一例查干湖異育銀鯽洪湖碘泡蟲病原的鑒定與生物信息學(xué)分析

王釗，王好，錢愛東，周井祥，馬悅，祖岫杰，李改娟，劉慧吉，劉艷輝

(1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118;2．吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春130033)

異育銀鯽Carassius auratus gibelio是由方正銀鯽為母本與興國(guó)紅鯉為父本雜交得到的一種重要經(jīng)濟(jì)魚類，經(jīng)過人工培育近30年，年產(chǎn)量近2億t，全國(guó)范圍內(nèi)均有飼養(yǎng)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于異育銀鯽幼魚對(duì)洪湖碘泡蟲的侵襲缺乏抗性［1］，因此，由洪湖碘泡蟲引起的碘泡蟲病嚴(yán)重影響了該經(jīng)濟(jì)魚類的商品價(jià)值。洪湖碘泡蟲Myxobolus honghuensis首次報(bào)道于洪湖市，而且南方地區(qū)為洪湖碘泡蟲病的高暴發(fā)區(qū)，給南方淡水魚養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。碘泡蟲種類繁多，其屬下的諸多種類碘泡蟲均能引起魚類寄生蟲疾病，治療的方法也不盡相同;此外，碘泡蟲感染部位與引起的患病外觀變化大同小異，而且不同種類的蟲體外觀又比較相似，在沒有分子生物學(xué)數(shù)據(jù)作為佐證的前提下，形態(tài)學(xué)鑒定與發(fā)病外觀觀察不足以確診病原［2］。目前，很多學(xué)者開始重視并研究這種寄生蟲，早在1991年，Landsberg等首次報(bào)道了444種碘泡蟲［3］，2005年 Erias等［4］報(bào)道了 744種，2006年 Lom等［5］報(bào)道了792 種，2011 年 Molnár［6］報(bào)道了近 850種碘泡蟲。碘泡蟲的種類繁多表明了這一屬的物種具有多樣性［7］，同時(shí)給該病的診斷也帶來了一定的困難。

近年來，通過免疫學(xué)方法對(duì)該病病原的檢測(cè)已經(jīng)有所研究。早在 2003年，Lu等［8］使用一種MAb2D12單克隆抗體對(duì)圓形碘泡蟲不同發(fā)育期分別進(jìn)行了ELISA、斑點(diǎn)免疫、間接免疫熒光抗體檢測(cè)，均獲得較高的陽性率，這表明使用單抗對(duì)黏孢子蟲進(jìn)行早期檢測(cè)是可行的。張晉勇等［9］應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)成功獲得一株對(duì)圓形碘泡蟲可溶性抗原具有特異性結(jié)合能力的單克隆抗體PCAN-H69，對(duì)該抗體和其他幾株篩選后的單克隆抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)，表明只有該抗體擁有很高的抑制率(88．17%)，證明這種抗體具有很強(qiáng)的特異性，適合用作早期感染的特異性診斷。賈洛等［10］研究了洪湖碘泡蟲的免疫原性并研制了相關(guān)的多抗與三株單抗，經(jīng)過試驗(yàn)證明，這些抗體均具有很強(qiáng)的診斷意義。這些研究表明，采用免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)黏孢子蟲進(jìn)行早期診斷是可行的。但由于黏孢子蟲的種類繁多，種間的相似抗原較多，容易引起大量的交叉反應(yīng)［11］，影響檢測(cè)結(jié)果的特異性，目前對(duì)該病的早期免疫檢測(cè)僅停留在試驗(yàn)階段。而采用分子生物學(xué)方法對(duì)碘泡蟲的鑒定則顯得更為精確可行［12］，通過分析病原體的18S rDNA序列特異性，再與其他已知種類序列進(jìn)行比對(duì)，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹，得到的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)可為形態(tài)鑒定結(jié)果提供重要佐證［13］。

2015年6月初，由于東北地區(qū)氣溫升高降雨頻繁，位于吉林省境內(nèi)的查干湖某淡水魚養(yǎng)殖基地有異育銀鯽魚苗出現(xiàn)游動(dòng)乏力、攝食減少、浮頭消瘦等現(xiàn)象。吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究人員從該養(yǎng)殖基地采集病魚，經(jīng)過初步觀察發(fā)現(xiàn)，病魚眼球突出，鰓蓋下近眼端位置的咽部充血腫大，可見白色腫塊。該養(yǎng)殖基地水體混濁，水溫為24．3℃，初步確定為寄生蟲感染所致。為進(jìn)一步診斷該病病原，筆者對(duì)蟲體進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、可量形狀測(cè)定、生物信息學(xué)分析，旨在為東北地區(qū)碘泡蟲病的發(fā)現(xiàn)與防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

