轉(zhuǎn)染Smad3-siRNA的活化肝星狀細(xì)胞Smad3表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)分泌量變化

李萍，王俊嶺，江智龍，楊秋輝，劉丹，李斯(天津市第二人民醫(yī)院，天津市肝病醫(yī)學(xué)研究所，天津00000; 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院;天津中醫(yī)藥大學(xué))

轉(zhuǎn)染Smad3-siRNA的活化肝星狀細(xì)胞Smad3表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)分泌量變化

李萍1，王俊嶺2，江智龍3，楊秋輝2，劉丹3，李斯3
(1天津市第二人民醫(yī)院，天津市肝病醫(yī)學(xué)研究所，天津300000; 2天津醫(yī)科大學(xué)研究生院;3天津中醫(yī)藥大學(xué))

摘要:目的轉(zhuǎn)染Smad3-siRNA的活化肝星狀細(xì)胞(HSCs)Smad3表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)分泌量變化。方法利用生物軟件進(jìn)行Smad3mRNA模擬，選擇合適的靶位點(diǎn)，使用pSilencer3.1-H1-hygro載體表達(dá)Smad3特異性siRNA。將Smad3-siRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞株，將HSC-T6細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)60%～80%后，每3孔為1組，共分為4組，HSC-T6組細(xì)胞未經(jīng)過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染;空白質(zhì)粒組細(xì)胞經(jīng)過(guò)不含Smad3-siRNA的空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染; 1 μg Smad3-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞經(jīng)過(guò)含有1 μg Smad3-siRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染; 2 μg Smad3-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞經(jīng)過(guò)含有2 μg Smad3-siRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。應(yīng)用RT-PCR法、Western blotting法分別檢測(cè)Smad3mRNA和蛋白，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞上清膠原Ⅲ。結(jié)果成功構(gòu)建siRNA表達(dá)克隆。HSC-T6組、空白質(zhì)粒組、1 μg Smad3-siRNA組、2 μg Smad3-siRNA組的Smad3mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.98±0.06、0.98±0.10、0.72±0.10、0.31±0.15，Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.98±0.01、0.96±0.02、0.73±0.03、0.30±0.02，膠原Ⅲ含量分別為33.11±0.45、33.55± 1.00、17.93±1.05、11.80±1.31，1 μg Smad3-siRNA組、2 μg Smad3-siRNA組分別與HSC-T6組比較，1 μg Smad3-siRNA組、2 μg Smad3-siRNA組分別與空白質(zhì)粒組比較，1 μg Smad3-siRNA組與2 μg Smad3-siRNA組比較，P均＜0.05。結(jié)論在體外實(shí)驗(yàn)中真核表達(dá)載體Smad3-siRNA可有效地抑制HSCs中Smad3的表達(dá)，并可減少激活的HSCs分泌細(xì)胞外基質(zhì)。

關(guān)鍵詞:肝星狀細(xì)胞; Smad3-siRNA真核表達(dá)載體;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β

研究［1］顯示，活化的肝星狀細(xì)胞(HSCs)是肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)信號(hào)途徑在肝臟纖維化中發(fā)揮重要作用。Smad3在信號(hào)傳輸途徑中處于中樞地位，將TGF-β的信號(hào)傳遞到核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)［2，3］。RNA干擾技術(shù)為研究?jī)?nèi)源性基因功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供了強(qiáng)有力的研究工具。本研究針對(duì)Smad3基因設(shè)計(jì)RNAi的真核表達(dá)載體，特異性干擾Smad3的基因的表達(dá)，以確定其能否對(duì)活化的HSCs產(chǎn)生作用。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株、質(zhì)粒含H1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄載體pSilencer3.1-H1-siRNAhygro質(zhì)粒購(gòu)于美國(guó)Ambion公司，HSC-T6細(xì)胞株由美國(guó)紐約西奈山醫(yī)學(xué)院Friedman教授惠贈(zèng)。

1.2主要試劑T4DNA連接酶、T4磷酸激酶、SalⅠ(大連寶生物公司)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Metafectene(德國(guó)Biontex公司)，膠原ⅢELISA試劑盒(Uscnlife公司)。

