鎂離子對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化相關(guān)因子表達(dá)的影響

白亞玲，徐金升，靳晶晶，張俊霞，張勝雷，崔立文，張慧然

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·論著·

鎂離子對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化相關(guān)因子表達(dá)的影響

白亞玲，徐金升，靳晶晶，張俊霞，張勝雷，崔立文，張慧然

目的 探討鎂離子對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)鈣化相關(guān)因子表達(dá)水平的影響。方法 選擇5周齡健康雄性SD大鼠6只。以組織貼壁法進(jìn)行原代VSMCs培養(yǎng)，至3～5代時(shí)用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。將VSMCs采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、高磷組(加入10 mmol/L β-甘油磷酸)、鎂干預(yù)組〔加入10 mmol/L β-甘油磷酸+3 mmol/L硫酸鎂(MgSO4)〕、2-氨基乙氧基二苯基硼酸(2-APB)干預(yù)組(10 mmol/L β-甘油磷酸+3 mmol/L MgSO4+10-4μmol/L 2-APB)。采用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)14 d后鈣化情況，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)14 d后堿性磷酸酶(ALP)活性，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)0、3、6、10、14 d時(shí)細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)G蛋白(MGP)mRNA和骨橋蛋白(OPN)mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，4組鈣水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=409.800，P<0.05)；高磷組、2-APB干預(yù)組鈣水平高于正常對(duì)照組和鎂干預(yù)組 (P<0.05)。4組ALP活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=490.901，P<0.05)；高磷組、2-APB干預(yù)組ALP活性高于正常對(duì)照組和鎂干預(yù)組 (P<0.05)。培養(yǎng)14 d后，4組MGP mRNA和OPN mRNA的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 279.905、1 157.247，P<0.05)；鎂干預(yù)組MGP mRNA和OPN mRNA的表達(dá)水平高于高磷組及2-APB干預(yù)組 (P<0.05)。動(dòng)態(tài)觀察MGP mRNA和OPN mRNA的表達(dá)變化，結(jié)果顯示在培養(yǎng)第3天時(shí)，高磷組MGP mRNA和OPN mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05)，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；鎂干預(yù)組MGP mRNA和OPN mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05)，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。結(jié)論 高濃度鎂離子在抑制VSMCs鈣化過程中可上調(diào)MGP及OPN的表達(dá)，并呈一定時(shí)間依賴性，為臨床進(jìn)一步研究提供了參考依據(jù)。

肌細(xì)胞,平滑肌；β-甘油磷酸鹽；鎂離子；血管鈣化；基質(zhì)G蛋白；骨橋蛋白質(zhì)

白亞玲，徐金升，靳晶晶，等.鎂離子對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化相關(guān)因子表達(dá)的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(6)：665-668.[www.chinagp.net]

Bai YL,Xu JS,Jin JJ,et al.Effect of magnesium on factors related to calcification in rat vascular smooth muscle cells[J].Chinese General Practice，2015，18(6)：665-668.

血管鈣化是慢性腎衰竭患者體內(nèi)常見的病理現(xiàn)象，已成為增加心血管疾病發(fā)病率及病死率的重要原因之一[1]。鎂離子是體內(nèi)重要的陽離子，對(duì)維持血管彈性有重要作用[2]，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)鎂離子可在一定程度上抑制高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)鈣化和成骨樣轉(zhuǎn)分化，其可能是通過抑制VSMCs中骨源性相關(guān)因子的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)[3]。而研究表明，血管鈣化形成過程中除鈣化相關(guān)促進(jìn)因子(如骨源性相關(guān)因子)表達(dá)水平增加外，還伴有相關(guān)抑制因子表達(dá)水平降低[4]。因此，本研究以VSMCs鈣化為模型，研究鎂離子對(duì)VSMCs鈣化相關(guān)的抑制因子—基質(zhì)G蛋白(MGP)和骨橋蛋白(OPN)表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選擇5周齡健康雄性SD大鼠6只，體質(zhì)量80～100 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Hyclone公司,DMEM培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle′s medium)購自美國GIBCO公司，兔抗鼠平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體購自北京博奧森生物有限公司，免疫組化試劑盒購自上海博海生物有限公司，β-甘油磷酸及2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯(2-APB)購自美國Sigma 公司，堿性磷酸酶(ALP)活性試劑盒購自南京建成生物工程研究所，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購自美國Fermentas公司，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，鈣測(cè)定試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司，二喹啉甲酸(bicinchoninicacid,BCA)蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Sheldon公司,RT-PCR儀購自美國Abi公司。

