高水溫對雜交鱘主要免疫指標的影響

王靜波,曹歡,王小亮,王姝,孟蝶,張文,徐立蒲

(北京市水產(chǎn)技術推廣站,北京100021)

高水溫對雜交鱘主要免疫指標的影響

王靜波,曹歡,王小亮,王姝,孟蝶,張文,徐立蒲

(北京市水產(chǎn)技術推廣站,北京100021)

為揭示高水溫對雜交鱘 (施氏鱘Acipenser schrencki♀×西伯利亞鱘Acipenser baerii♂)免疫指標的影響,以滅活的嗜水氣單胞菌 (F-A.h)和傳染性胰臟壞死病毒 (F-IPNV-sp)作為免疫原分別腹腔注射健康雜交鱘,觀察18、23、28℃溫度下雜交鱘血清紅細胞及白細胞的數(shù)量,以及抗體水平及吞噬細胞免疫學指標的變化。結果表明:在不同水溫條件下,雜交鱘血清紅細胞和白細胞數(shù)量及紅白細胞數(shù)量比例均無顯著性差異 (P＞0.05),各試驗組紅細胞數(shù)量約為白細胞數(shù)量的100倍;隨著水溫的升高,免疫血清中抗A.h凝集抗體效價和IPNV-sp中和效價均呈升高趨勢,但各組均無顯著性差異 (P＞0.05);隨著水溫的升高,血液中的白細胞吞噬百分比 (PP)、吞噬指數(shù) (PI)和調理指數(shù) (OI)均呈先緩慢上升后下降的趨勢,18℃和23℃組的PP、PI、OI均顯著高于28℃組 (P＜0.05),而18℃與23℃組間無顯著性差異(P＞0.05)。研究表明,高水溫對雜交鱘非特異性免疫有顯著的抑制作用。

雜交鱘;嗜水氣單胞菌;傳染性胰臟壞死病毒;免疫功能;高水溫

鱘由于生長快和經(jīng)濟價值高,已成為中國重要的養(yǎng)殖品種。但近年來由于部分養(yǎng)殖區(qū)域水流量減少,夏季水溫較高且持續(xù)時間長,養(yǎng)殖鱘各種疾病頻發(fā),嚴重影響鱘魚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1-2]。魚類作為一種變溫動物,各項生理機能直接受到水溫的影響,水溫過高或過低都會造成魚類的應激反應,導致免疫力降低,誘發(fā)各種疾病[3-5]。目前,有關魚類免疫力和溫度關系的研究主要集中在適溫范圍內(nèi)[6-9],但高水溫對魚類免疫力影響的研究報道較少。鱘屬于亞冷水性魚類,據(jù)有關報道,鱘最高生存溫度為30℃,生長最高適溫為25～26℃[10],當水溫達28℃以上時鱘攝食與生長都會減緩或停止[11]。研究還發(fā)現(xiàn),北京地區(qū)鱘養(yǎng)殖水溫大多在18～22℃,但部分地區(qū)養(yǎng)殖水溫在夏季高溫時達27～28℃且持續(xù)一段時間,此時鱘的發(fā)病率和死亡率會明顯增加,出現(xiàn)這種現(xiàn)象究竟是由于其生理功能還是免疫功能受影響所致,目前尚不清楚。本研究中,以雜交鱘 (施氏鱘Acipenser schrencki♀×西伯利亞鱘Acipenser baerii♂)為研究對象,測定在不同養(yǎng)殖水溫條件下,當其受到滅活的嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila和傳染性胰臟壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV-sp)刺激后,主要免疫指標的變化情況,揭示高水溫對鱘非特異性和特異性免疫指標的影響,旨在為提高鱘抗病能力、開展病害防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用雜交鱘體長為 (16.9±2.0)cm,體質量為 (29.4±3.5)g,購自北京房山某漁場。

嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus均購自中國微生物菌種保藏中心 (北京)。傳染性胰臟壞死病毒sp株(IPNV-sp)由中國檢驗檢疫科學研究院江育林研究員饋贈。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制備 將上述兩種菌株在28℃恒溫條件下,利用BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。以4000 r/min離心20 min,收集菌體,以滅菌生理鹽水清洗3次,加入終濃度為1%(體積分數(shù),下同)的甲醛溶液,繼而在25℃條件下滅活24 h。然后以4000 r/min離心20 min,重懸于滅菌生理鹽水中,重復兩次,并將終濃度調至1×108CFU/mL,4℃下保存?zhèn)溆?。滅活的嗜水氣單胞菌簡稱為F-A.h,滅活的金黃色葡萄球菌簡稱為F-S.a.。

