零模波導原理、制備及其在單分子熒光檢測中的應用

魏清泉, 李運濤, 任魯風, 周曉光, 俞育德

1.中國科學院半導體研究所, 集成光電子學國家聯(lián)合重點實驗室, 北京 100083;2.中國科學院北京基因組研究所, DNA序列測定技術研究開發(fā)中心, 北京 100029;3.中國科學院半導體研究所/中國科學院北京基因組研究所-生物信息獲取與傳感技術聯(lián)合實驗室, 北京 100083

零模波導原理、制備及其在單分子熒光檢測中的應用

魏清泉1,3, 李運濤1,3, 任魯風2,3, 周曉光1,3, 俞育德1,3

1.中國科學院半導體研究所, 集成光電子學國家聯(lián)合重點實驗室, 北京 100083;2.中國科學院北京基因組研究所, DNA序列測定技術研究開發(fā)中心, 北京 100029;3.中國科學院半導體研究所/中國科學院北京基因組研究所-生物信息獲取與傳感技術聯(lián)合實驗室, 北京 100083

單分子熒光檢測作為一種能夠表征分子個體性質(zhì)及行為的分析方法，有助于揭示利用傳統(tǒng)熒光檢測方法無法得到的信息，在近年來受到人們的廣泛關注。利用傳統(tǒng)光學檢測設備進行單分子熒光檢測時，由于受到衍射極限的限制，同時為了保證在觀測體積內(nèi)只有單個熒光分子，僅能采用無限稀釋溶液的方法實現(xiàn)單分子熒光檢測。雖然這種方法可以滿足單分子檢測的要求，但是由于大部分酶分子正常工作時底物的生理濃度都非常高，底物濃度的大幅度降低會對酶分子的反應機制等方面造成影響。零模波導作為一種新型的單分子檢測器件，通過納米微孔結(jié)構(gòu)突破了光學衍射極限的限制將觀測體積降至仄升量級(10-21L)，使得在生理濃度范圍內(nèi)檢測單分子熒光成為可能，在單分子熒光檢測領域得到了廣泛應用。因此，就零模波導的原理、制備工藝及其在單分子DNA測序、生物膜、生物大分子之間的相互作用及單分子反應動力學方面的具體應用進行綜述。

零模波導；單分子；納米微結(jié)構(gòu)器件

20世紀90年代以來，物理學家們發(fā)明了許多新型的觀測和操控技術，例如單分子熒光、光鑷、磁鑷等，將分子生物學與物理學的交叉領域推進到了單分子水平。單分子分析技術在分子生物學領域的應用可以揭示掩蓋在集群研究方法平均效應中的個體行為，因此在單分子水平研究分子間相互作用、單分子酶動力學，并揭示細胞信號傳導的分子機制等具有重要意義[1～3]。

在傳統(tǒng)的單分子熒光研究中，普通的光學設備都受到光學衍射極限的限制，觀測體積大約為飛升(10-15L)量級，為了在觀測體積內(nèi)只有一個熒光分子,需要將溶液稀釋到納摩爾至皮摩爾每升量級的濃度[4]。但是在生物體系中，大多數(shù)酶在正常工作時配體濃度都遠遠高于普通衍射極限光學設備能夠檢測的范圍，一般在微摩爾至毫摩爾每升量級[5]。當配體的濃度低于正常濃度范圍時，酶的動力學機制及其催化反應過程可能受到影響[6]。因此，為了保證在正常濃度的生物環(huán)境中觀測單個分子，光學觀測體積至少要減小3～6個數(shù)量級。同時，觀測體積的減小可以有效縮短分子在觀測體積內(nèi)的擴散時間，對于改善單分子檢測時的時間分辨率具有積極作用[7]。

鑒于減小光學檢測設備觀測體積的重要性，人們積極開發(fā)新的檢測技術和方法，并取得了很好的成果，例如，全內(nèi)反射熒光顯微鏡(total internal reflection fluorescence microscopy，TIRFM)通過入射光全反射后在介質(zhì)表面產(chǎn)生消逝波的特性將觀測體積減小10倍左右[8]。雖然TIRFM對總的觀測體積減小的不是很多，但是由于消逝波的存在將有效觀測范圍僅限制在觀測界面約200 nm以下范圍，大大降低了背景光噪聲干擾，由于其便于與其他技術聯(lián)用進一步提高檢測靈敏度，在單分子檢測領域得到了廣泛應用[9～11]；近場光學掃描顯微鏡(near-field scanning optical microscope， NSOM)利用光通過變芯徑光纖末端的納米孔將觀測體積限制在橫向距離50 nm左右，觀測體積大約為一個阿升(10-18升)，早在20世紀90年代初，就有人利用其在支持物表面上實現(xiàn)了單分子檢測[12，13]；近些年，利用納米通道(nanochannels)限制光學觀測體積實現(xiàn)單分子檢測的方法被大量報道[14～17]，該方法主要是利用微小通道的深度限制了觀測體積的深度，照射在通道上的光斑形狀限制了觀測面積，從而形成了三維觀測體積，據(jù)報道納米通道的高度最低可達到5 nm[18,19]，因此觀測體積非常小，但是這種方法的不足之處是器件制備工藝復雜，價格昂貴，較難實現(xiàn)高通量檢測。

零模波導(zero-mode waveguides，ZMWs)作為一種新型的單分子檢測器件，在減小光學設備的觀測體積及提高檢測通量方面均有極好的效果，并在近些年被人們逐漸用于生物體系的研究當中。本文就ZMWs原理、加工技術及其在單分子檢測中的應用進行總結(jié)和分析。

