小腦頂核通過小腦-下丘腦通路參與卒中后抑郁的實驗觀察

李 媛，隋汝波，張 欣，林宇涵

（1．遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧錦州 121001；2．撫順礦務(wù)局總醫(yī)院藥劑科，遼寧撫順 113008；3．遼寧醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，遼寧錦州 121000）

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是卒中最常見并發(fā)癥之一，占卒中患者的39%～52%［1］，然而PSD的發(fā)病機制仍未明。

近期ROBINSON等提出了PSD炎性細(xì)胞因子學(xué)說。然而導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子持續(xù)升高的始動因素仍未知。我們在觀察電針刺激PSD大鼠完骨穴，此穴位對 應(yīng)于小 腦頂 核 （medial cerebellar nucleus，Med）的前期研究中發(fā)現(xiàn)，與PSD組相比，電針組大鼠的抑郁行為學(xué)測試明顯改善［2］。因此，我們猜想Med損傷極可能是PSD的發(fā)病機制［3］。

另外，近年研究證實電刺激Med能顯著降低炎性細(xì)胞因子水平［4］，而破壞 Med后血中炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生增加［5］。神經(jīng)解剖學(xué)研究表明，下丘腦是免疫功能調(diào)節(jié)的最重要中樞［6-7］，Med發(fā)出的纖維，經(jīng)小腦上腳交叉（superior cerebellar peduncle，xscp）投射至對側(cè)下丘腦，主要分布在下丘腦外側(cè)區(qū)（lateral hypothalamic area，LHA）［8］。 因 此，有 理 由 相 信Med對炎性細(xì)胞因子的影響極可能是通過下丘腦實現(xiàn)的。為此，本研究從小腦-下丘腦投射入手進(jìn)一步揭示Med損傷致PSD發(fā)病的作用途徑。

1 材料與方法

1．1 動物 選用成年SD大鼠50只，體質(zhì)量250～300g，雌雄兼有。大鼠給予自由飲水和進(jìn)食，白天和夜晚各12h的睡眠、活動時間。

1．2 分組 大鼠隨機分為5組，每組10只。為假手術(shù)組、卒中組、PSD組、Med損毀組、xscp損毀組。

1．3 模型建立

1．3．1 假手術(shù)組 僅切開皮膚不行大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）術(shù)。

1．3．2 卒中組 行 MCAO 手術(shù)［9］，大鼠腹腔注射40g／L水合氯醛（4mL／kg）麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上。頸部正中切開后，鈍性分離周圍組織，暴露左側(cè)頸總動脈（CCA）、頸內(nèi)動脈（ICA）、頸外動脈（ECA）和迷走神經(jīng)。用微動脈夾暫時夾閉CCA。距CCA分叉處近心端0．5cm處將CCA剪一小口，插入肝素化的燒頭尼龍線從CCA沿著ICA推進(jìn)，阻斷大腦中動脈（MCA）血流。進(jìn)入ICA的尼龍線從CCA分叉處到MCA大約18mm左右，有效地阻斷了MCA血流。結(jié)扎CCA并固定魚線。

1．3．3 PSD組 使用 MCAO模型，18d慢性溫和刺激（chronic mild stress，CMS）與隔離飼養(yǎng)。CMS改編自Willner的方案［10］。9種刺激每天隨機采取1種，為期18d：①禁食禁水20h；②禁水17h；③傾斜鼠籠（45°）17h；④隔夜光照36h；⑤臟籠（100g鋸末＋200mL水）21h；⑥4℃游泳5min；⑦水平搖晃5min；⑧行為限制2h；⑨夾尾1min。將動物單獨飼養(yǎng)，不接觸其他動物。

1．3．4 Med損毀組［11］使用 MCAO 模型，大鼠腹腔注射40g／L水合氯醛（4mL／kg）麻醉后固定于腦立體定位儀上（David Kopf 902-A，美國）。在雙側(cè)Med內(nèi)，分別緩慢注入1g／L海人酸（Kainic acid，KA）（Sigma）溶液0．4μL，注射部位依據(jù)《Paxions ＆Watson大鼠腦圖譜》［12］Med （A：-11．6，L：0．4～1．0，H：5．5～6．2），注射完留針10min，徐徐起針，縫合創(chuàng)面。注射完畢，動物注意保暖等待麻醉后恢復(fù)。手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)7d。

