天然牛磺酸對(duì)肝硬化大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

文 彬，陳 然，彭佩純，鄧 鑫

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·論著·

天然牛磺酸對(duì)肝硬化大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

文 彬，陳 然，彭佩純，鄧 鑫

目的 探討天然牛磺酸對(duì)肝硬化大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)過(guò)氧化的影響。方法 將80只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(A組)15只和造模組60只。采用復(fù)合因素法制備肝硬化大鼠模型，造模成功后，造模組大鼠重新采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(B組，20只)、合成?；撬嶂委熃M(C組，20只)及天然?；撬嶂委熃M(D組，20只)。硫代巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定肝線粒體、微粒體丙二醛(MDA)的含量，鄰苯三酚自氧化法測(cè)定肝線粒體、微粒體超氧化物歧化酶(SOD)活性，蘇木素-伊紅染色法(HE)觀察肝臟病理學(xué)改變，透視電鏡下觀察肝臟超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 與A組比較，B組大鼠MDA含量增加，SOD活性下降(P<0.01)，肝組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)損害嚴(yán)重；與B組比較，C、D組大鼠MDA含量降低，SOD活性升高(P<0.01)，肝臟線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等超微結(jié)構(gòu)明顯改善。與C組比較，D組大鼠MDA含量降低、SOD活性升高(P<0.01)。結(jié)論 天然牛磺酸可以增強(qiáng)機(jī)體抗氧化損傷能力，對(duì)肝臟線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器具有保護(hù)作用。

?；撬?；肝硬化；丙二醛；超氧化物歧化酶

文彬，陳然，彭佩純，等.天然牛磺酸對(duì)肝硬化大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)過(guò)氧化的影響[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(6)：661-664.[www.chinagp.net]

Wen B,Chen R,Peng PC,et al.Effect of natural taurine on liver ultrastructure and lipid peroxidation in rats with cirrhosis[J].Chinese General Practice，2015，18(6)：661-664.

肝硬化涉及肝細(xì)胞損傷、增殖、凋亡等復(fù)雜過(guò)程，脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積是導(dǎo)致肝纖維化的重要病理學(xué)基礎(chǔ)[1-2]。肝硬化迄今尚缺乏有效的治療方法，天然?；撬崾菑闹兴帪醺蛉庵刑崛。诜乐胃斡不T(mén)靜脈高壓的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已取得了初步肯定，而且前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，600 mg·kg-1·d-1天然?；撬釋?duì)抗大鼠肝纖維化效果明顯優(yōu)于其他劑量[3-4]。為進(jìn)一步探索該藥的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)從大鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化及電鏡下肝臟超微結(jié)構(gòu)等方面探討天然?；撬釋?duì)肝硬化大鼠的保護(hù)作用及影響環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康清潔SD大鼠,SPF級(jí),雄性,周齡6～7周，體質(zhì)量(0.18±0.02) kg,由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證：scxk桂2009-0002。

1.2 主要藥物 天然?；撬釓臑醺蛉庵刑崛?采用熱水提取法,紅外光譜儀鑒定產(chǎn)品質(zhì)量；合成?；撬酺0625(美國(guó)sigma公司提供)。

1.3 主要試劑及設(shè)備 四氯化碳(CCl4)、分析純購(gòu)自天津富宇精細(xì)化工有限公司；食用酒購(gòu)自北京方莊酒廠；西班牙貝蒂斯橄欖油購(gòu)自青島金歐利營(yíng)銷(xiāo)有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；H-7650型透射電子顯微鏡購(gòu)自日本日立公司。

1.4 方法及觀察指標(biāo)

1.4.1 模型制備 大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(A組，15只)和造模組(60只)，采用復(fù)合因素法造模[5]，造模組大鼠首次按0.005 ml/g腹部皮下注射混合液(貝蒂斯橄欖油60%+CCl440%)，后每隔3 d按0.003 ml/g皮下注射，2次/周，15%乙醇為唯一飲料，同時(shí)輔以20%豬油、0.5%膽固醇、79.5%玉米面混合飼料，共計(jì)12周；A組則以普通飼料和純凈水喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)12周后經(jīng)病理學(xué)檢查確認(rèn)造模成功。

