三相中空纖維微萃取 -高效液相色譜檢測(cè)尿液中的海洛因代謝物

王 丹孟品佳陳琳琳（中國(guó)人民公安大學(xué) 北京 00000； 中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 0035）

三相中空纖維微萃取 -高效液相色譜檢測(cè)尿液中的海洛因代謝物

王 丹1孟品佳1陳琳琳2
（1中國(guó)人民公安大學(xué) 北京 100000；2 中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110035）

建立了中空纖維液 -液 -液三相萃取模式 （3p-HF-LPME） -高效液相色譜 （HPLC）法測(cè)定尿中的海洛因代謝物嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因的方法。對(duì)高效液相色譜的檢測(cè)條件及影響液相微萃取的因素進(jìn)行了考察和優(yōu)化。

中空纖維 液相微萃取 海洛因代謝物 高效液相色譜

我國(guó)的毒品問(wèn)題依然復(fù)雜嚴(yán)峻。海洛因是其中最具代表性的毒品，據(jù)2014年《中國(guó)禁毒報(bào)告》，全國(guó)濫用海洛因人員 132.6萬(wàn)名，同比上升 6.6%，占吸毒人員總數(shù)的53.6%。[1]海洛因體內(nèi)代謝的研究一直是分析中的重要內(nèi)容，對(duì)于禁毒工作具有重要意義。對(duì)于海洛因吸食者，其代謝物嗎啡、O6-單乙酰嗎啡以及可待因在檢測(cè)過(guò)程中是非常關(guān)鍵的目標(biāo)物，但由于此類(lèi)化合物的極性較大，具有親水性，很難用氣相色譜法直接進(jìn)行檢測(cè)，色譜行為較差，檢測(cè)靈敏度偏低，通常需要進(jìn)行衍生化處理[2]后用氣相色譜法檢測(cè)或用液相色譜法、毛細(xì)管電泳等儀器進(jìn)行檢測(cè)。[3]

對(duì)于生物檢材中的海洛因，其樣品前處理方式主要是液相萃取，但液相萃取易于乳化，很難自動(dòng)化，需要大量的有機(jī)溶劑，毒性較大，產(chǎn)生大量實(shí)驗(yàn)室廢液，污染環(huán)境。Pedersen-Bjergaard[4]等人提出的中空纖維液相微萃取技術(shù)是將有機(jī)溶劑固定在中空纖維孔壁內(nèi)，生物樣品中的大分子雜質(zhì)難以通過(guò)纖維孔進(jìn)入接收相，中空纖維對(duì)樣品溶液起到微孔過(guò)濾的作用，集萃取、過(guò)濾、富集于一體。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

日本日立高效液相色譜儀（HITACHI D-7000；檢測(cè)器：UV L-7420），HSM色譜工作站，色譜柱phenomenex C18反相色譜柱 （250×4.6mm，pH范圍2-10），DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪高科儀器廠），AccurelQ3/2聚丙烯中空纖維（Membrana，Wupperta，Germany，壁厚200μm，孔徑0.20μm，內(nèi)徑600μm）。

嗎啡鹽酸鹽、O6-單乙酰嗎啡鹽酸鹽、磷酸可待因標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于公安部物證鑒定中心；甲醇、乙腈均為色譜純。磷酸、磷酸二氫鉀、三乙胺、甲苯、環(huán)己烷、異丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、正辛醇和甲苯均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1.0mg/mL）：用電子天平精密稱(chēng)取鹽酸嗎啡1.13mg、O6-單乙酰嗎啡1.11mg、磷酸可待因 1.11mg分別溶于 lmL甲醇中，配成 1.0mg/mL的甲醇儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確量取上述1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各10μL，加入pH2磷酸溶液定容至 1.0mL，配制成10.0μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 三相中空纖維液相微萃取操作方法

將健康空白尿液或海洛因吸食者尿液用 0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9，作為本實(shí)驗(yàn)的樣品相。取10mL放入樣品瓶中，加入5×10mm微型磁力攪拌子。