1.3 方法

1.3.1 原代VSMCs培養(yǎng)及鑒定 以組織貼壁法進(jìn)行原代VSMCs培養(yǎng)。原代VSMCs形態(tài)學(xué)觀察：應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞大小、形態(tài)、生長(zhǎng)特點(diǎn)及排列方式等。免疫組化法染色：6孔板內(nèi)用消毒的蓋玻片制作細(xì)胞爬片，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至60%～70%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用免疫組化法鑒定VSMCs特異性抗體A-SMA actin，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素輕度復(fù)染，經(jīng)分化、脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察，胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)為強(qiáng)陽性，并可見棕黃色的免疫產(chǎn)物可判定為陽性結(jié)果,當(dāng)細(xì)胞隨傳代而自行純化時(shí)，細(xì)胞理化性質(zhì)無明顯改變。原代VSMCs傳代培養(yǎng)至3～5代時(shí)用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及造模 將VSMCs采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：(1)正常對(duì)照組：加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)；(2)高磷組：在正常對(duì)照組培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入10 mmol/L β-甘油磷酸誘導(dǎo)鈣化；(3)鎂干預(yù)組：高磷組培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入3 mmol/L硫酸鎂(MgSO4)溶液；(4)2-APB干預(yù)組：在鎂干預(yù)組培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入10-4μmol/L 2-APB。

1.3.3 VSMCs鈣化及ALP活性測(cè)定 采用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法檢測(cè)細(xì)胞鈣化情況：細(xì)胞培養(yǎng)14 d后棄去上清液，加入0.6 mol/L鹽酸溶液37 ℃脫鈣過夜，取上清液測(cè)鈣水平，再用0.1 mol/L氫氧化鈉(NaOH)和0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液溶解細(xì)胞30 min，BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白水平，結(jié)果用細(xì)胞鈣水平比蛋白水平表示(mg/g蛋白)。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)ALP活性：細(xì)胞培養(yǎng)14 d后棄去上清液，依據(jù)ALP活性試劑盒測(cè)定其活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果為3次平均值。

1.3.4 RT-PCR法檢測(cè)VSMCs MGP mRNA和OPN mRNA的表達(dá) 分別提取0、3、6、10、14 d時(shí)正常對(duì)照組、高磷組、鎂干預(yù)組以及14 d時(shí)2-APB干預(yù)組細(xì)胞的總mRNA，測(cè)定MGP和OPN的表達(dá)。PCR引物由Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，MGP上游引物為：5′-AAAGCCCAGGAAAGAGTCCG-3′，下游引物為：5′-TCTTATTTGGCTCCTCGGCG-3′；OPN上游引物為：5′-ATGCTATCGACAGTCAGGCG-3′，下游引物為：5′-GCTCAGGGCCCAAAACACTA-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酸(GAPDH)上游引物為：5′-CCCACTAAAGGGCATCCTGG-3′，下游引物為：5′-GGCCCCTCCTGTTGTTATGG-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，MGP 55 ℃、OPN 56 ℃ 、GAPDH 57 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s(共35個(gè)循環(huán))；最后72 ℃延伸10 min。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果為3次平均值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠VSMCs原代培養(yǎng)及鑒定 大鼠胸主動(dòng)脈組織塊貼壁3～4 d后可見細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，呈束狀排列，6～7 d后融合成片，細(xì)胞呈星形或不規(guī)則形，以梭形為主，相互重疊生長(zhǎng)。細(xì)胞質(zhì)A-SMA actin表達(dá)強(qiáng)陽性，呈棕黃色(見圖1)。

圖1 大鼠VSMCs細(xì)胞質(zhì)A-SMA actin表達(dá)情況(免疫組化染色法，×200)

Figure 1 The rat VSMCs cytoplasmic expression of A-SMA actin

2.2 4組鈣水平及ALP活性比較 細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，4組鈣水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=409.800，P<0.05)；高磷組、2-APB干預(yù)組鈣水平高于正常對(duì)照組和鎂干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4組ALP活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=490.901，P<0.05)；高磷組、2-APB干預(yù)組ALP活性高于正常對(duì)照組和鎂干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

