN發(fā)展。DN患者血清TNF-α水平明顯高于單純糖尿病而無DN患者[20]。實驗研究報道，糖尿病小鼠腎小球和近端HK-2細胞TNF-α基因表達及蛋白表達均明顯增多，并且是DN患者尿蛋白排泄增多的直接、獨立的因素[21]。1991年，Sekizuka等[22]報道，DN患者血清IL-6水平明顯高于非DN患者。應用原位雜交技術發(fā)現，DN患者腎臟中的系膜細胞、腎小管細胞和浸潤細胞均可表達IL-6 mRNA。IL-6參與腎小球基底膜寬度的增加。由IL-6介導的腎臟損傷可能與改變內皮細胞通透性、增強系膜細胞的增殖能力及增加FN的表達有關[23]。IL-6 mRNA在腎間質、肌成纖維細胞(HK-2細胞轉分化而來)中強烈表達，其表達量與間質損害程度相關[24]。在DN出現臨床癥狀之前，其實就已經有炎性反應的發(fā)生[25]，其可能機制是DN患者體內的高糖毒性使腎小球基底膜支架結構孔徑增粗，引起腎小球微血管通透性升高，產生病理變化，導致炎性因子的表達增多，從而引起DN患者的蛋白尿。本實驗發(fā)現，給予高糖刺激HK-2細胞，IL-6、TNF-α蛋白濃度明顯升高，給予rhEPO干預或Y27632處理后，其表達明顯減少，且具有rhEPO濃度依賴性。推測，rhEPO對高糖環(huán)境下HK-2細胞的抗感染作用可能與抑制RhoA/ROCK信號通路有關。

綜上所述，rhEPO可通過阻斷RhoA/ROCK信號通路抑制HK-2細胞EMT過程，且還可以通過減少炎性因子的產生，減輕炎性反應，延緩DN進展。但其機制復雜，可能同時涉及多條信號通路、多種細胞因子的共同參與，且本研究采用的是體外HK-2細胞培養(yǎng)的方式進行，所得實驗結果不能完全反映臨床實際情況。今后仍需進一步研究EPO對其他通路、其他細胞因子的影響，為是否可通過抑制多條通路的活化更強地延緩DN的進展提供更多的實驗證據。

[1]Navarro-González JF，Mora-Fernández C，Muros de Fuentes M，et al.Inflammatory molecules and pathways in the pathogenesis of diabetic nephropathy[J].Nat Rev Nephrol，2011，7(6)：327-340.

[2]Massey AR，Miao L，Smith BN，et al.Increased RhoA translocation in renal cortex of diabetic rats[J].Life Sci，2003，72(26)：2943-2952.

[3]Song KH，Park J，Park JH，et al.Fractalkine and its receptor mediate extracellular matrix accumulation in diabetic nephropathy in mice[J].Diabetologia，2013，56(7)：1661-1669.

[4]Gilbert RE，Cooper ME.The tubulointerstitium in progressive diabetic kidney disease：more than an aftermath of glomerular injury？[J].Kidney Int，1999，56(5)：1627-1637.

[5]Pacary E，Tixier E，Coulet F，et al.Crosstalk between HIF-1 and ROCK pathways in neuronal differentiation of mesenchymal stem cells，neurospheres and in PC12 neurite outgrowth[J].Mol Cell Neurosci，2007，35(3)：409-423.

[6]Fragiadaki M，Mason RM.Epithelial-mesenchymal transition in renal fibrosis-evidence for and against[J].Int J Exp Pathol，2011，92(3)：143-150.

[7]Kizu A，Medici D，Kalluri R.Endothelial-mesenchymal transition as a novel mechanism for generating myofibroblasts during diabetic nephropathy[J].Am J Pathol，2009，175(4)：1371-1373.

[8]Tang L，Li H，Gou R，et al.Endothelin-1 mediated high glucose-induced epithelial-mesenchymal transition in renal tubular cells[J].Diabetes Res Clin Pract，2014，104(1)：176-182.

[9]Patel NS，Collino M，Yagoob MM，et al.Erythropoietin in the intensive care unit：beyond treatment of anemia[J].Ann Intensive Care，2011(1)：40.

[10]Rafieian-Kopaei M，Nasri H，Nematbakhsh M，et al.Erythropoietin ameliorates genetamicin-induced renal toxicity：a biochemical and histopathological study[J].J Nephropathol，2012，1(2)：109-116.

[11]Coldewey SM，Khan AI，Kapoor A，et al.Erythropoietin attenuates acute kidney dysfunction in murine experimental sepsis by activation of the β-common receptor[J].Kidney Int，2013，84(3)：482-490.

[12]鄭開元.紅細胞生成素對高糖誘導下腎小管上皮細胞轉分化的影響及其機制的研究[D].重慶：重慶醫(yī)科大學，2009.

