蒼耳提取物蒼耳亭的結(jié)構(gòu)修飾及其殺蟲活性測定

孟學(xué)英，沈慧敏

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

蒼耳提取物蒼耳亭的結(jié)構(gòu)修飾及其殺蟲活性測定

孟學(xué)英，沈慧敏

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

摘要：通過對蒼耳提取物蒼耳亭的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行改造合成得到18種單體化合物，采用室內(nèi)生測法測定了化合物對二斑葉螨和粘蟲的殺蟲活性.結(jié)果表明：C7和C5對二斑葉螨觸殺活性最高，48 h校正死亡率分別為75.38%和69.62%；C7、C18、C5和C10對粘蟲有較好的拒食活性，48 h非選擇拒食率分別為74.40%、63.59%、59.98%和58.40%；C5、C7、C14和C4對粘蟲有很好的觸殺活性，48 h校正死亡率分別分別為78.74%、73.62%、65.21%和62.06%；C5、C7、C14和C10對粘蟲有一定的胃毒作用，48 h校正死亡率分別為74.26%、65.32%、56.97%和53.86%.可見，C7、C5和C14不僅對二斑葉螨雌成螨有很好的觸殺活性，對粘蟲還有良好地觸殺、胃毒和拒食作用，具有很好的開發(fā)前景；C18、C10和C4對粘蟲拒食、胃毒和觸殺作用也值得研究.

關(guān)鍵詞：蒼耳亭;結(jié)構(gòu)修飾；二斑葉螨;粘蟲；生物活性

第一作者：孟學(xué)英(1987-)，女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)修飾研究.E-mail:mengxueying0614@163.com

The chemical modifications of Xanthatin derivatives and

their biological activities onTetranychusurticae

andMythimnaseparate

MENG Xue-ying,SHEN Hui-min

(College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：In this paper,the synthesis of 18 kinds of Xanthatin derivatives was completed by transforming the chemical structure of Xanthatin.The biological activities of these derivatives on Tetranychus urticae and Mythimna separata were also tested by indoor bioassay.The results showed that C7 and C5 had high contact toxicity on Tetranychus urticae,of which the corrected mortality rates were 75.38% and 69.62% after 48 h at a concentration of 2.0 μg/μL,respectively.In addition,C7,C18,C5,and C10 had strong non-selective antifeedant activities on Mythimna separata,of which the non-selective antifeedant rates were 74.40%,63.59%,59.98%,and 58.40% after 48h,respectively.C5,C7,C14,and C4 had high contact toxicity on Mythimna separata,of which the corrected mortality rates were 78.74%,73.62%,65.21%,and 62.06 after 48 h,respectively,while C5,C7,C14,and C10 had high stomach toxicity on Mythimna separatathe,of which the corrected mortality rates were 74.26%,65.32%,56.97%,and 53.86% after 48 h,respectively.In conclusion,C7,C5,and C14 had not only high contact toxicity on Tetranychus urticae,but also high non-selective antifeedant activity,contact toxicity,and stomach toxicity on Mythimna separatathe.All of these substances have development prospective and potential application.C18,C10,and C4 are also well worth to research,because of their non-selective antifeedant activity,contact toxicity,and stomach toxicity on Mythimna separatathe.

Key words：Xanthatin;structure modification;Tetranychus urticae;Mythimna separata;biological activity

植物次生代謝物對許多昆蟲有殺滅效果，其除蟲途徑包括急性毒殺、抑制昆蟲體內(nèi)酶的活性、抑制昆蟲繁殖、降低昆蟲食欲、將昆蟲驅(qū)離植物等[1-4].蒼耳為一年生草本植物，在我國分布廣泛.蒼耳原先主要用于醫(yī)藥研究，但近年許多學(xué)者也探究了其在植物保護[5]和抑菌方面的應(yīng)用.劉林等[6]以棉花枯萎病菌為供試菌，研究發(fā)現(xiàn)蒼耳各個器官都有抑菌效果，尤其是蒼耳葉的丙酮和乙醚提取液的抑菌效果較強，對幾種病菌抑制率均在75%以上.本課題組先前從蒼耳丙酮提取物中純化分離得到了11 個單體化合物，利用現(xiàn)代核磁技術(shù)分別鑒定出化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中蒼耳亭(Xanthatin,結(jié)構(gòu)見圖1)含量較多，約為0.1%.但蒼耳亭的殺蟲活性比一般殺蟲劑低.為了提高蒼耳亭的殺蟲活性，本試驗對蒼耳亭的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行修飾，對蒼耳亭的酮羰基進行改造，目的是通過引入其他活性基團、提高母體的脂溶性和生物活性，進而擴大應(yīng)用范圍.試驗以二斑葉螨和粘蟲為材料，測定了18種蒼耳亭結(jié)構(gòu)修飾物的生物活性，以期為新型植物源殺蟲劑的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ).

