低溫誘導(dǎo)紅鰭東方鲀雄性化及性腺分化的組織學(xué)觀察

周賀，李佳奇，馬海艷，李雅娟，姜志強(qiáng)，李霞，徐雯，江振華

(1．大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;2．大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

紅鰭東方鲀Takifugu rubripes是鲀形目中最名貴的海水魚(yú)類［1］，在中國(guó)主要分布于黃海、渤海和東海，國(guó)外多見(jiàn)于朝鮮半島和日本［2］等海域。研究表明，紅鰭東方鲀的肌肉、嘴、精巢無(wú)毒，而且精巢在日本作為高級(jí)食材，價(jià)格十分昂貴，雄性河鲀價(jià)格比雌性河鲀高1．5～2．0倍［3］。正常情況下，河鲀雌、雄比為1∶1，也就是說(shuō)養(yǎng)殖生產(chǎn)中50%的生殖腺 (卵巢)不能食用。而且，紅鰭東方鲀雌魚(yú)的生殖腺指數(shù)較高，繁殖期卵巢最高可占魚(yú)體質(zhì)量的20%～30%，這樣可食用的部分極低。目前，在生產(chǎn)上推廣全雄性紅鰭東方鲀養(yǎng)殖，可大幅度提高精巢產(chǎn)量，提高養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益達(dá)50%以上，其成果具有重要的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)于利用溫度處理誘導(dǎo)魚(yú)類雄性化曾有一些報(bào)道。Desprez等［4］研究表明，藍(lán)色羅非魚(yú)Oreochromis aureus在34℃時(shí)孵化，后代雄性比例高達(dá)97．8%。尼羅羅非魚(yú)O．nilotica在高溫34～37℃時(shí)孵化，也產(chǎn)生較高的雄性率，而莫桑比克羅非魚(yú)O．mossambica則在低溫19℃或20℃時(shí)孵化，能增加雄魚(yú)的比例［5］。海鱸Dicentrarchus labrax在正常溫度 (25℃)下孵化時(shí)，其性比偏向雄性，而在性腺發(fā)育易變期內(nèi)經(jīng)15℃低溫處理會(huì)產(chǎn)生全雄群體［6］。Goto等［7］采用高溫誘導(dǎo)處于性別分化期的條斑星鰈Verosper moseri，也獲得了100%的雄性率。關(guān)于紅鰭東方鲀低溫誘導(dǎo)雄性化方面的研究，僅見(jiàn)日本近畿大學(xué)報(bào)道了通過(guò)低溫培育成功獲得了80%的雄性后代，但存在生長(zhǎng)速度慢及未能達(dá)到100%全雄性后代等問(wèn)題［3］。

國(guó)內(nèi)外對(duì)紅鰭東方鲀的遺傳育種方面的研究報(bào)道較少。日本在遺傳連鎖圖譜、抗蟲(chóng)、種間雜交、雄性化等方面進(jìn)行了系統(tǒng)報(bào)道［3］，Matsuura等［8］和Suzuki等［9］對(duì)紅鰭東方鲀的早期性分化和性腺發(fā)育進(jìn)行了研究;中國(guó)開(kāi)展此方面的研究較晚，只是近幾年在核型［10］、三倍體育種［11］、遺傳多樣性［12-13］、生化遺傳變異［14］等方面有零星報(bào)道。但關(guān)于紅鰭東方鲀低溫誘導(dǎo)雄性化及不同溫度處理后性腺分化及組織學(xué)變化的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，采用低溫誘導(dǎo)雄性化技術(shù)，對(duì)紅鰭東方鲀后代的早期性腺分化進(jìn)行分析，旨在探索出簡(jiǎn)單、安全、易操作的魚(yú)類雄性化新途徑，為低溫誘導(dǎo)全雄紅鰭東方鲀的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用紅鰭東方鲀稚魚(yú)魚(yú)苗取自遼寧省富谷水產(chǎn)有限公司。選擇體表無(wú)傷、活動(dòng)情況良好、大小相近的個(gè)體用于試驗(yàn)。