1．3．5 xscp損毀組［13］使用 MCAO模型，大鼠麻醉和固定的方法同上。依據(jù)《Paxions ＆Watson大鼠腦圖譜》［12］xscp（坐標(biāo)為 A：6．7～8．0，L：0，H：7．8～8．0）。損毀電極（同心圓電極NEX100，外徑0．25mm，直流阻抗3～6MΩ），連接A320R型隔離刺激器（美國WPI公司）通以直流電，強度0．5mA，持續(xù)10s，電損毀后留針10min，徐徐起針縫合創(chuàng)面。術(shù)后處置同上。

1．4 行為學(xué)觀察和測試 在各組大鼠第7、14、21天測量體質(zhì)量，行曠野實驗、蔗糖水實驗。①曠野實驗：室內(nèi)隔音，測定5min水平運動得分；②蔗糖水實驗：10h禁食禁水后，同時給予10g／L蔗糖水和純水1瓶，測定1h糖水飲用比例（糖水消耗／總液體消耗×100%）。

1．5 微透析 大鼠經(jīng)腹腔注射200g／L烏拉坦（8mL／kg）麻醉劑麻醉后固定于腦立體定位儀上。依據(jù)《Paxions ＆ Watson大鼠腦圖譜》［12］LHA（A：-1．8～2．56，L：1．4～2．6，H：7．6～8．4）。微透析探針（CMA12，瑞典）濾過膜長度為1mm。鉆孔開顱后將透析探針按坐標(biāo)植入，以人工腦脊液2μL／min的速度灌流，所得的透析液流入冰浴的收集管中，前1h的透析液棄去，每隔30min收集1管，共2管。收集好的透析液立即放入-80℃冰箱中冷凍待測。最終參與統(tǒng)計的Glu和GABA值取2管透析液測定值的平均值。

1．6 高效液相色譜-熒光法檢測Glu、GABA水平HPLC系統(tǒng)包括Aglient1200、G1321A熒光檢測器、化學(xué)工作站。色譜柱（Eclipse AAA 4．6mm×150 mm，5μm），衍生液：將5mg OPA溶于120μL加入β-巰基乙醇10μL和0．2mol／L硼酸緩沖液（pH＝9．2）1mL，混勻，存放于暗處備用。流動相：A液為緩沖液∶甲醇∶四氫呋喃（V∶V∶V）＝400∶95∶5；B液為緩沖液∶甲醇（V∶V）＝120∶380（緩沖液為20 mol／L乙酸鈉溶液，pH＝7．2）。流速：0．8mL／min；PMT：12；柱溫：40℃。梯度洗脫：0～10min為0%～63%B液；10～20min為63%B液；12～17min為100%B液；17～18min為100%～0%B液；18～21min為0%B液。OPA柱前自動衍生；激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長455nm。

2 結(jié) 果

2．1 動物模型損毀及微透析腦組織Nissl染色的病理學(xué)改變 大鼠Med注射KA后的小腦Nissl染色切片，可見Med內(nèi)的Nissl小體基本消失，損毀僅限于Med，在Med上方見一注射針道（圖1A）；電毀損xscp后，該部位有近似球形的空洞形成，空洞以電極尖端為中心（圖1C）；Nissl染色切片上，Med上方見微透析探針的針道，針道周圍伴有出血（圖1E）。

圖1 動物模型損毀及微透析腦組織Nissl染色的病理學(xué)改變Fig．1 Pathological changes of brain tissue Nissl staining after lesion or microdialysis

2．2 各組大鼠行為學(xué)評分的變化 無論是在7、14、21d，與卒中組比較，PSD組大鼠體質(zhì)量下降，蔗糖水消耗減少，曠野試驗水平運動評分也減少（P＜0．01）。而與PSD組比較，無論是Med損毀組還是xscp損毀組的差異并不顯著（P＞0．05，表1～表3）。