將病毒株IPNV-sp接種到CHSE-214細胞中于20℃下培養(yǎng),待細胞出現(xiàn)CPE完全后,凍融一次以釋放病毒。將病毒懸液經(jīng)8000 r/min離心30 min和24 000 r/min離心220 min后,重懸于滅菌生理鹽水中,加入終濃度為0.5%的甲醛溶液。在37℃下滅活病毒24 h,然后用硫代硫酸鈉中和,以8000 r/min離心30 min。收集上清,于4℃下保存?zhèn)溆谩缁畹腎PNV-sp簡稱為F-IPNV-sp。

1.2.2 試驗魚的飼養(yǎng) 將試驗魚暫養(yǎng)在0.5 m3自動循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中,溶解氧為6～8 mg/L,pH為7.2～8.0,水溫分別控制在 (18±1)、(23±1)、(28±1)℃,期間每天投喂2次配合飼料。1周后正式開始試驗。

1.2.3 免疫與采血 試驗共設 (18±1)、 (23± 1)、(28±1)℃ 3個溫度組,每個溫度組均設對照組和免疫組,將對照組每尾魚腹腔注射同體積的滅菌生理鹽水,將免疫組每尾魚腹腔分別注射0.3 mL F-A.h和F-IPNV-sp,每組設2個平行,每個平行放25尾試驗魚,共飼養(yǎng)4周。

分別于接種前和接種后第7、14、21、28天從試驗魚尾動脈取血。血樣分為兩份:一份加肝素,用于紅細胞和白細胞計數(shù);另一份按常規(guī)方法制備血清。

1.2.4 免疫指標的檢測

(1)血細胞。紅細胞和白細胞均用血球計數(shù)板計數(shù),每個樣品重復3次,結果以平均值計。

(2)血清抗體效價。血清中抗細菌抗體的效價用凝集試驗,采用96孔血凝板依照常規(guī)方法進行測定[12]。血清中抗病毒抗體的滴度用中和試驗,采用細胞培養(yǎng)板,使用CHSE-214細胞,在20℃下依照常規(guī)方法進行檢測[13]。

(3)白細胞的吞噬和調理試驗。試驗結束后,取3個溫度下對照組的雜交鱘抗凝血,經(jīng)2000 r/min離心10 min后,吸取血漿與紅細胞界面的白細胞層,用PBS(0.01 mol/L)重懸。每份樣品取出2份細胞懸液 (每份200μL):一份加入100μL無血清1640(對照組);一份加入100μL抗FA.h凝集抗體效價最高的血清 (免疫組),再各加入40μL F-S.a.,然后置于25℃恒溫下孵育,期間每10 min搖勻一次。1 h后以2000 r/min離心10 min,棄上清,細胞用100μL PBS(0.01 mol/L)重懸。按常規(guī)方法涂3張載玻片,用甲醇固定、Gimsa染色、油鏡觀察,按照常規(guī)方法測定白細胞的吞噬活性和調理指數(shù)[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準差表示。利用SPSS 16.0軟件對試驗結果進行方差分析和多重比較,顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 血細胞數(shù)量變化

雜交鱘血細胞計數(shù)結果見表1。從表1可以看出,隨著水溫的升高,各組紅細胞和白細胞數(shù)量無顯著性變化 (P＞0.05)。另外,在3個溫度下,雜交鱘紅細胞數(shù)量約為白細胞數(shù)量的100倍 (78～105倍),未受到水溫顯著影響 (P＞0.05)。

表1 不同溫度下雜交鱘的血細胞數(shù)量Tab.1 Number of blood cells in the hybrid sturgeon at different tem peratures

2.2 高溫對雜交鱘抗體水平的影響

2.2.1 血清中抗A.h凝集效價 雜交鱘血清中抗A.h的抗體凝集效價如圖1所示。從圖1可見:隨著水溫的升高,血清中抗A.h的抗體凝集效價呈上升趨勢,但各溫度組間均無顯著性差異 (P＞0.05);18℃組和23℃組最高效價分別為1∶16和1∶24,而28℃組隨免疫時間的延長,凝集效價呈先上升后下降的趨勢,最高效價出現(xiàn)在免疫后第14天～第21天,抗體效價為1∶48。