1.2 方法

1．2．1 低溫處理 分別在孵化后15、45、75 d運(yùn)至大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，將魚(yú)苗放入控溫水箱 (75 cm×45 cm×55 cm)中，分別控制水溫在15、17℃，以正常水溫21℃為對(duì)照，每組設(shè)2個(gè)平行組，每個(gè)平行組放入200尾魚(yú)苗，水箱中保持流水狀態(tài)且水溫恒定，并利用充氣泵持續(xù)供氧。在各溫度條件下培育65 d，然后將水溫控制在21℃左右開(kāi)始飼養(yǎng)。

1．2．2 紅鰭東方鲀性別比例的檢測(cè) 經(jīng)低溫處理結(jié)束后，從孵化后45 d和75 d試驗(yàn)組以及對(duì)照組隨機(jī)抽取25～35尾魚(yú)苗，用乙醚將魚(yú)麻醉，解剖取出性腺，用Bouin氏液固定，進(jìn)行石蠟切片、蘇木精-曙紅 (H．E)染色，在顯微鏡下觀察各溫度條件下性腺細(xì)胞學(xué)特征并確定其性別，同時(shí)統(tǒng)計(jì)樣本的雌、雄比例。

1．2．3 性腺組織學(xué)切片與觀察 從孵化后15 d的低溫處理試驗(yàn)組中取樣，每3 d取樣一次，每次取樣5尾。一個(gè)月后，每5 d取樣一次，每次取樣5尾。仔魚(yú)平均體長(zhǎng)在1．0 cm以下，取整條;平均體長(zhǎng)在1．0～2．0 cm時(shí)，取軀干部分;平均體長(zhǎng)在2．0～4．0 cm時(shí)，除去腹壁皮膚，暴露性腺，與部分軀干一同固定;平均體長(zhǎng)在4 cm以上時(shí)，只取性腺進(jìn)行固定。各樣品均在Bouin氏液中先固定24 h后 (樣品體積不超過(guò) Bouin氏固定液體積的1/20)，再轉(zhuǎn)入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液中保存。將固定的樣品分別用梯度酒精脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度為6～7 μm，采用H．E染色，用中性樹(shù)膠封片，在Olympus AH2下觀察并顯微攝影。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19．0軟件對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析 (One-Way ANONA)，用Duncun法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0．05。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度與紅鰭東方鲀性別比例的相關(guān)分析

從表1可見(jiàn):在15、17、21℃條件下，紅鰭東方鲀的雄性率為51．57% ～74．70%;在孵化后45 d，15℃試驗(yàn)組的雄性率最高，但僅于21℃組有顯著性差異 (P＜0．05);在孵化后75 d，15℃試驗(yàn)組的雄性率仍為最高，且顯著高于其他兩組(P＜0．05)，17℃組也顯著高于 21℃組 (P＜0．05)。

表1 紅鰭東方鲀?cè)?5、17、21℃條件下的雌、雄性比例Tab.1 Proportions of female and male in redfin puffer Takifugu rubripes reared at 15，17 and 21℃

從表2可見(jiàn)，溫度、雄性率和雌性率三者之間的相關(guān)性均極顯著 (P＜0．01)，其中，溫度與雄性率的相關(guān)系數(shù)為-0．827，呈極顯著負(fù)相關(guān) (P＜0．01)，而溫度與雌性率的相關(guān)系數(shù)為0．823，呈極顯著正相關(guān) (P＜0．01)。結(jié)果顯示，溫度對(duì)紅鰭東方鲀的雄性比例有抑制作用。

表2 溫度與紅鰭東方鲀性別比例的相關(guān)系數(shù)Tab.2 Correlations between temperature and sexual ratio in redfin puffer Takifugu rubripes

2.2 紅鰭東方鲀的性腺分化與發(fā)育

2．2．1 原始性腺的發(fā)育 孵化后23 d，21℃條件下，稚魚(yú) (體長(zhǎng)5．4～7．5 mm)中腎管下方、直腸上方、腸管邊緣處發(fā)現(xiàn)有橢圓狀的原始生殖細(xì)胞，沒(méi)有被膜包裹，體積較大，直徑為6～7 μm，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞質(zhì)呈弱嗜堿性，染色很淺，核嗜堿性，呈深紫色，大且透亮，核膜清晰，核仁偏位(圖1-A);17℃條件下，稚魚(yú) (體長(zhǎng)4．1～6．2 mm)細(xì)胞分裂緩慢，中腎管下方出現(xiàn)少數(shù)生殖細(xì)胞 (圖1-B);15℃條件下，稚魚(yú) (體長(zhǎng)3．3～3．9 mm)中腎管下方可以清晰地看到直腸，但在腸管邊緣未發(fā)現(xiàn)原始生殖細(xì)胞 (圖1-C)。