1 ZMWs原理

早在1944年，Bethe[20]發(fā)表了關于光在微孔中衍射理論的文章，并發(fā)現(xiàn)當微孔的直徑小于光的波長時，光強會急劇衰減，這一獨特的光學現(xiàn)象奠定了ZMWs的理論基礎。2003年，Levene等[7]采用ZMWs技術在高濃度溶液中成功檢測了單分子，開創(chuàng)了ZMWs應用雛形。ZMWs結(jié)構(gòu)主要是由石英玻璃襯底及表面帶有納米級別直徑通孔的金屬層構(gòu)成，大量的微孔可以同時制備在同一個芯片上有效地提高ZMWs的檢測通量，如圖1所示。入射光從石英玻璃襯底開始照射，由于ZMWs存在一個截止波長λc，大于該波長的光不能在波導中傳輸，而是在微孔入口處產(chǎn)生消逝波。截止波長與ZMWs結(jié)構(gòu)的形狀及尺寸相關，對于給定的圓孔波導結(jié)構(gòu)(孔直徑為 d)，截止波長可以通過關系式λc=1.7d計算得到。消逝波的能量l(z)隨著消逝波的傳輸深度(z)呈現(xiàn)指數(shù)衰減形式，如公式1所示[7， 21]：

(1)

其中，Λ為衰減指數(shù)，λ是入射光波長。

在入射光波長大于λ時，微孔中沒有光傳輸模式，因此將這種波導模式稱為“零模波導”(ZMWs)。由于入射光的光斑遠大于納米微孔直徑，可以近似將入射光在微孔上的照射輪廓視為恒定不變，并且在微孔中軸線方向呈現(xiàn)指數(shù)衰減形式。如果將耦合效率及熒光基團的發(fā)光效率視為與入射光在在微孔上的照射輪廓相關，則在ZMWs結(jié)構(gòu)中的觀測輪廓可以由公式2計算得到，有效觀測體積可由公式3得到[7,22,23]。

S(z)=e-z/l=e-3z/Λ

(2)

(3)

圖1 ZMWs二維及三維結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Dimensional and three-dimensional structure schematic diagrams of ZMWs.

在單分子檢測過程中，將單個目標分子通過一定的方式固定在ZMWs微孔底床，然后在含有熒光標記的目標分子配體溶液中進行檢測，入射光從石英玻璃的底部照射，并從同一側(cè)觀測發(fā)射熒光，如圖2所示。在熒光信號檢測過程中，由于ZMWs的尺寸非常小，大約在100 nm以內(nèi)，同時由于消逝波在微孔中的傳播深度有限，限制了有效觀測體積，減小了在觀測體積中游離熒光標記配體的數(shù)目，從而更加容易區(qū)分目標熒光信號與背景噪聲。以直徑為100 nm的圓形微孔型ZMWs為例，用波長為488 nm的入射光照射，有效觀測體積約為125仄升(125×10-21L)，相當于濃度為10 μmol/L的溶液中單個分子占據(jù)的體積，因此ZMWs能夠在生理環(huán)境相關濃度溶液中觀測單個分子。

圖2 ZMWs單分子檢測裝置示意圖Fig.2 Schematic diagram of ZMWs single molecule detection device.

2 ZMWs器件制備

2003年Levene等[7]提出ZMWs在單分子檢測中的應用后，人們陸續(xù)對ZMWs器件的制備工藝及結(jié)構(gòu)進行了研究和改進。ZMWs結(jié)構(gòu)中廣泛采用的金屬層是鋁，這是由于鋁具有短的光學趨膚深度及高的反射特性。但是鋁的化學性質(zhì)不穩(wěn)定，因此出現(xiàn)了用金代替鋁的研究[24]。金的優(yōu)點是化學性質(zhì)穩(wěn)定不易氧化，同時由于金表面自組裝修飾方法發(fā)展非常成熟，金表面修飾化學更加容易[25,26]。在金屬膜表面上制備幾十至幾百納米級別的微孔可以通過電子束曝光，隨后以干法刻蝕的方法[7,23]或直接在金屬層上利用聚焦離子束進行微孔制備[27，28]。

人們還提出利用金屬剝離的方法進行ZMWs器件制備[29～33]，工藝流程如圖3A所示，在清潔的襯底表面旋涂電子束光刻膠，經(jīng)過電子束光刻后，在襯底上形成尺度與要制備的ZMWs相當?shù)哪z柱，沉積金屬以后再剝離，在膠柱的位置就形成了ZMWs微孔。雖然通過電子束光刻與金屬剝離相結(jié)合的方法能夠有效預防金屬碎渣的存在，但是電子束光刻技術的成本太高，且產(chǎn)出量很低，因此不適合規(guī)?；a(chǎn)ZMWs器件。2011年，Wada等[34]提出利用紫外納米壓印與金屬剝離相結(jié)合的方法制備ZMWs器件，工藝流程如圖3B所示。與電子束光刻—金屬剝離工藝相比，這種方法利用了一種能夠在紫外光下固化同時能夠溶解在有機溶劑四氫呋喃中的膠NIAC707，膠柱的形成過程省去了價格昂貴的電子束光刻過程，只需要在掩模板下較短時間光照即可形成膠柱，隨后進行清洗、金屬蒸鍍及剝離即可形成ZMWs器件，應用該方法已成功制備了孔直徑在30～150 nm的ZMWs器件，并通過實際的單分子熒光檢測實驗驗證了器件的可行性。