1.3設(shè)計(jì)軟件采用Ambion公司的設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)合成針對(duì)Smad3基因shRNA的寡核苷酸序列。有效靶序列: 5'-AACGTGAACACCAAGTGCATT-3'(Smad3mRNA第492位，GenBank NM_016769)。DNA寡核苷酸單鏈按照表達(dá)shRNA的原則設(shè)計(jì)，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。其shRNA的DNA Olig: 5'-GATCCGCGTGAACACCAAGTGCATTCTATGGACAAATGCACTTGGTGTTCACGTTTTTTGTCGACA-3'互補(bǔ)鏈3'-GCGCACTTGTGGTTCACGTAAGATACCTGTTTACGTGAACCACAAGTGCAAAAAACAGCTGTTCGA-5'內(nèi)含BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ酶切位點(diǎn)。正、負(fù)DNA寡核苷酸單鏈經(jīng)退火后可形成具有黏性末端的DNA雙鏈，磷酸化處理后，并可進(jìn)一步與經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后的pSilencer3.1-H1-hygro載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑取重組陽(yáng)性克隆行酶切鑒定及測(cè)序鑒定。構(gòu)建成轉(zhuǎn)錄siRNA的質(zhì)粒以及實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照質(zhì)粒。

1.4 Smad3-siRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)60%～80%后，利用脂質(zhì)體Metafectene轉(zhuǎn)染表達(dá)siRNA pSilencer3.1-H1-hygro質(zhì)粒，混合比例為

1∶4(質(zhì)量∶體積)，轉(zhuǎn)染步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后6 h，換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，48 h后抽提總RNA和總蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 HSC-T6細(xì)胞Smad3mRNA檢測(cè)采用RTPCR法。將HSC-T6細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)60%～80%后，每3孔為1組，共分為4組，HSC-T6組細(xì)胞未經(jīng)過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染;空白質(zhì)粒組細(xì)胞經(jīng)過(guò)不含Smad3-siRNA的空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染; 1 μg Smad3-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞經(jīng)過(guò)含有1 μg Smad3-siRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染; 2 μg Smad3-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞經(jīng)過(guò)含有2 μg Smad3-siRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。各組干預(yù)48 h后，24孔板每孔加人500 μL TRIzol試劑，靜置5min。槍頭吹打后吸入離心管中，加人100 μL氯仿，離心后取上清加人異丙醇沉淀，抽提總RNA。Smad3引物使用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)。序列: 5'-GAACGGGCAGGAGGAGAAAT-3'、5'-CCACAGGCGGCAGTAGATGA-3'，208 bp，反應(yīng)條件為50℃、30min，94℃、4min，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、2min，30個(gè)循環(huán)，72℃、10min。RT-PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠電泳。以β-actin為內(nèi)參照基因，正義鏈: 5'-CGCTGCGCTGGTCGACA-3';反義鏈: 5'-GTCAGGCACGATTTCCCGCT-3'，目的基因620 bp。mRNA表達(dá)采用Gel Scan軟件進(jìn)行灰度掃描，半定量分析。

1.6 HSC-T6細(xì)胞Smad3蛋白檢測(cè)采用Westernblotting法。將HSC-T6細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)60%～80%后，每3孔為1組，共分為4組，HSC-T6組細(xì)胞未經(jīng)過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染;空白質(zhì)粒組細(xì)胞經(jīng)過(guò)不含Smad3-siRNA的空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染; 1 μg Smad3-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞經(jīng)過(guò)不含Smad3-siRNA的空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染; 2 μg Smad3-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞經(jīng)過(guò)含有2 μg Smad3-siRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。各組經(jīng)48 h轉(zhuǎn)染后，提取細(xì)胞蛋白，按照Biod-ford法測(cè)定蛋白水平。跑SDS-PAGE膠后，轉(zhuǎn)膜1 h，5%的脫脂奶粉封閉2 h，以5%的脫脂奶粉稀釋一抗Smad3抗體Santa Cruz公司(1∶200)，室溫孵育2 h，4℃過(guò)夜;次日PBS洗10min×3，以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗1∶2 000(5%的脫脂奶粉稀釋)室溫孵育2 h，PBS洗10min×3，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。β-actin為內(nèi)參照蛋白。蛋白表達(dá)采用Gel Scan軟件進(jìn)行灰度掃描，半定量分析。

1.7 HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)上清中膠原Ⅲ檢測(cè)Smad3-siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞48 h后，按照說(shuō)明書(shū)收取細(xì)胞上清液利用ELISA方法測(cè)定膠原Ⅲ含量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料珋x±s表示，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組各組間是否存在顯著性差異分析采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