表1 各組大鼠不同時間點體質(zhì)量的變化Tab．1 Rat body mass in different groups at different time points（g，±s）

表1 各組大鼠不同時間點體質(zhì)量的變化Tab．1 Rat body mass in different groups at different time points（g，±s）

與卒中組比，＊P＜0．01，n＝10。

組別 時 間7d 14d 21d假手術(shù)組278．6±22．6 291．4±27．1 304．3±29．3卒中組 285．3±23．5 307．3±24．5 305．2±25．3 PSD組 280．9±22．6＊ 265．1±18．1＊ 252．4±20．1＊Med損毀組 283．2±24．2＊ 271．2±25．2＊ 258．4±21．7＊xscp損毀組 285．3±25．2＊ 276．3±23．8＊ 264．5±22．3＊

2．3 各組大鼠LHA細(xì)胞外Glu、GABA水平的比較無論是在7、14、21d，假手術(shù)組LHA細(xì)胞外 Glu、GABA呈高水平表達(dá)；與假手術(shù)組比較，卒中組LHA細(xì)胞外Glu、GABA含量沒有差別（P＞0．05）。與卒中組相比，PSD時Glu水平顯著下降（P＜0．01）。相比之下，無論是Med損毀后還是xscp損毀后Glu水平都沒有顯著的變化（P＞0．05，圖2）。有趣的是，Med損毀后LHA細(xì)胞外GABA幾乎完全取消了。而xscp損毀的大鼠GABA水平雖然下降但仍可檢測出，但明顯比PSD組大鼠低（P＜0．05，圖2）。各組內(nèi)各時間點Glu、GABA水平無統(tǒng)計學(xué)差異（圖2）。

表2 各組大鼠不同時間點蔗糖水消耗的變化Tab．2 Sugar consumption in rats of different groups at different time points（mL，±s）

表2 各組大鼠不同時間點蔗糖水消耗的變化Tab．2 Sugar consumption in rats of different groups at different time points（mL，±s）

與卒中組比，＊P＜0．01，n＝10。

組別 時 間7d 14d 21d假手術(shù)組40．6±4．3 38．4±4．1 37．3±4．5卒中組 38．3±6．2 37．5±4．7 34．8±5．5 PSD組 25．6±3．8＊ 19．8±4．9＊ 16．7±3．2＊Med損毀組 22．5±3．9＊ 17．7±4．6＊ 15．4±5．7＊Xscp損毀組 22．6±4．7＊ 16．1±3．9＊ 14．7±5．6＊

表3 各組大鼠不同時間點曠野實驗水平運動評分的變化Tab．3 Horizontal motion of rats in different groups at different time points（cm，±s）

表3 各組大鼠不同時間點曠野實驗水平運動評分的變化Tab．3 Horizontal motion of rats in different groups at different time points（cm，±s）

與卒中組比，＊P＜0．01，n＝10。

組別 時 間7d 14d 21d假手術(shù)組55．6±4．5 58．3±3．1 60．9±4．7卒中組 51．1±4．7 55．6±5．3 55．8±4．2 PSD組 39．1±4．4＊ 33．4±3．8＊ 27．2±2．9＊Med損毀組 38．4±4．2＊ 32．5±2．4＊ 29．2±3．2＊xscp損毀組 35．6±2．6＊ 31．7±4．3＊ 30．3±2．1＊

圖2 各組大鼠LHA細(xì)胞外Glu、GABA水平的比較Fig．2 Comparison of extracellular LHA glutamate and GABA levels in different groups of rats