最近，Teng等[35]還提出一種相對廉價的工藝方法制備零模波導器件(圖4)，主要分為兩步，首先通過傳統(tǒng)的光刻、金屬沉積及金屬剝離等方法制備微米級的金屬微孔，然后通過電鍍的方式將微米級的微孔縮小至零模波導所要求的尺寸。通過這種工藝，可將770 nm的微孔通過電鍍的方式縮小至70 nm，深度為450 nm，并成功實現(xiàn)了單分子熒光檢測。這種新工藝將成熟的微光刻與電鍍技術相結(jié)合達到了制備納米級別小孔的目的，與直接利用聚焦離子束或電子束光刻等技術制備納米級微孔相比，價格低廉、制備通量高，但是受到金屬晶粒大小的影響，電鍍后小孔的形狀由電鍍前的圓形變?yōu)闄E圓形，同時如何精確控制最終縮小后的納米級小孔的尺寸有待進一步考證。

圖3 電子束光刻-金屬剝離(A) [32]及紫外納米壓印-金屬剝離工藝流程圖(B)[34]Fig.3 Process flow diagram of electron beam lithography-metal peeling (A) [32] and UV nanoimprint-metal peeling (B)[34].

圖4 光刻與電鍍技術相結(jié)合制備零模波導器件工藝示意圖[35]Fig.4 Process scheme of zero-mode waveguide devices preparation by lithography combined with electroplating technology[35].

傳統(tǒng)的ZMWs結(jié)構(gòu)中的微孔只是在襯底表面金屬上形成，這種結(jié)構(gòu)在實際應用中，單分子熒光信號會受到溶液中背景信號的干擾，為了進一步提高ZMWs的信噪比，Miyake等[36，37]提出了一種改進型ZMWs結(jié)構(gòu)(見圖5)，主要是在傳統(tǒng)ZMWs結(jié)構(gòu)微孔底部的石英玻璃襯底進一步刻蝕形成一定深度的微孔。在這種結(jié)構(gòu)中，石英玻璃襯底上的納米孔部分不是近場的有效體積部分，但是屬于觀測體積部分。由于金屬層的存在，光強在金屬層與石英玻璃的交界面處開始消失，同時由于激發(fā)光的最大強度值位于微孔深度的四分之一波長處，因此微孔底部的熒光染料分子受到的激發(fā)光和傳統(tǒng)ZMWs相比更強，同時發(fā)射熒光由于沒有金屬層的阻擋更加容易傳輸?shù)侥跨R。通過實驗，Miyake等還證明當石英玻璃上的納米微孔刻蝕深度為60 nm時，熒光強度值大約是傳統(tǒng)ZMWs結(jié)構(gòu)的2倍，2013年該小組通過理論計算說明這種改進型ZMWs信噪比能夠較傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)提高6倍，信噪比的提高將有助于增強在生理濃度溶液中單分子熒光成像的時間分辨率[38]，因此這種改進型ZMWs結(jié)構(gòu)對于提高ZMWs信噪比具有重要意義。

圖5 改進型ZMWs結(jié)構(gòu)示意圖Fig.5 Schematic diagram of improved ZMWs.

如上所述，大部分ZMWs的掩蓋層都是金屬，金屬層會對單分子熒光的壽命造成影響[39]，這可能是由于金屬的導電性導致電子泄露，進而對熒光分子造成非輻射性的損傷，同時金屬對光的吸收導致溫度升高也會對熒光壽命或信號質(zhì)量造成影響。為了克服金屬層的不足之處， Ono等[40]嘗試用全氟聚合物Cytop制備了ZMWs器件(見圖6)。這種新型聚合物ZMWs器件有望減少電子泄露及熱效應對單分子檢測的影響，但是具體應用效果有待進一步驗證。

圖6 全氟聚合物Cytop制備ZMWs工藝流程示意圖[40]Fig.6 Flow chart of ZMWs preparation using perfluoropolymers Cytop[40].

3 ZMWs在單分子檢測中的應用

3.1 單分子DNA測序

DNA測序技術經(jīng)過幾十年的發(fā)展，經(jīng)過了第一代、第二代及目前興起的第三代測序技術的發(fā)展歷程[41～43]。第一代測序技術即為統(tǒng)治了測序市場30年之久的特定克隆測序技術，由于這種技術可以對相對少量的特定位點、克隆產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物的序列進行測定，目前在實際工作中仍有應用。2005年出現(xiàn)的第二代高通量測序技術徹底改變了測序的規(guī)?；M程，使得以前遙不可及的基因組測序工作簡單到一個常規(guī)實驗室都可以進行，本研究小組也成功自主研制了基于焦磷酸測序原理的第二代基因測序儀，并進行了Glaciecolamesophilasp. nov.的全基因組測序和組裝[44]。雖然第二代測序技術在廣泛應用，但是其本身也有難以克服的技術瓶頸，例如需要經(jīng)過模板擴增，并且讀長較短。鑒于二代測序技術的不足，不經(jīng)過擴增、讀長長及通量高的第三代測序技術成為了新的挑戰(zhàn)，基于微納制造技術的納米微結(jié)構(gòu)器件則是第三代測序技術的的核心和技術難點[45]。