圖1　蒼耳亭的結(jié)構(gòu)式

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試葉螨和粘蟲二斑葉螨(Tetranychusurticae)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院養(yǎng)蟲室提供；粘蟲(Mythimnaseparata)由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所養(yǎng)蟲室提供.

1.1.2主要試劑和儀器丙酮、甲醇、正己烷、二氯甲烷、石油醚(以上試劑均為分析純，天津化學(xué)試劑有限公司)；硅膠(200-300目和300-400目)，GF254(10-40u) 薄層層析硅膠(青島海洋化工廠生產(chǎn))；18種供試有機酸名稱、結(jié)構(gòu)式及生產(chǎn)廠家見表1.

表1　18種供試有機酸名稱、結(jié)構(gòu)式及生產(chǎn)廠家

智能光照培養(yǎng)箱中(LC-250/300，山東省臨沂市萬泉植保儀器有限公司)；雙目解剖鏡(SZW-45B,浙江舜宇光電有限公司)；薄層(TLC)；ZF-C型三用紫外分析儀；EI-MS質(zhì)譜儀(VG Auto-Spec 3000 70eV)；HR-ESI-MS質(zhì)譜儀(Bruker Daltonics APEXⅡ47eV)；1H NMR (300 MHz，400 MHz)；13C NMR(400 MHz) (德國Bruker公司).

1.2試驗方法

1.2.1蒼耳亭的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾方法用表1所示的18種有機酸分別與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)制備成相應(yīng)的酯類物質(zhì).分別取18種有機酸10 mmoL用15 mL的甲苯溶解于三頸瓶中，加入幾滴濃硫酸，攪拌混合均勻，緩慢加入乙醇10 mL.將三頸瓶裝上回流冷凝管和分水器及溫度計，在130 ℃的油浴中加熱攪拌，反應(yīng)3～4 h，期間用薄層色譜法(TLC)監(jiān)測反應(yīng)進程，至反應(yīng)完全停止.將反應(yīng)后的混合物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除多余溶劑，用二氯甲烷萃取反應(yīng)粗產(chǎn)物得到有機相，再依次用碳酸氫鈉溶液(5 mL×2)、飽和食鹽水洗滌有機相，用硫酸鈉干燥數(shù)小時后濃縮.用柱層析法分離獲得一系列下一步反應(yīng)所需要的酯類底物(化合物An)，產(chǎn)率為90%～95%.

分別稱取底物An(0.01 mmoL)于50 mL的三頸燒瓶中，用乙醇攪拌溶解.慢慢加入10 mL的水合肼，加熱下攪拌回流5～7 h，期間用TLC監(jiān)測反應(yīng)過程，至反應(yīng)停止.待反應(yīng)瓶冷卻后，加入適量水，抽濾得到粗產(chǎn)品.用乙醇重結(jié)晶后得到相應(yīng)的酰胺類底物的結(jié)晶體(反應(yīng)物Bn)，產(chǎn)率為85%～93%.

取蒼耳亭25 mg(0.1 mmoL)于25 mL密封管中，加入2 mL甲醇、10 mL正己烷，用磁子攪拌溶解；向混合液中加入幾滴冰醋酸、0.2 mmoL的酰胺類底物(反應(yīng)物Bn).向密封管中通氮氣保護，并在100 ℃的油浴中加熱攪拌，反應(yīng)12～36 h，期間用TLC監(jiān)測反應(yīng)過程，至反應(yīng)停止.將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除多余溶劑，用柱層析法分離純化得到蒼耳亭結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物(反應(yīng)物Cn)，產(chǎn)率為78%～84%.