經(jīng)酶切鑒定，質(zhì)粒Psilence3.1-H1-hygro序列里面2727的位置是有一個(gè)SalⅠ的酶切位點(diǎn)的，而在我們的插入序列里面設(shè)計(jì)了SalⅠ的酶切位點(diǎn)，如果插入正確，就應(yīng)該能夠被SalⅠ酶切出兩條DNA條帶，一條2 170 bp，另一條2 382 bp;而質(zhì)粒Smad3-siRNA能被SalⅠ酶切出兩條DNA條帶，即均為插入正確的質(zhì)粒。挑取已轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒菌種測(cè)序。經(jīng)測(cè)序，結(jié)果完全符合設(shè)計(jì)要求，詳見(jiàn)圖1。各組HSCT6細(xì)胞Smad3mRNA、蛋白表達(dá)及細(xì)胞上清中膠原Ⅲ含量比較見(jiàn)表1。

圖1　Smad圖3-siRNA重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖

表1　各組HSC-T6細(xì)胞Smad3mRNA、蛋白表達(dá)及細(xì)胞上清中膠原Ⅲ含量比較()

表1　各組HSC-T6細(xì)胞Smad3mRNA、蛋白表達(dá)及細(xì)胞上清中膠原Ⅲ含量比較()

注:與HSC-T6組比較，*P＜0.05;與空白質(zhì)粒組比較，△P＜0.05;與1 μg Smad3-siRNA組比較，#P＜0.05。

組別　Smad3mRNA　Smad3蛋白　　膠原Ⅲ(μg/mL)HSC-T6組0.98±0.06　0.98±0.01　33.11±0.45空白質(zhì)粒組　0.98±0.10　0.96±0.02　33.55±1.00 1 μg Smad3-siRNA組　0.72±0.10＊△　0.73±0.03＊△　17.93±1.05＊△2 μg Smad3-siRNA組　0.31±0.15＊△#　0.30±0.02＊△#11.80±1.31＊△

3　討論

盡管肝纖維化的防治和治療研究取得了很大的進(jìn)步，但是肝纖維化仍然是威脅人類(lèi)健康的一個(gè)重要疾病。RNA干擾技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基因治療和功能基因組學(xué)的研究中，并顯示出良好的效果［4］。以載體形式在體內(nèi)表達(dá)shRNA，是一種產(chǎn)生RNA干擾的良好方式，它與化學(xué)合成的雙鏈RNA作用一致，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用低，故適于推廣應(yīng)用［5，6］。siRNA除了可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞水平上阻斷

基因的表達(dá)外，在動(dòng)物水平上亦可特異而高效地抑制外源基因和內(nèi)源基因(轉(zhuǎn)基因鼠)的表達(dá)［7～9］。本實(shí)驗(yàn)選擇Smad3基因，根據(jù)文獻(xiàn)［10］的siRNA設(shè)計(jì)原則和Ambion網(wǎng)站提供的設(shè)計(jì)原則及設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)siRNA進(jìn)行干擾研究。

活化的HSCs在肝纖維化過(guò)程中起關(guān)鍵作用，是肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。為增加siRNA的穩(wěn)定性，我們?cè)O(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)錄發(fā)夾狀siRNA的DNA質(zhì)粒，并且在5'端進(jìn)行了磷酸化，因5'端磷酸化的siRNA其活性明顯高于非磷酸化的siRNA。測(cè)序和酶切結(jié)果表明，含有發(fā)夾狀siRNA的質(zhì)粒序列與我們?cè)O(shè)計(jì)的相符。結(jié)果表明，我們?cè)O(shè)計(jì)的siRNA對(duì)Smad3產(chǎn)生了很好的抑制效果，轉(zhuǎn)染表達(dá)RNAi干預(yù)HSC-T6細(xì)胞48 h后，Smad3mRNA、蛋白隨干預(yù)劑量的增加表達(dá)下降，與空白質(zhì)粒組及HSC-T6組比較，P均＜0.05。同時(shí)，2 μg Smad3-siRNA組與1 μg Smad3-siRNA組相比，P＜0.05?？瞻讓?duì)照無(wú)論在RNA水平還是在蛋白水平上都沒(méi)產(chǎn)生抑制作用，表明siRNA作用是序列特異性的。