ZMWs作為一種能夠在生理濃度溶液中檢測單分子熒光的技術在第三代測序中受到了廣泛的關注。將ZMWs首次應用于單分子DNA測序[7]研究前，研究人員比較了在直徑43 nm ZMWs中獲得的熒光信號與在濃度為4 nmol/L的熒光染料分子溶液中采集的傳統(tǒng)衍射極限熒光相關光譜，結(jié)果顯示，ZMWs可以接受的溶液濃度大約比傳統(tǒng)衍射極限熒光相關光譜提高了3個數(shù)量級。同時，ZMWs具有很好的時間分辨率，在直徑分別為43 nm和66 nm的微孔中，熒光染料分子的滯留時間僅為幾個微秒，要比傳統(tǒng)衍射極限熒光相關光譜檢測過程中的滯留時間縮短了一個數(shù)量級，同時還比大多數(shù)酶反應速率快3個數(shù)量級，因此在ZMWs檢測單分子熒光過程中很容易區(qū)分自由擴散至觀測體積內(nèi)的染料分子與吸附在酶分子上的染料分子所發(fā)出的熒光。因此，在驗證了ZMWs可以在高濃度溶液中高時間分辨率識別單分子熒光信號的能力后，Levene等[7]利用ZMWs觀測了聚合酶合成DNA雙鏈的過程，首先將單個T7 DNA聚合酶通過物理吸附的方式固定在納米孔底部，然后注入能夠保證M13DNA進行有效連續(xù)合成反應的各種試劑，其中以香豆素-dCTP代替dCTP。隨后單個ZMWs納米孔中的熒光持續(xù)時間被觀測到，全部聚合反應時間大約30 min，每秒鐘大約有1～3次的光閃爍，代表每秒約有1～3個dCTP結(jié)合至模板上，這一結(jié)果與在本體溶液中的合成速率一致的(每秒約為10～15 bp)，同時與模板上平均含有約20%的鳥嘌呤的含量是一致的。雖然以上實驗結(jié)果在實際測序過程中有待進一步的優(yōu)化，但是已經(jīng)為ZMWs在單分子DNA測序的應用開創(chuàng)了先例。

Pacific Biosiences公司在以上研究成果的基礎上對ZMWs應用于單分子DNA測序的技術進行了進一步研究[46～48]，并推出了商品化單分子DNA測序儀(single molecule real time，SMRT)。SMRT技術的具體原理如圖7(彩圖見圖版二)所示：在測序過程中，由固定的酶根據(jù)單鏈DNA模板合成雙鏈。每次加入一個堿基，聚合酶捕獲具有熒光標記的dNTP，并將其帶到檢測區(qū)間，產(chǎn)生熒光光曝，光曝的熒光顏色就揭示了模板上的互補堿基。通過連續(xù)實時監(jiān)控每個波導孔的熒光光曝，就快速測定了每一個孔內(nèi)DNA模板的序列。這種利用ZMW進行的單分子實時檢測技術在高速測序、長序列產(chǎn)出和低成本方面有著巨大的潛力。不過與其他單分子測序平臺一樣，實時檢測單個分子對于提高原始數(shù)據(jù)準確率是一個挑戰(zhàn)，并可能成為一個障礙，還需要更進一步的改進。

圖7 Pacific Biosiences公司單分子DNA測序技術(SMRT)原理示意圖[47].Fig.7 Schematic diagram of single molecule real time (SMRT) sequencing technology principle from Pacific Biosiences company[47].(彩圖見圖版二)

2014年，Stanford大學的Chen等[49]聯(lián)合Pacific Biosiences公司對單分子DNA測序設備進行了改進，主要是進行單分子熒光的相關研究。Pacific Biosiences公司開發(fā)的基于ZMWs器件的單分子DNA測序設備在測序過程中試劑及芯片準備過程大約耗時1.5 h，同時芯片和激光的對準過程大約需要15 min，其中在圖像獲取之前試劑要暴露在激光照射下大約2 min，這一過程并不適合單分子熒光研究，因為2 min的激光照射將會漂白大部分固定在ZMWs底床的單分子熒光，針對這些問題， Chen等將設備進行了改進，將單分子熒光的前期準備過程由原來的1.5 h改進為60 s，利用新的芯片與激光對準方法大大減少了激光對于熒光基團的漂白作用，同時對設備的軟件進行了修改，使其更加適合單分子熒光實驗過程中的操作和分析。經(jīng)過以上改進，將基于ZMWs的單分子DNA測序設備改為能夠廣泛使用的單分子熒光分析系統(tǒng)，具有便于使用、高時間靈敏度、高光譜分辨率、高信號靈敏度以及高的熒光染料分子光穩(wěn)定性的特性，能夠進行單分子之間的瞬態(tài)結(jié)合及解離過程表征，能夠長時間觀測微弱熒光能量轉(zhuǎn)移引起的分子構(gòu)象變化等，必將會有力促進高通量研究生物單分子的相關研究工作進展。

3.2 生物膜研究

ZMWs在生物研究體系中的一個重要應用是研究生物膜，例如脂質(zhì)膜與細胞膜，這兩種膜在活細胞與其所在環(huán)境的相互作用過程中扮演著非常重要的角色[50]，其工作機理的研究和分析對于人們進一步理解細胞的功能具有重要意義。傳統(tǒng)研究脂質(zhì)膜及細胞膜的光學方法是利用熒光相關光譜[51，52]、全內(nèi)反射熒光顯微鏡[53，54]和熒光光致漂白恢復[55]等技術，但是這些技術都受到光學衍射極限的限制不能在生理濃度環(huán)境中進行單分子水平研究。ZMWs作為一種能夠在生物體系相等濃度的溶液體系中進行單分子檢測的技術，在提出不久后就被人們用于生物膜的相關研究工作中。