異育銀鯽病魚采自吉林省境內(nèi)的查干湖某淡水魚養(yǎng)殖基地，共20尾，體質(zhì)量為5～10 g，暫養(yǎng)在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院消毒水族室中。

1.2 方法

1．2．1 病魚體外癥狀觀察 觀察病魚整體發(fā)病狀態(tài)。將病魚鰓蓋沿鰓弓線慢慢剪開，使整個(gè)鰓弓暴露在外，觀察咽部病變狀態(tài)。

1．2．2 蟲體形態(tài)學(xué)觀察及可量形狀測(cè)定 參照Zhang等［14］的方法從異育銀鯽魚苗咽部采集碘泡蟲的包囊，再將分離后的蟲體進(jìn)行固定保存［15］，對(duì)蟲體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察［16］，隨機(jī)選取20個(gè)成熟孢子進(jìn)行測(cè)量，使用裝有微米標(biāo)尺的奧林巴斯E-330顯微鏡數(shù)碼照相機(jī)的奧林巴斯IX51顯微鏡進(jìn)行測(cè)量與觀察，獲取成熟孢子的數(shù)字化照片與孢子尺寸數(shù)值。所得測(cè)量結(jié)果與Liu等［17］報(bào)道的洪湖碘泡蟲進(jìn)行對(duì)比，并參照照片繪制蟲體圖片。

1．2．3 蟲體基因組提取及目的片段的克隆、測(cè)序 采用腦穿刺法迅速將魚處死，將分離的包囊進(jìn)行勻漿，采用蔗糖密度梯度離心法制得純化的蟲體［18］，置于1．5 mL 離心管中，加入 500 μL 裂解液 (100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris pH 7．6，10 mmol/L EDTA，0．2%SDS)煮沸10 min，使大部分蟲體脫殼后冷卻至室溫，再加入500 μL新鮮的裂解液與20 μL蛋白酶K(20 mg/mL)，55℃下水浴12 h以上，使用酚-氯仿-異戊醇法抽提基因組。使用的引物為碘泡蟲18S rDNA通用引物MX3/MX5(CCAGGACATCTTAGGGCATCACAGA/CTGCGGACGGCTCAGTAAATCAGT)。PCR反應(yīng)體系:10×buffer 2．5 μL，引物 (20 μmol/L)各 0．5 μL，dNTP(40 μmol/L)1 μL，模板 DNA 2 μL(100 ng)，Ex Taq DNA 聚合酶 (TaKaRa)0．2 μL，最后加滅菌雙蒸水使反應(yīng)總體積為25 μL(膠回收反應(yīng)體系以上各試劑用量加倍，使終體積為50 μL)。反應(yīng)在Eppendorf AG 22331 Hamburg梯度PCR儀中進(jìn)行，PCR反應(yīng)程序:95℃下預(yù)變性5 min;95℃下變性30 s，63．7℃下退火復(fù)性30 s，72℃下延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后在72℃下再延伸10 min，于4℃下保存。膠回收產(chǎn)物經(jīng)過10 g/L瓊脂糖充分分離后，切下目的條帶使用AxyGen膠回收純化試劑盒純化后連接至PMD-18T載體中，經(jīng)酶切鑒定后提交至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果在GenBank上進(jìn)行序列比對(duì)。

1．2．4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 采用DNAStar Lasergene 7．1軟件分析序列相應(yīng)屬性，采用 ClustalⅣ對(duì)GenBank中已知洪湖碘泡蟲18S rDNA保守序列與本試驗(yàn)克隆的序列進(jìn)行對(duì)比分析，應(yīng)用MegAlign模塊構(gòu)建該分離株與15種常見碘泡蟲的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹，分析待鑒定碘泡蟲與其他碘泡蟲的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 病魚體外癥狀觀察

病魚外觀消瘦，體表粗糙，顏色蒼白，黏液分泌較少，眼球外凸。鰭條和腹部鱗片等處有出血點(diǎn)與潰瘍。鰓蓋下鰓弓近眼端的咽喉部存在大片乳白色囊腫，囊腫質(zhì)地較軟易破，囊膜較薄，內(nèi)含干酪樣黏稠包囊液。病魚癥狀詳見圖1。