以上反應(yīng)過程的路線如圖2所示：

圖2　反應(yīng)過程

1.2.2蒼耳亭的結(jié)構(gòu)修飾物對二斑葉螨的生物活性測定將蒼耳亭修飾物用丙酮分別稀釋成2.0、1.5、1.0和0.5 μg/μL，用清水做對照.用25 mL的容量瓶定容，根據(jù)c=n/v，計算不同質(zhì)量濃度所需要的蒼耳亭的摩爾數(shù)n；根據(jù)n=m/M,計算出不同的摩爾數(shù)所需要的蒼耳亭的質(zhì)量m.用分析天平秤取計算得到m的毫克數(shù)，用容量瓶定容不同濃度藥液，待用.

采取FAO推薦的玻片浸漬法[7].將雙面膠貼在光滑玻片的一端，用零號毛筆挑取大小一致、生命力強的活潑成螨，并將螨的背部貼在雙面膠帶上.注意不能粘住螨的足、口器和須肢等.每個玻璃片粘30頭螨.用雙目解剖鏡檢查螨的數(shù)量.將粘有成螨的玻片浸入藥液中，待5 s后取出玻片，每個濃度重復(fù)3次，用濾紙吸干玻片及螨體周圍的藥液，放在墊有浸水海綿的瓷盤上.瓷盤放在智能光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件溫度為26～28 ℃，濕度為70%～80%，光照∶黑暗=12 h∶12 h，24 h后鏡檢，用小毛筆觸動螨足，不動者為死亡，求死亡率以及校正死亡率，并進行相關(guān)分析[8].

1.2.3蒼耳亭18種結(jié)構(gòu)修飾物對粘蟲的生物活性測定

1.2.3.1非選擇拒食活性測定參考張宗炳[9]的方法.用葉碟法測定粘蟲的非選擇拒食活性，蒼耳亭18種修飾物稀釋濃度同前，用清水對照.將新鮮玉米葉片用圓形打孔器(直徑為20 mm)打成若干葉蝶備用.將葉蝶分為等量5組，并分別在4個梯度濃度和清水中浸3 s取出晾干，置于干凈的培養(yǎng)皿中備用.每個培養(yǎng)皿中放入饑餓5 h的4齡幼蟲.重復(fù)10次，每處理用5葉蝶對應(yīng)一頭粘蟲.所有處理培養(yǎng)皿放在光照培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)條件同前.24 h后觀察粘蟲取食的情況，求非選擇拒食率.

1.2.3.2觸殺活性測定參考慕立義的方法[10]，并加以改進.挑選大小一致的4齡粘蟲幼蟲置于浸蟲管中，分別放入蒼耳亭18種修飾物4種處理濃度和清水中，10 s后取出，用吸水紙吸取多余的藥液.然后把處理后的幼蟲放入盛有足量新鮮玉米葉的培養(yǎng)皿中，每個處理10頭試蟲，重復(fù)3次.處理培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件同前.24、48 h后分別觀察培養(yǎng)皿試蟲死亡情況，計算死亡率和校正死亡率.

1.2.3.3胃毒活性測定參考張國洲等[11]的方法.將新鮮玉米葉片用圓形打孔器(直徑為20 mm)打成若干葉蝶備用.將葉蝶分為等量5組，并分別在4種處理濃度的蒼耳亭修飾物和清水中浸3 s取出晾干.把每一片浸藥的玉米葉蝶和未浸漬的玉米葉蝶粘合一起，至于培養(yǎng)皿中，放入饑餓5 h的4齡幼蟲.每處理用10頭粘蟲，重復(fù)3次.處理培養(yǎng)皿放在光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件同前.24、48 h后分別觀察每個培養(yǎng)皿試蟲死亡情況，計算死亡率和校正死亡率，公式如前所示.

2結(jié)果與分析

2.1蒼耳亭的結(jié)構(gòu)修飾

18種供試有機酸與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)，制備成相應(yīng)的有機酸乙酯底物(底物An)，底物An與水合肼發(fā)生肼解得到酰胺類底物(底物Bn)，用蒼耳亭與底物Bn反應(yīng)得到一系列終產(chǎn)物(化合物Cn)，獲得對蒼耳亭結(jié)構(gòu)酮羰基的改造.18種蒼耳亭的結(jié)構(gòu)修飾物見表2.