2005年，Edel等[56]研究了帶有熒光標記細胞膜的大鼠嗜堿性粒細胞性白血病細胞(Basophilleukemiacells of rats，RBL)在ZMWs器件表面的擴散行為(圖8A)。由于RBL具有很好的黏附性，因此不需要任何外界作用即可黏附在ZMWs結(jié)構(gòu)的金屬層表面，通過熒光強度的變化發(fā)現(xiàn)，當細胞剛剛進入ZMWs微孔時，20 s內(nèi)只能捕獲到約兩次發(fā)光，1.5 h后20 s內(nèi)發(fā)光次數(shù)增加至22次，這一結(jié)果證明細胞不僅可以依照ZMWs微孔的形狀進入到微孔而且進入的深度足以使細胞膜上的熒光基團受到激發(fā)。這一結(jié)果的發(fā)現(xiàn)為進一步利用ZMWs研究細胞膜內(nèi)蛋白質(zhì)的動力學過程及細胞內(nèi)的抗體受體結(jié)合過程等奠定了基礎。2006年，該小組又通過囊泡融合的方法在ZMWs納米結(jié)構(gòu)上制備了脂質(zhì)膜[29](圖8B)，在實驗中發(fā)現(xiàn)凝膠態(tài)的脂質(zhì)膜很難進入ZMWs納米微孔，而在液相中的脂質(zhì)膜則能夠順利進入ZMWs納米微孔的觀測體積中。隨后他們利用ZMWs在高濃度破傷風毒素C碎片的溶液中測定了破傷風毒素C碎片與神經(jīng)節(jié)苷脂GT1b的平衡結(jié)合常數(shù)。傳統(tǒng)的測定平衡常數(shù)的生化技術包括離心、平衡滲析及熒光檢測等步驟，一般需要幾小時至幾天時間完成。相比之下，利用ZMW技術需要的試劑量更少，同時實驗步驟更加簡單，幾分鐘之內(nèi)即可完成實驗。這項對ZMWs結(jié)構(gòu)上形成的脂質(zhì)膜進行的系統(tǒng)表征和理論分析的研究對于利用ZMWs研究生物膜的硬度及抗彎模數(shù)等特征具有重要指導意義，同時也為在生理濃度中研究單個膜蛋白分子提供了一種新的思路。

圖8 大鼠嗜堿性粒細胞性白血病細胞在ZMWs器件表面的擴散行為[29,56]Fig.8 Dispersal behavior of RBL cell on ZMWs device surface[29,56].A.利用ZMWs器件檢測DiI-C18標記大鼠嗜堿性粒細胞性白血病細胞(RBL)的結(jié)構(gòu)示意圖，RBL細胞約為15 μm；B. ZMWs器件表面覆蓋雙脂膜示意圖

幾乎同期，Wenger等[57]也在ZMWs上制備了脂質(zhì)膜，并發(fā)現(xiàn)熒光基團的擴散時間與ZMWs結(jié)構(gòu)上納米微孔的面積具有一定的線性關系，這一結(jié)果表明擴散行為主要是在二維空間進行的，并受到微孔尺寸的限制。通過改變ZMWs納米微孔的直徑大小發(fā)現(xiàn)直徑為150 nm的微孔的熒光發(fā)光效率是直徑范圍在250～400 nm的微孔的2倍，這一熒光增加現(xiàn)象與Rigneault等[27]報道的在150 nm的ZMWs微孔中熒光素羅丹明-6G分子的熒光強度得到了6.5倍的增強實驗現(xiàn)象是一致的，脂質(zhì)膜進入納米孔可能是造成這一現(xiàn)象的原因。

細胞質(zhì)膜是一種復雜溶液的交界面，富含了眾多的脂類物質(zhì)、蛋白質(zhì)等，不僅是細胞的天然包膜，同時還是細胞與外界環(huán)境相互作用的聚集地[50]。因此研究活細胞內(nèi)細胞質(zhì)膜中分子間的相互作用成為了生物學研究的重大課題。Jose等[58]利用電鏡和ZMWs熒光光譜研究了細胞質(zhì)膜在ZMWs結(jié)構(gòu)上的擴散行為，細胞質(zhì)膜可能完全凹陷到ZMWs的納米孔中，也可能橫跨在納米孔上方，為了評估細胞質(zhì)膜進入微孔的概率，他們對細胞進行熒光標記，然后將細胞黏附在ZMWs器件表面，最后獲取ZMWs芯片的熒光照片，同時以直徑為500 nm的熒光乳膠微球在ZMWs器件表面進行參照實驗，如圖9所示。細胞對于芯片的表面覆蓋度約為50%±10%，實驗中發(fā)出熒光的納米孔個數(shù)比例為20%～25%，結(jié)果說明不是所有覆蓋在芯片表面的細胞都能夠與納米孔底部接觸，細胞質(zhì)膜進入納米孔的幾率大約50%左右。進一步研究證明細胞質(zhì)膜能夠通過膜的擴張作用進入到ZMWs微孔中，通過分析認為膜的進孔過程主要是受到細胞支架成分的驅(qū)動，類似于絲狀物質(zhì)的擴展過程。這一結(jié)果為人們認識細胞之間及細胞與表面之間的相互作用提供了一種新的思路。同時還從單分子分辨率水平分析了細胞膜內(nèi)組分的動力學過程。

圖9 細胞質(zhì)膜進入ZMWs器件微孔的概率[58]Fig.9 Probability of the cell membrane into the pores of the ZMWs device[58].A. 在實驗中充當未進入微孔底部的熒光物質(zhì)參照；B. ZMWs器件頂部微球熒光圖片；C. 細胞膜進入ZMWs器件底部示意圖;D. ZMWs器件底部由激發(fā)光消逝場激發(fā)的細胞膜熒光圖片，該熒光強度是微球在ZMWs器件底部的熒光強度值的100倍。