取中空纖維將其剪切為5cm長(zhǎng)，將其放入丙酮

中超聲5min，消除中空纖維中的可能雜質(zhì)。將處理過(guò)的中空纖維浸入辛醇溶劑中1min，取出，迅速用氣相色譜專(zhuān)用微量注射器吸取 20μLPH2磷酸 （接收相）注入中空纖維內(nèi)腔中，兩端用5mL一次性注射針頭固定形成U型模式（如圖1），插入樣品溶液中，將樣品瓶瓶蓋密封，放入恒溫磁力攪拌器中，調(diào)節(jié)溫度 30℃，磁力攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為 1000r/min，萃取 40min后，停止攪拌，用微量注射器在針頭一端抽回內(nèi)腔中接收相，直接注入到高效液相色譜中檢驗(yàn)。

圖 1 中空纖維液相微萃取裝置

1.4 高效液相色譜檢測(cè)條件

色譜柱：phenomenex C18柱（250mm×4.6mm，pH范圍2-10），流動(dòng)相條件：流動(dòng)相A：20mmol/L磷酸二氫鉀+0.02mol/L三乙胺水溶液，用磷酸調(diào)pH=6.0；流動(dòng)相 B∶乙腈，A、B均脫氣備用。流動(dòng)相分配為 A∶B=90∶10。流動(dòng)相流速為 1.0mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，進(jìn)樣量為10μL。

1.5 萃取回收率和富集倍數(shù)計(jì)算方法

目標(biāo)分析物的富集倍數(shù)（enrichment factor，EF）和回收率 （R） 可依據(jù)以下公式計(jì)算，

na,final和ns,initial分別是分析 物萃取前在樣品 相中和萃取后在接收相中的摩爾濃度，Va為接收相的體積，Vs為樣品相的體積，Ca,final為分析物在接收相中的濃度，Ca,initial為分析物在樣品相中的最初濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 理論闡述

中空纖維三相微萃取體系包括三相：樣品相、有機(jī)相（中空纖維內(nèi)壁）、接收相，將中空纖維插入有機(jī)溶劑中，有機(jī)溶劑通過(guò)毛細(xì)力或注入方式進(jìn)入到中空纖維內(nèi)膜中，然后將接受相 （水相） 注入中空纖維內(nèi)腔內(nèi)。在本研究中，尿中嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因萃取前調(diào)至堿性，使嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因呈有機(jī)態(tài)通過(guò)攪拌加速被萃取到有機(jī)相中，接收相將pH值調(diào)節(jié)為酸性，分析物在有機(jī)相與接受相界面上與接受相中的酸中和為離解狀態(tài)，被反萃進(jìn)入接受相。接受相中的分析物可直接進(jìn)樣到HPLC或CE進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 中空纖維液相萃取條件的選擇與優(yōu)化

樣品相為向健康人尿液中添加三種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容為10mL，令其中目標(biāo)物濃度均為10mg/L，按照1.4的高效液相色譜檢測(cè)條件進(jìn)行檢測(cè)。以目標(biāo)物在萃取中所獲得的富集倍數(shù)作為其萃取效率的考察指標(biāo)。