3 討 論

本實驗通過頸內(nèi)動脈線栓法制備左側(cè)局灶性腦缺血大鼠模型，在此基礎(chǔ)上給予18d慢性溫和刺激與隔離飼養(yǎng)。此后，進(jìn)行行為學(xué)檢測，結(jié)果顯示無論是在7、14、21d，大鼠都出現(xiàn)顯著的體質(zhì)量持續(xù)減輕、蔗糖水消耗量持續(xù)降低、曠野試驗水平運動明顯異常。這模擬了PSD患者卒中后出現(xiàn)的體質(zhì)量下降、興趣感減退、活動減少等表現(xiàn)。我們利用KA僅損毀神經(jīng)元胞體而不影響神經(jīng)纖維的特性，在Med內(nèi)注射KA來破壞Med的神經(jīng)元胞體，Nissl染色證實了Med內(nèi)的Nissl小體基本消失。我們也應(yīng)用電損毀技術(shù)，在xscp部位局限性地?fù)p毀Med至下丘腦的投射神經(jīng)纖維，Nissl染色證實xscp部位有近似球形的空洞形成。以上均說明本實驗制備的各組大鼠模型成功。

以往應(yīng)用順行或逆行神經(jīng)束追蹤劑研究表明，小腦和下丘腦之間存在著結(jié)構(gòu)上的直接雙向神經(jīng)纖維投射，其中Med的離核纖維可走行于小腦上腳，至xscp交叉到對側(cè)，直接投射到下丘腦的眾多核團(tuán)，構(gòu)成小腦-下丘腦直接投射［14］。本研究結(jié)果表明，Med損毀組大鼠和xscp損毀組大鼠體質(zhì)量減輕、蔗糖水消耗降低、曠野試驗水平運動評分減少，并且與PSD組大鼠相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，我們可以得出當(dāng)大鼠卒中后Med病變或小腦-下丘腦通路發(fā)生病變后也會出現(xiàn)抑郁的表現(xiàn)。

電生理學(xué)研究也從功能上證明，電刺激Med可引起LHA神經(jīng)元產(chǎn)生單突觸和多突觸反應(yīng)，且以單突觸反應(yīng)為主，其中單突觸反應(yīng)大多為抑制性，而多突觸反應(yīng)以興奮性為主［15］。免疫組織化學(xué)研究也證實了小腦-下丘腦投射的神經(jīng)遞質(zhì)是GABA或Glu［14-15］。鑒于上述研究，本實驗把GABA和Glu作為檢測指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與卒中組比較，PSD組大鼠LHA細(xì)胞外Glu、GABA水平都有不同程度的降低，GABA下降的更多。同時KA毀損大鼠雙側(cè)Med后，LHA細(xì)胞外Glu、GABA水平顯著下降，提示Med功能下降可能參與了PSD的發(fā)病。另外，我們進(jìn)一步應(yīng)用電損毀技術(shù)，在xscp處損毀Med至下丘腦投射的神經(jīng)纖維，大鼠LHA細(xì)胞外Glu、GABA水平下降，這些結(jié)果與損毀Med神經(jīng)元后的結(jié)果一致。因而，提示Med可能通過小腦-下丘腦通路的神經(jīng)投射參與了PSD的發(fā)病。

本研究從結(jié)構(gòu)和功能上證明，Med可能通過小腦-下丘腦通路的神經(jīng)投射參與了PSD的發(fā)病，但Med如何通過該通路參與PSD的發(fā)病，至今機制未明。國內(nèi)彭聿平等［16-17］研究發(fā)現(xiàn)，Med至下丘腦的神經(jīng)投射是GABA能和Glu能神經(jīng)投射，他們均參與了Med對炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，破壞Med或小腦-下丘腦通路后炎性細(xì)胞因子水平明顯升高，提示Med至下丘腦的神經(jīng)投射參與了Med對炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用。結(jié)合PSD炎性細(xì)胞因子學(xué)說［18-19］，我們進(jìn)一步推測損傷的 Med可能通過小腦-下丘腦通路的神經(jīng)投射參與了Med對炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用，致使炎性細(xì)胞因子水平明顯升高，升高的炎性細(xì)胞因子通過多種機制導(dǎo)致PSD的發(fā)病。

綜上所述，本實驗初步提示小腦頂核可能參與了卒中后抑郁的發(fā)病，這種參與可能通過小腦-下丘腦通路介導(dǎo)。這些結(jié)果可為進(jìn)一步研究PSD發(fā)病機制提供了一些依據(jù)。