2.3 4組MGP mRNA及OPN mRNA的表達(dá)水平比較 培養(yǎng)14 d后，4組MGP mRNA和OPN mRNA的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 279.905、1 157.247，P<0.05)；鎂干預(yù)組MGP mRNA和OPN mRNA的表達(dá)水平高于高磷組及2-APB干預(yù)組 (P<0.05，見圖3)。動(dòng)態(tài)觀察MGP mRNA和OPN mRNA的表達(dá)變化，結(jié)果顯示在培養(yǎng)第3天時(shí)，高磷組MGP mRNA和OPN mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05)，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；鎂干預(yù)組MGP mRNA和OPN mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05)，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)(見圖4)。

注：ALP=堿性磷酸酶；A為正常對(duì)照組，B為高磷組，C為鎂干預(yù)組，D為2-APB干預(yù)組；與正常對(duì)照組比較，△P<0.05；與鎂干預(yù)組比較，▲P<0.05

圖2 培養(yǎng)14 d后4組細(xì)胞鈣水平及ALP活性的比較

Figure 2 Comparison of the calcium levels and ALP activity in the four groups after incubation for 14 days

注：MGP=基質(zhì)G蛋白，OPN=骨橋蛋白；A為正常對(duì)照組；B為高磷組；C為鎂干預(yù)組；D為2-APB干預(yù)組；與鎂干預(yù)組比較，△P<0.05

圖3 培養(yǎng)14 d后4組MGP mRNA及OPN mRNA的表達(dá)水平比較

Figure 3 Comparison of the expression of MGP mRNA and OPN mRNA in the four groups after incubation for 14 days

注：與正常對(duì)照組比較，△P<0.05；與高磷組比較，○P<0.05

圖4 不同時(shí)間段MGP mRNA和OPN mRNA的表達(dá)水平比較

Figure 4 Comparison of the expression of MGP mRNA and OPN mRNA in the four groups in different time

3 討論

血管鈣化在慢性腎臟病患者中普遍存在，研究表明與慢性腎臟病相關(guān)的鈣化主要是血管中膜鈣化[5]，其主要表現(xiàn)為血管壁僵硬度增加，順應(yīng)性減低，從而引起心肌缺血、心力衰竭，是導(dǎo)致慢性腎臟病患者心血管高發(fā)病率和高病死率的重要原因之一。鎂離子作為人體所必需的重要元素，具有重要的生理功能，如作為酶的輔助因子調(diào)節(jié)酶活性，同時(shí)還對(duì)血管壁內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用，因此鎂離子與血管鈣化的關(guān)系近年來受到人們的關(guān)注。Spiegel等[6]最近一項(xiàng)隨訪18個(gè)月的臨床研究發(fā)現(xiàn)，碳酸鎂可以阻止冠狀動(dòng)脈鈣化的進(jìn)展。筆者之前的基礎(chǔ)研究亦發(fā)現(xiàn)鎂離子對(duì)高磷誘導(dǎo)的血管鈣化有一定抑制作用[3]。本研究進(jìn)一步向鎂干預(yù)組加入了鎂離子通道抑制劑，阻止鎂離子進(jìn)入細(xì)胞，結(jié)果顯示2-APB干預(yù)組鈣水平高于鎂干預(yù)組，提示其明顯減弱了鎂離子對(duì)高磷誘導(dǎo)VSMCs鈣化的抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)鎂離子對(duì)VSMCs鈣化具有強(qiáng)效的拮抗作用。