2．2．1 有機(jī)溶劑對(duì)萃取效果的影響

有機(jī)溶劑是影響萃取效果的重要因素。三相中空纖維微萃取對(duì)萃取溶劑的要求：一是與中空纖維有很好的兼容性，可以穩(wěn)定地存在于纖維的內(nèi)腔或壁孔中不能泄露；二是對(duì)目標(biāo)分析物有合適的溶解度和選擇性，不易揮發(fā)，毒性小。[5]本實(shí)驗(yàn)選擇甲苯、正辛醇、異丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、環(huán)己烷 6種有機(jī)溶劑作為萃取劑，按照1.3的萃取操作，對(duì)含10mg/L的三種目標(biāo)化合物加標(biāo)工作溶液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖2。正辛醇作為有機(jī)相時(shí)，接收相體積穩(wěn)定，嗎啡、06-單乙酰嗎啡、可待因的富集倍數(shù)明顯高于其它溶劑。苯及其衍生物中僅甲苯對(duì)鴉片類(lèi)毒品有一定萃取，但甲苯作為三相萃取溶劑，隨著萃取時(shí)間的增加，接收相流失嚴(yán)重。而烷烴類(lèi)溶劑對(duì)3種目標(biāo)分析物幾乎沒(méi)有萃取。乙酸乙酯對(duì) 3種目標(biāo)化合物有一定的萃取作用，但乙酸乙酯沸點(diǎn)低，接收相也有一定的損失。乙酸丁酯與異丙醇的情況略好一些，對(duì)3種目標(biāo)分析物均有一定的富集效果。我們實(shí)驗(yàn)中的3種目標(biāo)分析物，均具有一定的極性和親水性，正辛醇中的羥基（-OH）能與嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因結(jié)構(gòu)中（-OH）形成氫鍵，增加該類(lèi)化合物在正辛醇中的溶解度。氫鍵可能是決定萃取效率的主要因素，與嗎啡等形成氫鍵能力越強(qiáng)的有機(jī)溶劑萃取效率越高，反之越低。本實(shí)驗(yàn)選擇所考察溶劑中萃取效率最高的正辛醇作為萃取溶劑。

圖 2 有機(jī)溶劑對(duì)萃取效果的影響

2．2．2 樣品相和接收相pH值對(duì)萃取效果的影響

在3p-HF-LPME中，調(diào)節(jié)樣品相的pH值，改變目標(biāo)分析物在樣品溶液中的存在形態(tài)，使其以化合物原體形態(tài)被有機(jī)溶劑萃取，而調(diào)節(jié)接收相的pH值，使分析物呈離解狀態(tài)，即能使分析物迅速?gòu)挠袡C(jī)溶劑中反萃出來(lái)，又能夠防止其重新擴(kuò)散回有機(jī)溶劑中。因此 pH可以改變酸性或堿性目標(biāo)分析物在樣品溶液中存在的形態(tài)，從而影響化合物在樣品相、有機(jī)相與接收相三相之間分配平衡系數(shù)，從而影響萃取效率 。[6]

實(shí)驗(yàn)中用 0.1mol/LNaOH調(diào)節(jié)樣品相，令其 pH分別為 8、9、10、11、12，按照 1.3的方法操作，接收相為磷酸（pH=2），萃取后，取接收相直接進(jìn)入HPLC分析。結(jié)果如圖3所示，嗎啡在pH=9時(shí)萃取效率最高，之后隨著 pH值的增高而下降。O6-單乙酰嗎啡與可待因的富集倍數(shù)隨著pH的增高而增大，當(dāng)pH為11之后變化不明顯。綜合考慮，結(jié)合嗎啡的情況，實(shí)驗(yàn)樣品相pH選擇調(diào)節(jié)為9。

圖3 樣品相pH對(duì)萃取效果的影響

圖 4 接收相對(duì)萃取效果的影響

對(duì)于3p-HF-LPME，接收相的pH不但要能夠使目標(biāo)分析物呈離解狀態(tài)，完全從有機(jī)溶劑中反萃出來(lái)，還能滿(mǎn)足后續(xù)儀器分析的直接進(jìn)樣的要求。檢測(cè)堿性化合物常用的酸主要有鹽酸、磷酸、甲酸等。本實(shí)驗(yàn)中充分考慮到后續(xù)用HPLC做為分析儀器時(shí)，鹽酸中的氯離子對(duì)色譜柱的影響很大，能夠加速其 C18色譜柱的退化。本實(shí)驗(yàn)選擇磷酸作為接收相介質(zhì)。用pH計(jì)調(diào)節(jié)配制不同pH值的磷酸溶液，按照1.3的方法操作，萃取劑為正辛醇，接收相為 pH為 1.0、2.0、3.0的磷酸，萃取后，取接收相直接進(jìn)入 HPLC分析。結(jié)果表明見(jiàn)圖4，pH1.0時(shí)的富集效率最大，隨pH增大，富集效率下降，但綜合考慮pH過(guò)大對(duì)色譜柱造 成 影 響 ， 最 終 選 擇 pH2.0的 接 受 相 進(jìn) 行3p-HF-LPME。