圖1 不同溫度下免疫雜交鱘血清中抗A.h的抗體凝集效價Fig.1 Agglutinating titers of anti A.h serum in immunized hybrid sturgeon at different temperatures

2.2.2 血清中抗IPNV-sp中和效價 雜交鱘血清中抗IPNV-sp中和效價如圖2所示。從圖2可見:隨著時間的延長,各溫度組血清中抗IPNV-sp中和效價均呈上升趨勢,而且水溫越高,最后的抗體中和滴度也越高;各組在一周后抗體效價均可達到1∶250以上,其中,18℃組在免疫后第28天時效價最高達1∶1280,而23℃和28℃組在免疫后第14天時就達到1∶1920的最高效價;但是各溫度組間抗IPNV-sp中和效價無顯著性差異 (P＞0.05)。

圖2 不同溫度下免疫雜交鱘血清中抗IPNV-sp的抗體中和效價Fig.2 Neutralizing titers of anti IPNV-sp serum in immunized hybrid sturgeon at different tem peratures

2.3 高溫對雜交鱘外周血白細胞吞噬能力的影響

3種溫度下雜交鱘外周血白細胞的PP、PI、OI變化如圖3所示。從圖3可見:隨著水溫的升高, PP、PI、OI整體上呈先緩慢上升后下降的趨勢; 18℃和23℃組的PP、PI、OI均顯著高于28℃組(P＜0.05),而18℃與23℃組間無顯著性差異(P＞0.05)。同時,各溫度組白細胞的吞噬試驗結果發(fā)現(xiàn),經(jīng)具有高凝集效價免疫血清調理后,雜交鱘外周血白細胞具有更強的吞噬能力,每個白細胞能夠吞噬更多F-S.a.(圖4)。從圖4還可以看到,大量的F-S.a.已經(jīng)被吞噬到細胞質中,在細胞質外尚有少量F-S.a.也在調理素的趨附作用下向白細胞靠攏。

從以上結果可以看出,盡管高水溫對雜交鱘血細胞數(shù)量沒有顯著影響,但高水溫可降低雜交鱘白細胞的吞噬能力,導致其非特異性免疫能力下降,進而降低其抗病力,導致各種疾病的發(fā)生。

圖3 不同溫度下外周血白細胞的吞噬活性Fig.3 Phagocytic activities of white blood cells from peripheral blood at different tem peratures

3 討論

魚類屬于變溫低等脊椎動物,具備特異性和非特異性免疫,能有效地保護魚體免受病原侵襲[4]。病原微生物進入機體后,首先接觸的是機體吞噬細胞系統(tǒng),它不僅構成了魚體內(nèi)非特異性免疫應答的第一道防線,還可以消化、處理和傳遞抗原信息,也是特異性免疫應答的起點[15-17]。影響魚體免疫功能的因素很多,如抗原、個體發(fā)育、環(huán)境因素等,其中影響最大的是環(huán)境因素中的溫度[6-9]。能反映機體免疫能力的因素也有很多,如各種血細胞的數(shù)量和比例,抗體的產(chǎn)生時間和滴度,吞噬細胞數(shù)量和吞噬能力等。本研究結果顯示:在不同水溫下,紅白細胞的數(shù)量和它們之間的比例基本保持不變;而血清中抗A.h凝集效價和抗IPNV-sp中和滴度卻隨溫度的升高而上升,即便已經(jīng)超過了雜交鱘的最適養(yǎng)殖溫度,仍然一直保持上升的趨勢,這就提示雜交鱘無論是對可溶性抗原 (病毒)還是對顆粒性抗原 (細菌)的特異性反應,都一直保持與溫度呈正相關;而白細胞的吞噬能力,包括經(jīng)過免疫血清調理后的吞噬能力,則隨水溫的上升呈先緩慢上升后下降的趨勢,且18℃和23℃組顯著高于28℃組。這與筆者近幾年對北京地區(qū)養(yǎng)殖鱘流行病學調查結果相符,即當水溫達到27～28℃及以上且持續(xù)一段時間以后,鱘患各種細菌性疾病的發(fā)病率和死亡率明顯增加,提示非特異性免疫降低導致其抗病力降低,即非特異性反應可能在雜交鱘抗感染過程中起到主要作用,這與已報道的虹鱒Oncorhynchusmykiss[8]、大鯢 Andrias davidianus[12]和南方鲇Silurusmeridionalis[18]的研究結論相似。

圖4 外周血白細胞吞噬金黃色葡萄球菌Fig.4 W hite blood cells containing phagocytized Staphylococcus aureus in peripheral blood