2.2蒼耳亭18種修飾物對二斑葉螨的生物活性測定

蒼耳亭18種修飾物對二斑葉螨的觸殺活性測定結(jié)果見表3.當(dāng)修飾物質(zhì)量濃度為2.0 μg/μL時，蒼耳亭18種修飾物對二斑葉螨有不同程度的觸殺作用，C7和C5對二斑葉螨觸殺活性最高，24 h校正死亡率分別為67.50%和61.07%，48 h的校正死亡率分別為75.38%和69.62%，Duncan氏新復(fù)極差法在5%差異水平上極顯著；C14、C4、C12、C6、C10、C13、C11、C9、C15、C8、C18和C17化合物對二斑葉螨有一定的生物活性，48 h的校正死亡率分別為56.28%、48.85%、47.72%、44.99%、42.88%、42.02%、39.23%、38.58%、37.12%、35.96%、33.85%和30.39%，其余修飾物(C3、C2、C16、C11) 對二斑葉螨無觸殺活性，48 h校正死亡率均在30%以下.

表2　18種蒼耳亭的結(jié)構(gòu)修飾物結(jié)構(gòu)及分子量

表3　蒼耳亭18種修飾物對二斑葉螨雌成螨的觸殺活性

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示LSD檢驗的顯著性差異(Duncan氏新復(fù)極差檢驗)(P<0.05).

2.3蒼耳亭18種結(jié)構(gòu)修飾物對粘蟲的生物活性測定

2.3.1非選擇拒食活性蒼耳亭18種結(jié)構(gòu)修飾物對粘蟲的非選擇拒食活性測定結(jié)果見表4.當(dāng)修飾物質(zhì)量濃度為2.0 μg/μL時，C7、C18、C5和C10對粘蟲的拒食活性最佳，24 h非選擇拒食率分別為65.48%、56.38%、52.03%和49.45%，48 h非選擇拒食率分別為74.40%、63.59%、59.98%和58.40%；C2、C13、C9、C12、C6、C4和C14 7種結(jié)構(gòu)修飾物對粘蟲有一定拒食活性，48 h非選擇拒食率為31.68%～56.63%，其余化合物對粘蟲拒食活性很低，48 h非選擇拒食率在29.43%以下.

2.3.2觸殺活性蒼耳亭18種結(jié)構(gòu)修飾物對粘蟲的觸殺活性測定結(jié)果見表5.當(dāng)修飾物質(zhì)量濃度為2.0 μg/μL時，蒼耳亭18種結(jié)構(gòu)修飾物對粘蟲的觸殺活性最好的為C5、C7、C14和C4，24 h校正死亡率分別為66.29%、60.24%、53.94%和51.57%，48 h校正死亡率分別為78.74%、73.62%、65.21%和62.06%，用Duncan氏新復(fù)極差法在5%差異水平上檢驗極顯著；C12、C6、C18、C10、C9、C2、C11、C15和C8 9種修飾物對粘蟲有一定的觸殺活性，48 h對粘蟲的校正死亡率在52.73%～31.47%；其余5種修飾物對粘蟲的觸殺活性較低，24 h和48 h校正死亡率均在27.02%以下.

表4　蒼耳亭18種結(jié)構(gòu)修飾物對粘蟲的

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示LSD檢驗的顯著性差異(Duncan氏新復(fù)極差檢驗)(P<0.05).

2.3.3胃毒活性測定蒼耳亭18種結(jié)構(gòu)修飾物對粘蟲的胃毒活性測定結(jié)果見表6.當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0 μg/μL時，C5、C7、C14和C10修飾物對粘蟲的胃毒作用最高，24 h校正死亡率分別為66.93%、60.98%、50.55%和46.13%，48 h校正死亡率分別為74.26%、65.32%、56.97%和53.86%，用Duncan氏新復(fù)極差法在5%差異水平上檢驗極顯著；C4、C18、C2和C1 4種修飾物對粘蟲有一定的胃毒活性，48 h校正死亡率分別達到了49.29%、43.17%、32.17%和31.29%；其余修飾物對粘蟲胃毒作用很低，48 h校正死亡率均在28.27%以下.