2．2．3 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

取樣品相按1.3的萃取操作,考察萃取時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60min時(shí)對(duì)富集效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，隨著萃取時(shí)間的增加，富集倍數(shù)增加，這是由萃取平衡決定的，但對(duì)于3p-HF-LPME，萃取時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，接受相會(huì)隨著攪拌流失，也會(huì)導(dǎo)致其與有機(jī)溶劑互溶，富集倍數(shù)降低。實(shí)驗(yàn)表明萃取 40min可以獲得較好的回收率與富集倍數(shù)。

圖 5 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

圖 6 攪拌速度對(duì)萃取效果的影響

2．2．4 攪拌速度對(duì)萃取效果的影響

提高攪拌速度可以促進(jìn)分析物在 3p-HF-LPME之間的傳質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)按1.3的萃取操作，考察了攪拌速度分別為400、600、800、1000、1200r/min時(shí)富集倍數(shù)的情況，結(jié)果（圖6）表明，當(dāng)轉(zhuǎn)速為1000 r/min時(shí)，萃取效果最好。若繼續(xù)增大轉(zhuǎn)速，可能導(dǎo)致：（1）正辛醇有機(jī)膜被破壞，萃取效率降低；（2）尿液可能會(huì)發(fā)生乳化現(xiàn)象。因此，本試驗(yàn)選擇1000 r/min作為攪拌速度。

2.3 優(yōu)化條件下的加標(biāo)尿樣色譜行為

本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化的液相色譜條件和液-液-液中空纖維萃取條件下，分別直接將空白尿液經(jīng)過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣分析；空白尿液經(jīng)過(guò)3P-HF-LPME后進(jìn)樣；3種目標(biāo)分析物的濃度為500μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣；樣品相3個(gè)目標(biāo)分析物的濃度為500μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作的加標(biāo)尿樣經(jīng)過(guò) 3P-HF-LPME后進(jìn)入 HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果見(jiàn)圖7、8、9、10。

圖7顯示尿樣中的組成復(fù)雜，干擾物質(zhì)多，必須經(jīng)過(guò)萃取除去雜質(zhì)；圖8顯示空白尿樣進(jìn)行3p-HF-LPME后色譜峰干凈，表明尿液中的大分子物質(zhì)、蛋白質(zhì)等干擾成分已經(jīng)被中空纖維膜隔離，沒(méi)有進(jìn)入接收相，表明中空纖維膜能有效的阻止復(fù)雜樣品基質(zhì)中的干擾物。圖9與圖10相比，通過(guò)液相色譜峰的峰高（H），能夠看出，通過(guò) 3p-HF-LPME，3個(gè)目標(biāo)分析物的峰高顯著增高，說(shuō)明該萃取模式能夠?qū)δ繕?biāo)分析物進(jìn)行顯著的富集。結(jié)果表明，中空纖維液相微萃取方法具有非常好的凈化與富集能力。

圖7 空白尿樣直接分析色譜圖

圖8 空白尿樣經(jīng)3p-HF-LPME后色譜圖

圖9 濃度為500μg/L萃取后的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的加標(biāo)尿樣直接分析色譜圖；1-嗎啡，2-可待因，3-O6-單乙酰嗎啡