1.4.2 分組及用藥 造模組大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，即模型組(B組，20只)、合成牛磺酸治療組(C組，20只)及天然牛磺酸治療組(D組，20只)。C組合成?；撬?00 mg·kg-1·d-1灌胃，D組天然?；撬?00 mg·kg-1·d-1灌胃，均為1次/d，連續(xù)60 d，B組及A組大鼠給予相同劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.4.3 標(biāo)本采集及指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后3%戊巴比妥鈉按0.003 ml/g 腹腔注射，剖腹，取相同部位新鮮肝臟組織，硫代巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定MDA的含量，鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性。另一部分肝臟組織以10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，行蘇木素-伊紅染色法(HE)染色，光鏡下觀察。取小塊新鮮肝組織大小1 mm×1 mm×1 mm投入4 ℃預(yù)冷的4%戊二醛，固定24 h，再經(jīng)1%四氧化鋨固定2 h，常規(guī)乙醇和丙酮脫水，加丙酮-Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，修塊及切片，鈾-鉛染色，透視電鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝臟組織HE染色病理學(xué)比較 HE染色下A組大鼠肝臟組織的結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列規(guī)則成索狀，圍繞中央靜脈呈放射狀排列。B組大鼠肝臟組織的實(shí)質(zhì)被破壞，肝小葉正常結(jié)構(gòu)紊亂，門(mén)脈區(qū)纖維組織大量增生，并呈條索狀向肝小葉內(nèi)延伸形成假小葉。C組大鼠肝臟組織的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與壞死明顯減輕，肝臟組織纖維間隔不完全，膠原纖維沉積明顯改善。D組大鼠肝臟組織的肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維間隔(見(jiàn)圖1)。

2.2 大鼠肝臟線粒體、微粒體MDA、SOD變化 與A組比較，B組大鼠肝臟線粒體、微粒體MAD含量升高，SOD活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與B組比較，C、D兩組大鼠肝臟線粒體、微粒體MDA含量均下降，SOD活性均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與C組比較，D組肝臟線粒體、微粒體MDA含量降低、SOD活性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表1)。

2.3 大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)比較 A組大鼠肝細(xì)胞核規(guī)則，核內(nèi)異染色質(zhì)少，線粒體發(fā)達(dá)，多為圓形或腎形，嵴稀疏短小，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈層狀緊密排列，肝細(xì)胞與Disse間隙內(nèi)未見(jiàn)膠原纖維(見(jiàn)圖2A)。B組肝細(xì)胞核萎縮，細(xì)胞器明顯減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)層狀排列不明顯，呈囊狀擴(kuò)張腫脹、甚至空泡化；線粒體形狀不規(guī)則、嵴欠清晰，部分線粒體腫脹破裂或溶解成灶性空泡，Disse間隙可見(jiàn)較多膠原纖維及成纖維細(xì)胞增生沉積(見(jiàn)圖2B1、2B2)。C組大鼠肝細(xì)胞無(wú)明顯腫脹，線粒體明顯增生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稍擴(kuò)張，Disse間隙可見(jiàn)少量膠原纖維束沉積，增生不明顯(見(jiàn)圖2C)。D組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞器明顯增多，線粒體基本正常，嵴清晰可見(jiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列緊密，Disse間隙見(jiàn)極小量膠原纖維束沉積(見(jiàn)圖2D)。

3 討論

復(fù)合因素法構(gòu)建大鼠肝硬化模型是一種經(jīng)典的造模方法，簡(jiǎn)便、周期短、模型穩(wěn)定性及成功率高，在前期肝纖維化研究中已采用該法多次成功建立肝硬化大鼠模型[3-4]。研究表明，CCl4可引起體內(nèi)過(guò)氧化產(chǎn)物(如MDA)增多，SOD減少，氧化和抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡遭破壞，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，加速肝纖維化進(jìn)程[5-7]。因此，一定程度上減少脂質(zhì)過(guò)氧化，激發(fā)抗氧化酶活性成為治療肝纖維化的一個(gè)重要舉措。

注：A、B、C、D分別為A組、B組、C組、D組

圖1 大鼠肝臟組織病理學(xué)檢查(HE染色，×100)