圖1 病魚臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of sick fish

2.2 蟲體形態(tài)學(xué)觀察及可量形狀測(cè)定

孢子正面觀呈梨形，縫面觀呈梭形，擁有兩個(gè)極囊，大小不一，少數(shù)存在尾突 (圖2)。孢子的形態(tài)測(cè)量數(shù)據(jù)見表1，根據(jù)顯微圖繪制的模擬圖見圖3。

圖2 蟲體形態(tài)圖Fig.2 The morphology of the parasite

2.3 生物信息學(xué)分析

克隆所得的片段大小約為750 bp(圖4)，測(cè)序結(jié)果顯示，其大小為727 bp。Blast比對(duì)分析結(jié)果顯示，與GenBank登錄號(hào)為JF340216的洪湖碘泡蟲的同源性達(dá)到99%。使用DNAStar中的ClustalⅣ對(duì)克隆片段與已知洪湖碘泡蟲的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，同源性為99．3%，發(fā)現(xiàn)第697號(hào)堿基發(fā)生突變，第14號(hào)堿基處發(fā)生缺失，第704號(hào)位置增多一個(gè)堿基 (圖5)。

圖3 蟲體模擬圖Fig.3 The simulated diagram of the parasite

圖4 蟲體18S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 The 18S rDNA electrophoretogram of the parasite

圖5 蟲體18S rDNA保守序列比對(duì)結(jié)果Fig.5 The 18S rDNA conservative sequence alignment of the parasite

表1 待檢寄生蟲與洪湖碘泡蟲顯微測(cè)量數(shù)據(jù)對(duì)比Tab.1 The morphometric comparison of the parasite sample with Myxobolus honghuensis μm

采用MegAlign模塊構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，該碘泡蟲分離株與GenBank中登陸號(hào)為JF340216的洪湖碘泡蟲位于同一進(jìn)化分支 (圖6)。

圖6 基于該寄生蟲18S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on the 18S rDNA sequence of the parasite

3 討論

通過觀察病魚外觀，得出發(fā)病癥狀與碘泡蟲感染相同。經(jīng)過對(duì)蟲體的形態(tài)學(xué)分析，進(jìn)一步得出該蟲與洪湖碘泡蟲的顯微結(jié)構(gòu)極為相似，其尺寸數(shù)據(jù)與洪湖碘泡蟲也較為接近，可以初步診斷為洪湖碘泡蟲感染。采用該蟲的18S rDNA序列對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)分類研究與鑒定，基于18S rDNA序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，得出該蟲與洪湖碘泡蟲的遺傳距離最為接近，位于進(jìn)化樹的同一分支，進(jìn)一步確診為洪湖碘泡蟲感染。

碘泡蟲早期感染較為隱蔽，常規(guī)的檢測(cè)并不能充分確診感染病原體［11］。在寄生蟲領(lǐng)域內(nèi)，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病原進(jìn)行詳細(xì)分析在近些年頗為流行，得到的結(jié)果較為客觀、可靠，尤其對(duì)于外觀難以鑒別、品種繁多的黏孢子蟲來說，可以作為鑒定試驗(yàn)中的有力證據(jù)，為常規(guī)的鑒定提供了重要的輔助手段［19］。洪湖碘泡蟲多寄生于南方地區(qū)異育銀鯽上，常引起大規(guī)模碘泡蟲疾病。本實(shí)驗(yàn)室研究人員首次在東北地區(qū)確診一例早期感染洪湖碘泡蟲的異育銀鯽病例，這表明洪湖碘泡蟲可跨地域傳播，并具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。本研究中的鑒定結(jié)果可為東北地區(qū)碘泡蟲的防治提供參考資料。

目前，對(duì)于碘泡蟲的感染機(jī)制與生活史尚不清楚，對(duì)處于孢子期的蟲體仍無有效的殺滅藥物。但魚類在發(fā)生疾病后，免疫系統(tǒng)會(huì)發(fā)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，其中非特異性免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗疾病的第一道防線［20］。因此，增強(qiáng)魚類非特異性免疫力與感染的早期診斷對(duì)于該病的防治來說同樣重要。筆者建議東北地區(qū)飼養(yǎng)異育銀鯽時(shí)每年入春與入冬前期定期殺滅養(yǎng)殖池內(nèi)的螺類與寡毛類中間宿主，改良水質(zhì)，定期飼喂免疫增強(qiáng)劑，盡量將蟲體遏制在感染的早期，并保持養(yǎng)殖環(huán)境良好，避免交叉感染。

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