然而，鎂離子抑制血管鈣化的具體機(jī)制目前尚不清楚。眾所周知，血管鈣化是類似于骨形成的高度可調(diào)控的細(xì)胞介導(dǎo)的主動(dòng)過程[7]。研究表明，在血管鈣化形成過程中除鈣化相關(guān)促進(jìn)因子(如骨源性相關(guān)因子)表達(dá)水平增加外，還伴有相關(guān)抑制因子表達(dá)水平的降低[4]。MGP廣泛分布于軟骨、心、血管及肺等組織中，是軟骨內(nèi)骨形成和血管內(nèi)異位鈣化的重要調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)，MGP基因敲除的小鼠模型出生后不久即出現(xiàn)嚴(yán)重血管鈣化，2個(gè)月后因動(dòng)脈鈣化破裂而死亡[8]。MGP可與骨形態(tài)發(fā)生蛋白2結(jié)合，拮抗其促進(jìn)動(dòng)脈鈣化的作用[9]。OPN是一種廣泛表達(dá)于骨、軟骨、腎臟等組織的分泌糖基化磷酸蛋白?，F(xiàn)有報(bào)道表明，OPN具有很強(qiáng)的抑制血管鈣化的作用，與僅缺乏MGP的小鼠相比，缺乏OPN及MGP兩種基因的小鼠更早出現(xiàn)動(dòng)脈鈣化，并且動(dòng)脈鈣化率是前者的2倍[10]。本研究表明，VSMCs鈣化伴隨MGP mRNA及OPN mRNA的表達(dá)水平下降，提示內(nèi)源性抗鈣化能力減弱在血管鈣化的發(fā)生中起重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，給予鎂離子干預(yù)后可明顯上調(diào)MGP mRNA及OPN mRNA的表達(dá)水平，而給予鎂通道抑制劑后這種效果即消失，提示鎂離子可增強(qiáng)內(nèi)源性抗鈣化能力來抑制鈣化；隨后動(dòng)態(tài)觀察了鎂離子上調(diào)MGP及OPN的特點(diǎn)，結(jié)果顯示在培養(yǎng)第3天時(shí)，高磷組MGP mRNA和OPN mRNA表達(dá)水平均降低，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；鎂干預(yù)組MGP mRNA和OPN mRNA表達(dá)水平均升高，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，提示鎂離子增強(qiáng)內(nèi)源性抗鈣化系統(tǒng)的作用呈一定的時(shí)間依賴性。

總之，本研究進(jìn)一步證實(shí)高濃度鎂離子對(duì)血管鈣化具有強(qiáng)效的抑制作用，而上調(diào)內(nèi)源性鈣化拮抗系統(tǒng)可能是其重要的作用機(jī)制之一。但本研究?jī)H局限于體外細(xì)胞水平，而其在人體如何，尚有待進(jìn)一步設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)觀察鎂離子對(duì)血管鈣化相關(guān)鈣化因子表達(dá)水平的影響。

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修回日期：2014-12-21)

(本文編輯：李婷婷)

Effect of Magnesium on Factors Related to Calcification in Rat Vascular Smooth Muscle Cells

BAIYa-ling,XUJin-sheng,JINJing-jing,etal.

DepartmentofNephrology,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

Objective To investigate the effect of magnesium on the expression of factors related to calcification in rat vascular smooth muscle cells (VSMCs).Methods A total of 6 healthy SD rats aged 5 weeks were selected.VSMCs were primarily cultured in vitro using tissue block adhering wall method,and the third to fifth generation was used for cell experiment.The VSMCs were randomly divided into control group,high phosphorus group (10 mmol/L β-glycerophosphate),magnesium intervention group (10 mmol/L β-glycerophosphate and 3 mmol/L MgSO4),2-APB intervention group (10 mmol/L β-glycerophosphate,3 mmol/L MgSO4and 10-4μmol/L 2-APB).After culturing for 14 days,calcification was detected with OCPC method and the activity of alkaline phosphatase was detected with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method.The expression of matrix gla protein (MGP) mRNA and osteopontin (OPN) mRNA on 0,3,6,10 and 14 days were detected by RT-PCR method.Results After culturing for 14 days,the four groups showed statistically significant differences in calcification level (F=409.800,P<0.05),with the high phosphorus group and 2-APB intervention group significantly higher than the control group and magnesium intervention group (P<0.05).The four groups showed statistically significant differences in ALP activity (F=490.901,P<0.05),with the high phosphorus group and 2-APB intervention group significantly higher than the control group and magnesium intervention group (P<0.05).The four groups showed statistically significant differences in the expression of MGP mRNA and OPN mRNA (F=1 279.905,1 157.247,P<0.05),with the magnesium intervention group significantly higher than the phosphorus group and 2-APB intervention group (P<0.05).Dynamic observation showed that the expression of MGP mRNA and OPN mRNA decreased after culturing for three days (P<0.05) and the decrease was in a time dependent manner.However,the expression of MGP mRNA and OPN mRNA in magnesium intervention group increased (P<0.05) in a time dependent manner.Conclusion Magnesium may up-regulate the expression of MGP and OPN in a time dependent manner in inhibiting the calcification of VSMCs,providing a reference for further clinical study.

Myocytes,smooth muscle；β-glycerophosphate;Magnesium；Vascular calcification；Matrix gla protein；Osteopontin

項(xiàng)目：河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2012206157)

050011 河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腎內(nèi)科

徐金升，050011 河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腎內(nèi)科；E-mail：xjs5766@126.com

R 692.5

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.06.013

2014-09-21；