[13]Pickup JC，Crook MA.Is type Ⅱ diabetes mellitus a disease of the innate immune system？[J].Diabetologia， 1998，41(10)：1241-1248.

[14]Tuttle KR.Linking metabolism and immunology：diabetic nephropathy is an inflammatory disease[J].J Am Soc Nephrol，2005，16(6)：1537-1538.

[15]Kajitani N，Shikata K，Nakamura A，et al.Microinflammation is a common risk factor for progression of nephropathy and atherosclerosis in Japanese patients with type 2 diabetes[J].Diabetes Res Clin Pract，2010，88(2)：171-176.

[16]Lee CC，Lorenzo C，Haffner SM，et al.The association of inflammatory and fibrinolytic proteins with 5 year change in insulin clearance：the Insulin Resistance Atherosclerosis Study(IRAS)[J].Diabetologia，2013，56(1)：112-120.

[17]Paine SK，Sen A，Choudhuri S，et al.Association of tumor necrosis factor α，interleukin 6，and interleukin 10 promoter polymorphism with proliferative diabetic retinopathy in type 2 diabetic subjects[J].Retina，2012，32(6)：1197-1203.

[18]Dong X，Swaminathan S，Bachman LA，et al.Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury[J].Kidney Int，2007，71(7)：619-628.

[19]Hasegawa G，Nakano K，Sawada M，et al.Possible role of tumor necrosis factor and interleukin-l in the development of diabetic nephropathy[J].Kidney Int，1991，40(6):1007-1012.

[20]Moriwaki Y，Yamamoto T，Shibutani Y，et al.Elevated levels of interleukin-18 and tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with type 2 diabetes mellitus：relationship with diabetic nephropathy[J].Metabolism，2003，52(5)：605-608.

[21]Navarro JF，Milena FJ，Mora C，et al.Tumor necrosis factor-alpha gene expression in diabetic nephropathy： relationship with urinary albumin excretion and effect of angiotensin-converting enzyme inhibition[J].Kidney Int Suppl，2005(99)：S98-102.

[22]Sekizuka K，Tomino Y，Sei C，et al.Detection of serum IL-6 in patients with diabetic nephropathy[J].Nephron，1994，68(2)：284-285.

[23]Karadeniz M，Erdogan M，Berdeli A，et al.Association of interleukin-6-174 G>C promoter polymorphism with increased risk of type 2 diabetes mellitus patients with diabetic nephropathy in Turkey[J].Genet Test Mol Biomarkers，2014，18(1)：62-65.

[24]Wada J，Makino H.Inflammation and the pathogenesis of diabetic nephropathy[J].Clin Sci(Lond)，2013，124(3)：139-152.

[25]Lumeng CN，Saltiel AR.Inflammatory links between obesity and metabolic disease[J].J Clin Invest，2011，121(6)：2111-2117.

(本文編輯：賈萌萌)

·全科醫(yī)生知識窗·

2015年ADA糖尿病診療標準仍關注個體化治療

由美國糖尿病協會(ADA)更新的《2015年ADA糖尿病診療標準》強調需對每例患者給予個體化管理。美國Joslin糖尿病中心的Giulio R.Romeo和Martin J.Abrahamson在2015年3月24日發(fā)表于《內科學年鑒》(Ann Intern Med)的述評中指出，根據新指南，非內分泌科醫(yī)生在接診糖尿病患者時有3個值得注意的地方：

(1)在亞裔美國人群中篩查糖尿病前期和2型糖尿病時，需將體質指數(BMI)切點降至23 kg/m2，而不能使用25 kg/m2。研究者指出，亞洲人群糖尿病漏診的現象很普遍。在易感人群中篩查糖尿病時采用較低的BMI切點會更好地檢出糖尿病或糖尿病前期患者。

(2)糖化血紅蛋白(HbA1c)目標值和治療方案需根據每例患者的年齡、合并癥、預期壽命和生活方式而定。新指南也推薦聯合用藥，但指出應考慮患者的低血糖風險、不良反應、治療對體質量的影響和花費問題。

(3)新指南推薦的收縮壓和舒張壓目標值分別為140 mm Hg和90 mm Hg。醫(yī)生應認識到患者發(fā)生動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)的風險。不論初始低密度脂蛋白膽固醇水平如何，對≥40歲的糖尿病患者應給予更強化的他汀治療，同時監(jiān)測其服藥依從性。

Romeo和Abrahamson指出，《2015年ADA糖尿病診療標準》繼續(xù)強調個體化治療，再次強調了以患者為中心的原則。

(摘自“醫(yī)脈通”網站)

Effect and Possible Mechanism of rhEPO in the Transdifferentiation of Human Kidney Proximal Tubular Epithelial Cells Induced by High Glucose and the Changes of Inflammatory Cytokines

CHENYan-xia,YANGLi-ping,WUXian-feng，etal.