同期，Wenger等[59]也利用ZMWs研究了COS-7細胞的細胞質(zhì)膜中的熒光脂質(zhì)膜類似物Bodipy-PC、Bodipy-GM1、熒光蛋白GPI-GFP及轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的擴散行為。通過實驗發(fā)現(xiàn)，Bodipy-PC在微孔中的擴散時間與微孔的面積成正比，沒有受到阻擋，而Bodipy-GM1、GPI-GFP及TfR的擴散受到了阻擋，對GPI-GFP及TfR的受阻原因進行了分析說明，認為GPI-GFP的受阻主要是細胞質(zhì)膜中的膽固醇成分造成，他們將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽甾烯酮，之后發(fā)現(xiàn)GPI-GFP的擴散時間與微孔面積成線性關系，說明GPI-GFP的擴散行為與細胞質(zhì)膜中的膽固醇成分有很大關系，這一結(jié)論在其他論文中也得到了證實[60～62]。而對于TfR，主要是由于細胞質(zhì)膜的細胞骨架形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)阻礙了其擴散過程。

通過以上的研究工作，人們已經(jīng)證實細胞膜能夠擴散至ZMWs微孔中，同時利用ZMWs可以對細胞膜上的蛋白質(zhì)分子的擴散行為進行研究。在此基礎上，Richards等[62]提出了ZMWs在細胞膜內(nèi)新的應用方向，即在細胞膜內(nèi)測定單個受體分子的化學計量比，同時還可以用來測定藥理學作用對受體分子化學計量比的影響。在實驗中通過利用ZMWs納米微孔孤立了細胞膜上的單個受體分子(圖10)，然后利用一步熒光猝滅法識別受體分子的熒光分子數(shù)量，并對乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)的化學計量比進行了分析。nAChRs是其構(gòu)成單元α1～α10與β2～β4的五聚物組合體，Richards等主要對其中α4與β4的化學計量比進行了分析，分別對綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標記的α4與未標記的β4形成的組合體α4-(GFP)+β4，及未標記的α4與熒光標記的β4形成的組合體α4+ β4-(GFP)進行熒光檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在α4-(GFP)+β4體系中約80%的受體分子熒光分子是分三步猝滅，代表的化學計量比是(α4)3(β4)2，約20%的熒光受體分子是分兩步猝滅，代表的化學計量比是(α4)2(β4)3。在α4+ β4-(GFP)體系中，小于30%的熒光是三步猝滅，70%的熒光是兩步猝滅，因此說明大部分α4與β4的五聚體化學計量比是(α4)3(β4)2，而(α4)2(β4)3大約占20%～30%。在以上兩個系統(tǒng)中，得到的α4與β4的五聚體的化學計量比結(jié)果基本相同，說明了利用ZMWs能夠有效測定部分生物分子的化學組成。利用ZMWs還分析測定了藥理作用對α4β2型nAChRs化學計量比的影響，首先對α4β2型nAChRs的化學計量比進行了測定，發(fā)現(xiàn)(α4)2(β2)3和(α4)3(β2)2所占比例幾乎相等，然后將其分別置于濃度為500 nmol/L的尼古丁及金雀花堿溶液中持續(xù)24 h，之后再對其進行化學計量比測定發(fā)現(xiàn)，置于尼古丁溶液中的nAChRs含有60%的(α4)2(β2)3，而置于金雀花堿溶液中的nAChRs只含有38%的(α4)2(β2)3，這一結(jié)果表明不同的溶液環(huán)境對于細胞膜中的nAChRs成分含量具有重大影響，同時也說明ZMWs能夠用來測定藥理學作用對受體分子化學計量比的影響。

圖10 細胞膜上單個nAChR受體分子進入ZMWs器件示意圖[62]Fig.10 Schematic diagram of the single nAChR molecules on cell membrane into the ZMWs device[62].注：整個細胞著床在ZMWs器件表面，細胞膜的一小部分進入到ZMWs器件納米孔中。

3.3 生物大分子之間的相互作用

傳統(tǒng)研究生物大分子之間相互作用的方法主要是用到落射熒光顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡和熒光共振能量轉(zhuǎn)移[2，63，64]，近些年表面等離子體共振傳感器作為一種在單分子層水平分析生物分子之間相互作用的工具也得到了廣泛的應用[65～67]。但是以上技術均無法有效地在高濃度溶液中觀測單個生物分子與其結(jié)合體的相互作用，測得的結(jié)果是生物分子相互作用的集群效應。自從Levene等[7]證實可以利用ZMWs在高濃度的溶液中觀測單個分子的熒光后，對于ZMWs體系用于生物大分子之間相互作用的研究工作也開始進行嘗試。為了能夠利用ZMWs高信噪比觀測單分子蛋白質(zhì)之間的相互作用，Miyake等[36]提出了一種新型的ZMWs結(jié)構(gòu)，如圖4所示，并利用其實時觀測了分子伴侶素GroEL與其輔助分子GroES之間的相互作用。在實驗過程中，首先將分子伴侶素GroEL固定在ZMWs結(jié)構(gòu)微孔底床，通過分析認為固定在微孔中的分子伴侶素GroEL 90%是單個分子，然后在濃度為5 μmol/L的Cy3標記的輔助分子GroES的溶液中，且溶液中混有ATP，進行了單分子熒光觀測，從熒光強度與時間的曲線圖看出GroES的結(jié)合—釋放過程能夠得到非常清楚的區(qū)分。通過分析認為GroEL釋放GroES的過程存在一個動力學過渡態(tài)，即整個釋放過程應該是分兩步進行的。為了驗證利用ZMWs所獲得的熒光亮暗過程持續(xù)時間確實是代表了GroES的結(jié)合—釋放過程以及GroEL釋放GroES的過程是否存在兩個動力學常數(shù)，在濃度為50 nmol/L的Cy3標記的輔助分子GroES的溶液中進行了實驗，50 nmol/L的濃度相當于單純利用全內(nèi)反射熒光顯微鏡能夠觀測到單分子GroES熒光信號的濃度，結(jié)果證明利用全內(nèi)反射熒光顯微鏡與ZMWs得到的結(jié)果得到了很好的吻合。隨后該小組還利用ZMWs詳細分析了GroEL的C-末端區(qū)對GroEL功能的作用，及GroEL-GroES結(jié)合體的衰變過程[37，68]。以上結(jié)果充分說明，利用ZMWs可以直接在微摩爾每升量級濃度的溶液中觀測和分析單分子蛋白質(zhì)間的相互作用，同時為在單分子水平分析生物大分子的工作機制提供了很好的研究思路。