Figure 1 Pathology of the rat liver tissue

注：A、B、C、D分別為A組、B組、C組、D組

圖2 大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)(鈾-鉛染色，×20 000)

注：與A組比較，*P<0.01；與B組比較，△P<0.01；與C組比較，▲P<0.01；MDA=丙二醛，SOD=超氧化物歧化酶

?；撬崾侨梭w重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有清除氧自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化等生物學(xué)作用[8-9]。目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)以化學(xué)合成的?；撬釣橹鳎芯堪l(fā)現(xiàn)較大劑量(1.0 g·kg-1·d-1)使用合成?；撬幔瑢?duì)實(shí)驗(yàn)大鼠產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)，在某些發(fā)達(dá)國(guó)家，合成?；撬嵋驯唤糜趮胗變菏称返奶砑?。中藥烏蛤中天然?；撬岷扛撸F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示：天然?；撬峋哂薪舛咀o(hù)肝、抗氧化損傷、抗腫瘤及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等活性，且無(wú)相關(guān)不良反應(yīng)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合成?；撬岷吞烊慌；撬峋山档蚆DA含量，增加SOD活性，具有一定抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，但天然?；撬嶂委熜Ч?。

線粒體有“動(dòng)力工廠”的美譽(yù)，對(duì)調(diào)控能量代謝、細(xì)胞凋亡起著重要的作用。肝硬化時(shí)線粒體、微粒體氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡被打破，生命活動(dòng)所需的ATP會(huì)受到嚴(yán)重抑制。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從超微結(jié)構(gòu)層次探討肝臟病理學(xué)結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示，B組大鼠肝細(xì)胞線粒體腫脹、溶解甚至灶性空泡化，而經(jīng)天然?；撬嶂委熀螅€粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)得到明顯改善，從超微結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)一步論證天然?；撬峋哂锌怪|(zhì)過(guò)氧化作用，減輕線粒體的氧化損傷，恢復(fù)肝線粒體能量代謝功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在肝細(xì)胞中高度發(fā)達(dá)，有研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能紊亂和脂質(zhì)代謝有著直接聯(lián)系，共同協(xié)調(diào)體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)[12]。而滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含有混合功能氧化酶系(如CYP-450)，可以與一氧化碳(CO)結(jié)合，通過(guò)羥基化作用而使一些低分子物質(zhì)(如代謝產(chǎn)物、毒物等)等有害物質(zhì)失活、溶解，達(dá)到解毒和生物轉(zhuǎn)化作用。本研究結(jié)果提示天然?；撬崮軌蚋纳茡p傷的肝臟超微結(jié)構(gòu)，從而影響毒物在肝內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化，通過(guò)減輕肝臟毒性而達(dá)到抗纖維化目的。

本研究結(jié)果表明，天然?；撬峥梢詼p少過(guò)氧化物MDA含量，增強(qiáng)SOD活性，對(duì)肝細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等超微結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用，其抵抗肝硬化的作用機(jī)制可能與抗氧化損傷、穩(wěn)定線粒體膜功能及電子信號(hào)傳遞鏈暢通等有關(guān)。

[1]楊鳳蕊，婁建石，方步武.蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方抗CCl4復(fù)合因素所致大鼠肝纖維化的作用[J].中草藥,2011,42(3):530-534.

[2]Ginès P,Cárdenas A,Arroyo V,et al.Management of cirrhosis and ascites[J].N Engl J Med,2004,350(16):1646-1654.

[3]Deng X,Liang J,Li YZ,et al.Protective effect of natural taurine on mitochondria of hepatic fibrosis in rats[J].Journal of Xi′an Jiaotong University(Medical Sciences),2007,28(6):649-650.(in Chinese) 鄧鑫,梁健,李益忠，等.天然?；撬釋?duì)肝纖維化大鼠肝線粒體的保護(hù)作用[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2007，28(6)：649-650.

[4]鄧鑫,梁健,黃彬，等.天然?；撬釋?duì)肝纖維化大鼠TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29(3)：336-339.

[5]梁擴(kuò)寰，李紹白.門(mén)靜脈高壓癥[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，1999:414-416.