另有研究［11，12］顯示，Smad7具有抑制肝纖維化進(jìn)展的作用，而Smad3參與肝纖維化進(jìn)展。在Smad3受到阻斷后，是否有其他Smad蛋白或信號(hào)傳導(dǎo)通路如骨形態(tài)發(fā)生蛋白在起作用尚需要深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的膠原Ⅲ含量在1 μg Smad3-siRNA組與2 μg Smad3-siRNA組有明顯下降，且空白質(zhì)粒組及HSC-T6組比較P均＜0.05。同時(shí)，2 μg Smad3-siRNA組與1 μg Smad3-siRNA組相比P＜0.05。TGF-β1是組織纖維化病變中最重要的促發(fā)因子之一，TGF-β1相繼與TGFβ-Ⅱ型受體、TGFβ-Ⅰ型受體結(jié)合，再與Smad2、Smad3結(jié)合，最后與Smad4結(jié)合形成異多聚體，才能進(jìn)入核中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。Smad3信號(hào)通路在調(diào)控TGF-β1介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)沉積過(guò)程中處于十分重要的地位，能介導(dǎo)TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)肝纖維化［13～15］。本實(shí)驗(yàn)表明阻斷Smad3表達(dá)，使TGF-β1信號(hào)通路傳導(dǎo)障礙，造成了HSCs膠原分泌的減少。因此，靶向調(diào)整Smad3的表達(dá)水平能有效降低肝細(xì)胞外基質(zhì)，有望成為臨床防治肝纖維化的一個(gè)有效途徑。

參考文獻(xiàn):

［1］Kongd，Zhang F，Zhang Z，et al.Clearance of activated stellate cells for hepatic fibrosis regression:molecular basis and translational potential［J］.Biomed Pharmacother，2013，67(3): 246-250.

［2］Shi Y，Massague J.Mechanisms of TGF-beta signaling from cellmembrane to the nucleus［J］.Cell，2003，113(6): 685-700.

［3］Meyer C，Godoy P，Bachmann A，et al.Distinct role of endocytosis for Smad and non-Smad TGF-β signaling regulation in hepatocytes［J］.J Hepatol，2011，55(2): 369-378.

［4］Keaney J，Campbellm，Humphries P.From RNA interference technology to effective therapy: how far have we come and how far to go ［J］.Therdeliv，2011，2(11):1395-1406.

［5］RaodD，Vorhies JS，Senzer N，et al.siRNA vs.shRNA: similarities anddifferences［J］.Advdrugdeliv Rev，2009，61(9): 746-759.

［6］Shumd，Djaballah H.Plasmid-based shRNA lentiviral particle production for RNAi applications［J］.J Biomol Screen，2014，19(9): 1309-1313.

［7］Chang K，Marran K，Valentine A，et al.RNAi in culturedmammalian cells using synthetic siRNAs［J］.Cold Spring Harb Protoc，2012，2012(9): 957-961.

［8］Lwisd，Hagstrom JE，Loomis AG，et al.Efficientdelivery of siRNA for inhibition of gene expression in postnatalmice［J］.Genetics，2002，32(1): 107-108.

［9］McCaffrey AP，Meuse L，Pham TT，et al.RNA interference in adultmice［J］.Nature，2002，418(6893): 38-39.

［10］Petri S，Meister G.siRNAdesign principles and off-target effects ［J］.Methodsmol Biol，2013，(986): 59-71.

［11］Dooley S，Hamzavi J，Ciuclan L，et al.Hepatocyte-specific Smad7 expression attenuates TGF-beta-mediated fibrogenesis and protects against liverdamage［J］.Gastroenterology，2008，135(2): 642-659.

［12］Tang LX，He RH，Yang G，et al.Asiatic acid inhibits liver fibrosis by blocking TGF-beta/Smad signaling in vivo and in vitro［J］.PLoS One，2012，7(2): e31350.

［13］Derynck R，Zhang YE.Smad-dependent and Smad independent pathways in TGF-beta family signalling［J］.Nature，2003，425(6958): 577-584.

［14］Liu J，Zhuo X，Liu W，et al.Resveratrol inhibits high glucose induced collagen upregulation in cardiac fibroblasts through regulating TGF-β1-Smad3 signaling pathway［J］.Chem Biol Interact，2015，(227): 45-52.

［15］Gauldie J，Bonniaud P，Sime P，et al.TGF-beta，Smad3 and the process of progressive fibrosis［J］.Biochem Soc Trans，2007，35(Pt4): 661-664.

·臨床研究·

收稿日期:( 2015-04-18)

通信作者:李萍

文章編號(hào):1002-266X(2015)35-0031-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類(lèi)號(hào):R575

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.35.010