3.4 單分子反應動力學

從單分子水平研究酶分子反應動力學過程可以獲得單個酶分子的內(nèi)在行為信息，而不是眾多酶分子行為的平均效應，因此對于人們進一步認識和理解酶分子的工作機理具有重要基礎意義。研究單分子酶動力學過程中的關鍵是維持其檢測環(huán)境濃度與其生理濃度盡量接近，這樣才能有效保證酶分子的動力學機制不受到破壞，得到的結(jié)果才有可能更接近生物體內(nèi)酶分子的實際工作機理。由于ZMWs能夠在高濃度溶液中有效檢測單分子，因此是研究單分子酶反應動力學的有力工具。Zhao等[24]利用以金為金屬層的ZMWs對單分子單體肌氨酸氧化酶(monomeric sarcosine oxidase)的動力學過程進行了研究。在實驗過程中，首先通過自組裝的方式在納米孔的金表面修飾巰基聚乙二醇，單個酶分子選擇性地固定在ZMWs的二氧化硅底床上。肌氨酸氧化酶的活性位點含有黃素腺嘌呤二核苷酸輔因子，因此氧化態(tài)酶會自發(fā)熒光，而還原態(tài)酶則不發(fā)光，隨著黃素在氧化還原過程中的變化，單分子熒光隨之進行明暗交替，每一個明暗過程的循環(huán)對應一次酶翻轉(zhuǎn)過程?；诖嗽恚謩e采用底物肌氨酸和左旋脯氨酸進行了酶動力學反應過程，結(jié)果顯示左旋脯氨酸濃度為500 μmol/L時，熒光平均持續(xù)時間為0.23 s，與50 μmol/L的肌氨酸相當，說明酶與兩種底物形成的復合體結(jié)構(gòu)是不同的，因而造成相同濃度底物時熒光持續(xù)的時間不同。對酶反應動力學過程的的分析顯示， 23個單體肌氨酸氧化酶的催化反應速率常數(shù)之間的差距最大能夠達到20多倍，協(xié)方差參數(shù)為隨機分布，因此可以認為該酶反應動力學過程具有靜態(tài)異質(zhì)性，存在動態(tài)無序性，原因可能是單個酶分子在ZMWs微孔中的空間取向分布不同，也可能是酶分子在微孔底床上的固定位置不同造成的。

還有人利用ZMWs對生物聚合反應動力學過程進行了研究，如Samiee等[23]利用熒光相關光譜在ZMWs中研究了噬菌體λ抑制蛋白質(zhì)CI的動力學過程。對于CI的齊聚反應動力學過程在Samiee等之前就有人進行了充分的研究[69]，并證明當CI濃度為100 nmol/L時主要是以二聚體的形式存在，當濃度高于1 μmol/L時，四聚體急劇增多，當濃度再高時四聚體迅速變?yōu)榘司垠w。從CI的聚合過程可以看出，當CI四聚體及八聚體出現(xiàn)時，反應液的濃度已經(jīng)遠遠高于單純的熒光相關光譜能夠檢測的濃度范圍(一般為納摩爾每升濃度量級)，因此Samiee等利用ZMWs在濃度約為1 μmol/L的溶液中對CI的齊聚反應中決定四聚體形成過程的結(jié)合常數(shù)KD2進行了計算和分析，并認為該常數(shù)與溫度具有一定的關系，同時表明CI八聚體形成過程的速率限定步驟是四聚體的形成。以上結(jié)論與Pray等[67]之前利用傳統(tǒng)工具獲得的結(jié)論是一致的，因此說明ZMWs是研究高濃度環(huán)境中生物聚合反應過程的有力手段。

RNA是自然界最忙碌的分子之一，其功能一度被認為只是貯存與傳送遺傳信息而已，不過現(xiàn)在已知它能完成其他多樣化的功能，從調(diào)控基因表達與其他維系生命所需的細胞程序到作為一種感應器。這個多才多藝的分子其中一項重要的功能就是蛋白質(zhì)翻譯過程，自20世紀以來，蛋白質(zhì)翻譯過程就已經(jīng)出現(xiàn)了許多重要的成果，一些已經(jīng)進行到了單分子水平[70]。但是由于受限于光學衍射極限，以往利用單分子熒光研究RNA反應動力學過程都是在熒光標記配體濃度為納摩爾每升量級的環(huán)境中，無法達到生理濃度范圍水平。2010年Uemura等[71]成功利用ZMWs在生理濃度水平實時觀測了單個核糖體將氨基酸串聯(lián)起來的動力學過程。這種方法不僅可以解析tRNA在翻譯過程中的具體結(jié)構(gòu)變化，而且還可以用來研究藥物對蛋白翻譯過程的影響。在實驗過程中首先將核糖體復合物固定在ZMWs微孔底床，核糖體復合物作為70S起始復合物包含有熒光標記的fMet-(Cy3)tRNAfMet，并且還添加了另外兩個利用不同染料標記的tRNA-Phe-(Cy5)tRNAPhe及Lys-(Cy2)tRNALys，這些tRNA與被檢測的mRNA編碼的氨基酸苯丙氨酸和賴氨酸同源。在實驗過程中，首先通過檢測fMet-(Cy3)tRNAfMet確定起始復合物，隨后通過特定顏色的熒光信號實時觀測Phe-(Cy5)tRNAPhe及Lys-(Cy2)tRNALys與核糖體的結(jié)合過程，這個過程受mRNA編碼的4種氨基酸(MFFF或MFKF)調(diào)控。利用這種方法可以在密碼子分辨率水平分析核糖體的翻譯動力學過程，也可以分析mRNA的基本序列，從而解析依賴于序列的翻譯行為。另外這個系統(tǒng)也可以被用來分析系列過程，從起始到框架轉(zhuǎn)換，以及包括真核生物的核糖體在內(nèi)的不同物種的核糖體。