[6]Cederbaum AL，Lu Y，Wu D.Role of oxidative stress in alcohol-induced liver injury[J].Arch Toxicol，2009，83(6):519-548.

[7]Lu SY,Qi P,Liang YE,et al.Protective effect of Ilicifoliosids alkaloid A and its derivatives on hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats[J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research,2013，24(2):310-311.(in Chinese) 盧順玉，祁平，梁穎娥，等.老鼠簕生物堿A及其衍生物對(duì)四氯化碳致大鼠肝纖維化的保護(hù)作用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24(2):310-311.

[8]Schuller-Levis G,Gordon RE,Wang C,et al.Protection of bleomycin-induced fibrosis and in flammation by taurine[J].Int Immunopharmacol,2009,9(7/8):971-977.

[9]Lakshmi Devi S,Anuradha CV.Mitochondrial damage,cytotoxicity and apoptosis in iron-potentiated alcoholic liver fibrosis:amelioration by taurine[J].Amino Acids,2010,38(3):869-879.

[10]Li CZ,Pan ZF,Chen YH,et al.Research progress in active substance of oyster softbody[J].Science and Technology of Food Industry，2012，33(8):412-415.(in Chinese) 李超柱，潘珍鳳，陳艷輝，等.牡蠣軟體活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].食品工藝科技，2012,33(8):412-415.

[11]張鵬，徐家敏，于廣利.?；撬岬纳锘钚约皯?yīng)用研究進(jìn)展[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，1995(S1):133-137.

[12]Rutkowski DT，Wu J，Back SH，et al.UPR pathways combine to prevent hepatic steatosis caused by ER stress-mediated suppression of transcriptional master regulators[J].Dev Cell,2008,15(6):829-840.

(本文編輯：高曉歡)

Effect of Natural Taurine on Liver Ultrastructure and Lipid Peroxidation in Rats with Cirrhosis

WENBin,CHENRan,PENGPei-chun,etal.

GuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning530001,China

Objective To explore the effect of natural taurine on liver ultrastructure and lipid peroxidation in rats with cirrhosis.Methods 80 SD rats were randomly divided into 2 groups by random number table method:normal control group (group A,15 cases) and model group (60 cases).The rat model with cirrhosis was prepared by composite factor method,as soon as the model was prepared successfully,the rats in model group were divided into model group (group B,20 cases),synthetic taurine group (group C,20 cases) and natural taurine group (group D,20 cases) by random number table.The content of methane dicarboxylic aldehyde (MDA) in liver mitochondria and microsome were measured by thiobarbituric acid (TBA) colorimetric assay,the activity of superoxide dismutase (SOD) in liver mitochondria and microsome were measured by pyrogallol autoxidation,the pathological changes in the liver were observed after HE staining,ultrastructure changes of rat liver tissue were observed under electron microscope.Results MDA content in rats in group B was significantly higher than that in rats in group A (P<0.01),the activity of SOD in rats in group B was significantly lower than that in rats in group A,the damage of liver tissue and ultrastructure was serious.MDA content in rats in group C and group D was significantly lower than that in rats in group B,the activity of SOD in rats in group C and group D was significantly higher than that in rats in group B(P<0.01),the ultrastructure of liver mitochondria and endoplasmic reticulum significantly improved.The activity of MDA content in rats in group D was significantly lower than that in rats in group C,SOD in rats in group D was significantly higher than that in rats in group C(P<0.01).Conclusion The natural taurine can enhance the body′s antioxidant capacity to resist oxidative damage,and can protect organelles such as liver mitochondria and endoplasmic reticulum.

Taurine；Liver cirrhosis；Malondialdehyde；Superoxide dismutase

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160433)；廣西科技廳重點(diǎn)課題(2011GXNSFD018035)；廣西衛(wèi)生廳重點(diǎn)課題(重20122031)；中南大學(xué)博士后科學(xué)基金(2013M531816)

530001廣西南寧市，廣西中醫(yī)藥大學(xué)(文彬，陳然，彭佩純)；廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院消化內(nèi)科(鄧鑫)

鄧鑫，530000廣西南寧市，廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院消化內(nèi)科；E-mail:wenbin357@yeah.net

R 575.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.06.012

2014-03-05；

2014-07-07)