圖10 目標(biāo)分析物的濃度為500μg/L經(jīng)過(guò)3p-HF-LPME后色譜圖；1-嗎啡，2-可待因，3-O6-單乙酰嗎啡

2.4 富集倍數(shù)與回收率

取預(yù)先調(diào)好pH為9的健康人尿液，添加混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，定容為10mL，分別配制3種目標(biāo)分析物的濃度分別為 50μg/L、200μg/L、500μg/L的樣品相，在優(yōu)化的高效液相色譜條件與 3p-HF-LPME萃取條件下，按1.3的萃取操作進(jìn)行，直接進(jìn)行HPLC分析，每個(gè)樣品平行萃取5次。目標(biāo)物的峰高響應(yīng)值與 50μg/L、200μg/L、500μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰高響應(yīng)值比較，按照1.5的計(jì)算公式，得到富集倍數(shù)。

在回收率計(jì)算中，其中樣品相體積Vs固定為10mL，接收相體積按照 1cm內(nèi)腔為 600μm聚丙烯中空纖維的體積約為2.6μL（一般情況下長(zhǎng)度為1cm，壁厚為200μm，內(nèi)徑為600μm，壁孔為0.2μm的中空纖維可固載體積為8μL的有機(jī)溶劑，內(nèi)腔內(nèi)可容納 2.6μL的 溶劑[5]）， 則 本 實(shí) 驗(yàn) 的 接收 相 體 積 為13μL，樣品相體積10mL，按照1.5的計(jì)算公式，得到目標(biāo)分析物的萃取回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表 1 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因富集倍數(shù)與回收率計(jì)算結(jié)果

2.5 工作曲線制備、檢測(cè)限、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

向pH為9的尿液中添加混合工作液，稀釋配制濃度分別為 10μg/L，20μg/L，50μg/L，100μg/L，500μg/L不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的萃取條件下，按1.4色譜條件檢測(cè)，繪制工作曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)，以3倍信噪比計(jì)算最低檢測(cè)限。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表 2 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.6 吸毒嫌疑人尿液的檢測(cè)

在優(yōu)化的萃取條件和高效液相色譜條件下，取某地的吸食海洛因嫌疑人的送檢的尿液進(jìn)行了萃取和測(cè)定，經(jīng)計(jì)算，該嫌疑人尿液中嗎啡、O6-單乙酰嗎啡及可待因濃度為4.7、3.8、0.23mg/L。檢測(cè)結(jié)果表明該嫌疑人吸食毒品海洛因。

[1]中國(guó)國(guó)家禁毒委員會(huì)，2015年中國(guó)禁毒報(bào)告，2015年3月．

[2]王國(guó)建，李敏剛，馬治平等，SPME結(jié)合衍生化檢測(cè)尿液中嗎啡成份[J]，刑事技術(shù)，2004:34-35．

[3]劉慶艷，羅芳苜，尿液中違禁藥物的載體促進(jìn)傳遞液相微萃取—高效液相色譜法測(cè)定[J]，分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2009年（5）：23-26．

[4] Pedersen-Bjergaard S,Rasmussen Knut Einar．Liquid-phase microextraction w ith porous hollow fibers,a miniaturized and highly flexible format for liquid liquid extraction [J]．Journal of Chromatography A,2008,1184: 132-142．

[5]朱穎，陳璇，鄭飛浪，白小紅．三相中空纖維液相微萃取在羥基苯甲酸類(lèi)化合物分析中的應(yīng)用[J]，色譜，2009，27：56-60．

[6]Ho T S,Reubsaet J L E,Anthonsen H S, Pedersen-Bjergaard S,Rasmussen K E J．Liquid-phase microextraction based on carriermediated transportcombined w ith liquid chromatographymassspectrometry:new concept for thedetermination ofpolardrugsin asingledrop ofhuman plasma[J]．Chromatogr．A,2005,1072（1）29-36．

（責(zé)任編輯：于 萍）

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2095-7939(2015)03-0074-04

2015-04-07

王丹 （1978-），遼寧葫蘆島人，中國(guó)刑警學(xué)院禁毒學(xué)系副教授，中國(guó)人民公安大學(xué)在讀博士生，主要從事禁毒學(xué)、毒品合成與檢驗(yàn)方面的研究。