抗體是由淋巴細胞產(chǎn)生的一類能與相應抗原特異性結合的具有免疫功能的球蛋白,抗體效價反映了魚類特異性體液的免疫水平[19-20]。魚類產(chǎn)生抗體的能力隨溫度的升高而增強的現(xiàn)象已有較多報道[13,21-26], 但有研究結果表明[19-20,27-28], 受免魚的抗體效價與免疫保護率的高低往往并不一致,即可能存在 “無效免疫”。本研究中發(fā)現(xiàn),盡管隨著水溫的升高,雜交鱘血清抗A.h凝集抗體效價和抗IPNV-sp中和效價均呈升高趨勢,但試驗魚在水溫高于28℃時仍然易感多病,推測特異性抗體對雜交鱘的抗病力沒有起到增強作用,產(chǎn)生的抗體可能僅對抗原有反應,而對病原沒有殺滅作用,即所謂 “無效免疫”。

另外,本研究中還發(fā)現(xiàn),在不同水溫條件下F-A.h免疫雜交鱘產(chǎn)生的抗體凝集效價較低 (最高值為1∶48),這可能是由于A.h是水體常見菌,對雜交鱘的抗原性較差,故不能刺激魚體產(chǎn)生滴度足夠高的體液免疫應答。而F-IPNV-sp免疫雜交鱘產(chǎn)生的抗體中和效價 (最高值為1∶1920)明顯高于F-A.h免疫雜交鱘產(chǎn)生的抗體凝集效價,這可能是因為魚體對IPNV具有較強的免疫反應,雖然有研究表明,IPNV免疫草魚產(chǎn)生抗體中和效價最高可達1∶20 000[13],這種差異可能主要與魚的種類有關。

綜上所述,高水溫對雜交鱘非特異性免疫有顯著的抑制作用,這表明在高水溫條件下雜交鱘非特異性免疫降低是導致其抗病力降低的主要原因。因此,在高溫季節(jié)投喂免疫增強劑,以提高鱘魚非特異性免疫力,或者通過物理方法降低水溫,對鱘魚病害的防控具有積極的作用。

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Effects of high water temperature on immune response in hybrid sturgeon

WANG Jing-bo,CAO Huan,WANG Xiao-liang,WANG Shu,MENG Die,ZHANGWen,XU Li-pu
(Beijing Fisheries Technical Extension Station,Beijing100021,China)

The numbers of red blood cell and white blood cell,antibody level and immune functions of phagocytes were observed in hybrid sturgeon(Amur sturgeon Acipenserschrencki♀×Siberian sturgeon Acipenserbaerii♂)injected intraperitioneally with formalin killed Aeromonas hydrophila(F-A.h)and IPNV-sp(F-IPNV-sp)and then cultured in 18℃,23℃ and 28℃,respectively,to insight into the effect of high water temperature on the immune response in the hybrid sturgeon.The results showed that therewas no significant difference in the numbers of red blood cells and white blood cells in the hybrid sturgeon at different temperatures(P＞0.05),even though the number of red blood cellswas asmany as100 times as the white blood cells.The titers of antibodies and IPNV-sp were found to be increased slightly after the hybrid sturgeon was immunized with formalin killed Aeromonas hydrophila along with rising temperature(P＞0.05).However,the phagocytic percentage(PP),phagocytic index (PI)and opsonic index(OI)of white blood cells in peripheral blood were increased slightly first and then decreased obviously at the warmer temperature.There was significant difference in PP,PIand OI in hybrid sturgeons cultured at18℃ and 23℃ compared to those at28℃ (P＜0.05),without significant difference at18℃ and 23℃ (P＞0.05).The findings indicated thatnon-specific immunity of the hybrid sturgeon wasmore inhibited athigh temperature,which is attributed to low disease resistance of the hybrid sturgeon at high temperature.

hybrid sturgeon;Aeromonas hydrophila;infectious pancreatic necrosis virus;immune function;high water temperature

S965.215

A

2014-12-22

北京市鱘魚、鮭鱒魚創(chuàng)新團隊 (SCGWZJ 20141104-3);北京市農(nóng)業(yè)科技項目 (20140120)

王靜波 (1977—),女,碩士,高級工程師。E-mail:wjbo_2004@163.com

徐立蒲 (1972—),男,博士,研究員。E-mail:bjybk@163.com

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2015.05.006

2095-1388(2015)05-0484-05