［1］AYERBE L，AYIS S，WOLFE CDA，et al．Natural history，predictors and outcomes of depression after stroke：systematic review and meta-analysis［J］．Br J Psychiatry，2013，202（1）：14-21．

［2］SUI R，ZHANG L．Electroacupuncture at the Wangu（GB12）acupoint suppresses expression of inflammatory factors in the hippocampus and frontal lobe of rats with post-stroke depression［J］．Neural Regen Res，2011，6（36）：2839-2844．

［3］SUI RB，ZHANG L，MIN L，et al．Cerebellar dysfunction may play an important role in post-stroke depression［J］．Med Hypotheses，2009，72（6）：643-646．

［4］GALEA E，GLICKSTEIN SB，F(xiàn)EINSTEIN DL，et al．Stimulation of cerebellar fastigial nucleus inhibits interleukin-1β-induced cerebrovascular inflammation［J］．Am J Physiol，1998，275（6）：2053-2063．

［5］NI SJ，QIU YH，LU JH，et al．Effect of cerebellar fastigial nuclear lesions on differentiation and function of thymocytes［J］．J Neuroimmunol，2010，222（1-2）：40-47．

［6］NEUMANN ID，WIGGER A，TORNER L，et al．Brain oxytocin inhibits basal and stress-induced activity of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis in male and female rats：partial action within the paraventricular nucleus［J］．J Neuroendocrinol，2000，12（3）：235-243．

［7］王蕾，歐可群，陳文玉，等．大鼠下丘腦室旁核對淋巴結(jié)免疫功能的神經(jīng)調(diào)控［J］．免疫學(xué)雜志，2004，20（3）：184-187．

［8］HAINES DE，DIETRICHS E，MIHAILOFF GA，et al．The cerebellar-hypothalamic axis：basic circuits and clinical observations［J］．Int Rev Neurobiol，1997，41：83-107．

［9］LONGA EZ，WEINSTEIN PR，CARLSON S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．Stroke，1989，20（1）：84-91．

［10］WANG SH，ZHANG ZJ，GUO YJ，et al．Anhedonia and activity deficits in rats：impact of post-stroke depression［J］．J Psychopharmacol，2009，23（3）：295-304．

［11］PENG YP，QIU YH，CHAO BB，et al．Effect of lesions of cerebellar fastigial nuclei on lymphocyte functions of rats［J］．Neurosci Res，2005，51（3）：275-284．

［12］PAXINOS G，WATSON C．The rat brain in stereotaxic coordinates［M］．New York：Academic Press，1998：60-691．

［13］MATHERS DA，F(xiàn)ALCONER RJ．The electrolytic lesion as a model of spinal cord damage and repair in the adult rat［J］．J Neurosci Methods，1991，38（1）：15-23．

［14］DIETRICHS E，HAINES DE，RΦSTE GK，et al．Hypothalamocerebellar and cerebellohypothalamic projections：circuits for regulating nonsomatic cerebellar activity？［J］．Histol Histopathol，1994，9（3）：603-614．

［15］MIN BI，OOMURA Y，KATAFUCHI T．Responses of rat lateral hypothalamic neuronal activity to fastigial nucleus stimulation［J］．J Neurophysiol，1989，61（6）：1178-1184．

［16］吳亞芳，邱一華，曹蓓蓓，等．小腦-下丘腦投射在小腦頂核調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞數(shù)量與功能中的介導(dǎo)作用［J］．中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2008，24（4）：457-462．

［17］CAO BB，HUANG Y，LU JH，et al．Cerebellar fastigial nuclear GABA ergic projections to the hypothalamus modulate immune function［J］．Brain Behav Immun，2013，27（1）：80-90．

［18］SPALLETTA G，BOSSU P，CIARAMELLA A，et al．The etiology of poststroke depression：a review of the literature and a new hypothesis involving inflammatory cytokines［J］．Mol Psychiatry，2006，11（11）：984-991．

［19］MILLER AH，MALETIC V，RAISON CL．Inflammation and its discontents：the role of cytokines in the pathophysiology of major depression［J］．Biol Psychiatry，2009，65（9）：732-741．