表5　蒼耳亭18種結(jié)構(gòu)修飾物對粘蟲的觸殺活性

表6　蒼耳亭18種結(jié)構(gòu)修飾物對粘蟲的胃毒活性測定結(jié)果

3討論

近年來國內(nèi)外學(xué)者在植物性農(nóng)藥的篩選與利用方面做了大量研究并取得一定的成果[12-15]，本研究也為新型高效天然殺蟲劑的研制和開發(fā)奠定了重要基礎(chǔ).據(jù)報道，蒼耳有抗菌、殺蟲、抗病毒等多種活性[16-17]；高紅明等[18]發(fā)現(xiàn)，0.053 mg/g的蒼耳乙醇提取物對菜青蟲的胃毒作用可以達到94%；姜雙林等[19]報道了蒼耳提取物對桃蚜和山楂葉螨有較強的毒殺作用；王旭等[20]、張帆等[21]、楊順義等[22]、何靜等[23]、胡冬艷等[24]相繼證明了蒼耳亭丙酮提取物具有抑菌活性.這些報道都是以蒼耳亭各種溶劑提取混合物來研究殺蟲或殺螨活性，對蒼耳亭結(jié)構(gòu)修飾物的殺蟲或殺螨活性研究未見報道.

本試驗通過測定蒼耳亭18種修飾物對二斑葉螨和粘蟲的觸殺活性可知，C7和C5對二斑葉螨觸殺活性最高，48 h校正死亡率分別為75.38%和69.62%；C7、C18、C5和C10對粘蟲有較好的拒食活性，48 h非選擇拒食率分別為74.40%、63.59%、59.98%和58.40%；C5、C7、C14和C4對粘蟲有很好的觸殺活性，48 h校正死亡率分別為78.74%、73.62%、65.21%和62.06；C5、C7、C14和C10對粘蟲有一定的胃毒作用，48 h校正死亡率分別為74.26%、65.32%、56.97%和53.86%.由此看出，C7、C5和C14不僅對二斑葉螨雌成螨有很好的生物活性，對粘蟲也有良好的觸殺和胃毒作用，并表現(xiàn)出一定拒食作用，展現(xiàn)出良好的開發(fā)前景，后續(xù)還需進一步開展以構(gòu)效關(guān)系為基礎(chǔ)的重點研究.另外，C18 、C10和C4對粘蟲的拒食、胃毒和觸殺作用也值得進一步研究.

本試驗對蒼耳亭結(jié)構(gòu)修飾研究得知，對蒼耳亭結(jié)構(gòu)的改造可提高蒼耳亭對二斑葉螨和粘蟲的生物活性.當(dāng)有機酸的苯環(huán)取代基相同但取代位置不同時，化合物對螨和粘蟲生物活性影響不大.如C5和C14，苯環(huán)上鹵素原子氟原子，對位F取代和鄰位F取代的有機酸制備得到的修飾物，其在24 h對二斑葉螨的校正死亡率分別為 61.07%和54.75%，48 h校正死亡率分別為69.62%和56.28%.兩組數(shù)據(jù)差異不明顯，表明有機酸中原子位置對活性的影響程度小于引入原子種類對活性的影響程度.同樣C4 和C12,C6 和C7，以及C8 和C15,具有類似特性.這表明蒼耳亭的化學(xué)修飾要著重考慮引入原子的種類，如引入N、P等雜原子或者鹵素原子將有助于提高蒼耳亭對害蟲(螨)的生物活性，取代基的位置對修飾物的生物活性影響不大.應(yīng)注意，當(dāng)引入R基團結(jié)構(gòu)過大時，也會影響其生物活性.但化合物C16質(zhì)量濃度達到2.0 μg/μL，48 h后對二斑葉螨和粘蟲的生物活性仍然很低，可能是化合物分子結(jié)構(gòu)過大影響其在生物體內(nèi)的穿透，使得其難以到達作用部位，其作用機理有待進一步研究.

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(責(zé)任編輯趙曉倩)

收稿日期：2014-04-07；修回日期：2014-05-20

基金項目：甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目(GNSW-2004-08，GNSW-2012-20).

通信作者：沈慧敏，女，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事農(nóng)藥毒理和生物農(nóng)藥開發(fā)應(yīng)用研究.E-mail：ndshm@gsau.edu.cn

中圖分類號：TQ 450.1+1

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)03-0102-11