大部分的ZMWs結(jié)構(gòu)均為圓形納米孔陣列，直徑在100 nm左右，但是這種結(jié)構(gòu)也限制了一些實驗的開展，例如分子馬達的反應過程觀測。直徑在100 nm左右的圓形納米孔僅僅能夠容納蛋白纖維絲，但是由于空間的限制無法進一步觀測其運動狀態(tài)。因此Elting等[72]開發(fā)了一種新型線性ZMWs，對肌球蛋白在蛋白纖維絲上的運動進行了單分子熒光檢測。線性ZMWs結(jié)構(gòu)就像一個窄長形的溝道，長度大約幾個微米，以偏振光為激發(fā)光源，仍能將激發(fā)光限制在ZMWs結(jié)構(gòu)底部，如圖11所示。在實驗過程中首先將肌球蛋白纖維固定在線性ZMWs底床，然后加入熒光標記的肌動蛋白V和ATP，從熒光圖片上可以看出肌球蛋白的移動距離大于1 μm，肌球蛋白的長度為36 nm，1 μm的距離相當于肌球蛋白沿著蛋白纖維移動了至少30步。這種新型線性ZMWs結(jié)構(gòu)突破了傳統(tǒng)ZMWs體積對生物分子的限制，同時給分子馬達的研究提供了一種新的思路和方法。

圖11 線性ZMWs結(jié)構(gòu)示意圖，肌球蛋白沿著蛋白纖維在ZMWs線性納米通道移動[72]。Fig.11 Diagram of linear ZMWs structure，myosin move along protein fibers in linear ZMWs nanochannel[72].注：由于納米通道的寬度小于激光光波長，偏振激發(fā)光體積在垂直和通道的長度方向均受到限制。

4 展望

ZMWs作為一種單分子檢測工具，通過納米孔結(jié)構(gòu)將觀測體積減小至仄升量級，突破了光學衍射極限的限制，能夠在生理濃度水平溶液中有效觀測單分子熒光，可以檢測的溶液濃度范圍比傳統(tǒng)光學設備提高了3～6個數(shù)量級。該方法自2003年被提出之后，在短短的9年之內(nèi)，從制備工藝到具體應用都受到了人們的極大關注，并在分子生物學領域得到了科研工作者的青睞和廣泛使用。目前基于ZMWs原理研發(fā)的單分子測序系統(tǒng)已經(jīng)進入市場，ZMWs在生物膜、生物大分子間相互作用及酶動力學等方面的研究成果表明ZMWs可以應用于更多的生物體系研究中。有理由相信ZMWs在日益活躍的單分子研究領域必將發(fā)揮更大的作用，成為人們在單分子水平進一步研究和認識生物分子工作機制的有力研究工具。

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Zero-Mode Waveguides: the Principle, Fabrication and Application in Detection of Single Fluorescent Molecules

WEI Qing-quan1,3, LI Yun-tao1,3, REN Lu-feng2,3, ZHOU Xiao-guang1,3, YU Yu-de1,3

1.StatekeylaboratoryofIntegratedOptoelectronics,InstituteofSemiconductors,ChineseAcademyofSciences,Beijing100083,China;2.TheDNASequencingTechnologiesR&Dcenter,BeijingInstituteofGenomics,ChineseAcademyofSciences,Beijing100029,China;3.TheJointLaboratoryofBioinformationAcquisitionandSensingTechnology,InstituteofSemiconductors,BeijingInstituteofGenomics,ChineseAcademyofSciences,Beijing100083,China

Techniques for single fluorescent molecules detection have garnered a great amount of interests from science community in recent years largely due to their ability to reveal the individual molecular properties and behaviors which were often obscured by techniques based on ensemble average. In order to overcome diffraction-limit of optical observation, fluorescent molecules must be diluted to a very low concentration-way below normal physiological concentration. However, this may adversely impact the kinetics for the chemical or biochemical reaction under study. Zero-mode waveguides(ZMWs), as a new kind of single fluorescent molecule detection device, effectively reduce the observation volume to the level of zeptoliter (10-21L), which is much lower than optical diffraction-limited volume, by utilizing of a nanoaperture structure. The zeptoliter-observation volume provides an environment where a single fluorescent molecule can be observed at normal physiological concentration. The ZMWs have been extensively used in the field of single fluorescent molecule detection due to its outstanding performance than diffraction-limited optics.Therefore we provided an overview of ZMWs, including discussions on its principle, fabrication techniques, and applications in DNA sequencing, biomembrane structure elucidation, biomacromolecule interaction studies and kinetics study of single-molecule reaction.

zero-mode waveguides；single molecule；nano microstructure devices

2014-11-25; 接受日期：2014-12-04

國家自然科學基金項目(31200643，61275064)資助。

魏清泉，副研究員，博士，主要從事基因測序、單分子熒光檢測及生物傳感器研究。Tel:010-82304482;E-mail：qingquanwei@semi.ac.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.01.02