DepartmentofNephrology，theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity，Nanchang330006，China

Objective To investigate the effect and possible mechanism of rhEPO in the transdifferentiation of human kidney proximal tubular epithelial cells(HK-2 cells)induced by high glucose and the changes of inflammatory cytokines.Methods By using random number table，HK-2 cells cultured in vitro were divided into several groups：blank control group(with no irritants)，high glucose induced group (with a high glucose final concentration of 30 mmol/L)，mannitol control group(with a mannitol concentration of 24.5 mmol/L)，rhEPO control group(with a rhEPO final concentration of 20 U/ml)，three rhEPO intervention groups(with a rhEPO final concentration of 5，10 and 20 U/ml respectively and high glucose added)，Rho kinase inhibitor(Y27632)group(in which Y27632 with a final concentration of 30 μmol/L was added and high glucose was added 30 minutes later with a final concentration of 30 mmol/L).After 24 h in virto culture，reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to evaluate the mRNA levels of RhoA and ROCK.The levels of E-cadherin and α-smooth muscle actin(α-SMA)proteins were assessed by immunofluorescent test.ELISA was used to measure the levels of Fibronectin(FN)，IL-6 and TNF-αproteins.Results The groups were all significantly different(P<0.05)in the mRNA levels of RhoA and ROCK；the high glucose induced group and the 5 U/ml rhEPO intervention group were higher(P<0.05)than the blank control group in the mRNA levels of RhoA and ROCK；the 10 U/ml rhEPO intervention group and the 20 U/ml rhEPO intervention group and the Y27632 group were lower(P<0.05)than the blank control group in the mRNA levels of RhoA and ROCK；the three rhEPO intervention groups were lower(P<0.05)than the high glucose induced group in the mRNA levels of RhoA and ROCK；the Y27632 group was lower(P<0.05)than the high glucose induced group in the mRNA levels of ROCK；the 10 U/ml rhEPO intervention group and the 20 U/ml rhEPO intervention group were lower(P<0.05)than the 5 U/ml rhEPO intervention group in the mRNA levels of RhoA and ROCK；the 20 U/ml rhEPO intervention group was lower(P<0.05)than the 10 U/ml rhEPO intervention group in the mRNA levels of RhoA and ROCK.The groups were significantly different(P<0.05)in the protein levels of α-SMA，E-cadherin，FN，IL-6 and TNF-α；the high glucose induced group，the three rhEPO intervention groups and the Y27632 group were higher(P<0.05)in the protein levels of α-SMA，FN，IL-6 and TNF-α and were lower(P<0.05) in E-cadherin than the blank control group；the three rhEPO intervention groups and the Y27632 group were lower(P<0.05)in the protein levels of α-SMA，FN，IL-6 and TNF-α and were higher(P<0.05)in E-cadherin than the high glucose induced group；the 10 U/ml rhEPO intervention group and the 20 U/ml rhEPO intervention group were lower(P<0.05)in the protein levels of α-SMA，FN，IL-6 and TNF-α and higher(P<0.05)in E-cadherin than the 5 U/ml rhEPO intervention group；the Y27632 group was lower(P<0.05)in the protein levels of α-SMA and FN and were higher(P<0.05)in E-cadherin than the 5 U/ml rhEPO intervention group；the 20 U/ml rhEPO intervention group was lower(P<0.05)in the protein levels of α-SMA，FN，IL-6 and TNF-αand was higher(P<0.05)in E-cadherin than the 10 U/ml rhEPO；the Y27632 group was lower(P<0.05)than the 10 U/ml rhEPO intervention group in the protein levels of α-SMA，E-cadherin and FN.The pearson linear correlation analysis showed that the mRNA level of RhoA was positively correlated with the mRNA level of ROCK1 in the high glucose group and the three rhEPO intervention groups(r=0.885，0.901，0.886，0.868；P<0.05).Conclusion rhEPO could inhibit the transdifferentiation of HK-2 cells induced by high glucose to delay the fibrosis of renal.rhEPO can also reduce the production of inflammatory cytokines，the generation of inflammatory cytokines and inflammatory response，thus delaying the progression of diabetic nephropathy and the fibrosis of renal interstitium.The mechanism may be related to RhoA/ROCK signaling pathway.

Diabetic nephropathies；Erythropoietin；Cell transdifferentiation；Interleukin-6；Tumor necrosis factor-alpha；RhoA/ROCK signaling pathway

江西省自然科學基金資助項目(20122BAB205006)

330006江西省南昌市，南昌大學第二附屬醫(yī)院腎內科(陳艷霞，吳險峰，秦曉華，黃翀，房向東，涂衛(wèi)平)；江西省腫瘤醫(yī)院(楊麗萍)

房向東，330006江西省南昌市，南昌大學第二附屬醫(yī)院腎內科；E-mail：xiangdongfang818@sina.com

R 587.24

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.20.018

2015-01-27；

2015-04-11)