孵化后33 d，21℃條件下，幼魚(yú) (體長(zhǎng)7．1～8．9 mm)中腎管下方沿體腔膜基部向腹部伸出一突起——生殖嵴，之中含有少數(shù)原始生殖細(xì)胞，兩者共同構(gòu)成性腺原基 (圖1-D);17℃條件下，幼魚(yú) (體長(zhǎng) 5．3～7．0 mm)性腺中出現(xiàn)性腺原基，但內(nèi)含原始生殖細(xì)胞數(shù)量少于21℃條件下 (圖1-E);15℃條件下，幼魚(yú) (體長(zhǎng)4．2～5．0 mm)性腺中觀察到原始生殖細(xì)胞 (圖1-F)。

孵化后43 d，21℃條件下，幼魚(yú) (體長(zhǎng)9．1～10．5 mm)性腺中性腺原基明顯增大，內(nèi)部出現(xiàn)大量上皮生殖細(xì)胞，原始生殖細(xì)胞與上皮生殖細(xì)胞共同構(gòu)成原始性腺，此時(shí)仍不能明顯分辨精巢、卵巢(圖1-G);17℃條件下，幼魚(yú) (體長(zhǎng)6．1～7．8 mm)性腺中觀察到明顯原始性腺 (圖1-H);15℃條件下，幼魚(yú) (體長(zhǎng)4．2～5．0 mm)中腎管下方出現(xiàn)性腺原基 (圖1-I)。

圖1 不同溫度下紅鰭東方鲀的原始性腺發(fā)育Fig.1 Primordial gonadal development of redfin puffer Takifugu rubripes at different temperature

2．2．2 卵巢的分化 21℃條件下，孵化后43 d，幼魚(yú) (體長(zhǎng)9．1～10．5 mm)部分原始性腺發(fā)育緩慢，仍呈梨狀，另一部分原始性腺呈橄欖狀，其原始生殖細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，數(shù)量明顯增加，與腸壁形成閉合結(jié)構(gòu)，開(kāi)始出現(xiàn)卵巢腔 (圖2-A)。孵化后48 d，幼魚(yú) (體長(zhǎng)9．3～10．6 mm)原始生殖細(xì)胞繼續(xù)增多，性腺中間處有細(xì)小縫隙出現(xiàn)，即原始卵巢腔 (圖2-B)。58 d，幼魚(yú) (體長(zhǎng)14．3～15．9 mm)性腺的卵巢腔十分明顯，大量原始生殖細(xì)胞正在進(jìn)行有絲分裂，細(xì)胞數(shù)量增多，在生殖上皮附近出現(xiàn)Ⅰ時(shí)相卵原細(xì)胞。Ⅰ時(shí)相卵原細(xì)胞呈圓形，嗜堿性，為淺紫色。期間卵原細(xì)胞大量分裂，此過(guò)程中性腺組織無(wú)明顯變化，只是體積不斷增大(圖2-C)。88 d，幼魚(yú) (體長(zhǎng)27．4 ～29．6 mm)卵原細(xì)胞開(kāi)始向卵巢腔內(nèi)部進(jìn)行增殖，出現(xiàn)原始的卵巢小葉 (圖 2-D)。103 d，幼魚(yú) (體長(zhǎng) 70．6～88．1 mm)卵巢發(fā)育完全，卵巢小葉呈輻射狀排列，卵巢中可以同時(shí)看到卵原細(xì)胞和卵母細(xì)胞，標(biāo)志著卵巢細(xì)胞學(xué)上分化的開(kāi)始 (圖2-E)。

17℃條件下，幼魚(yú)發(fā)育略慢于21℃條件下，孵化后63 d，幼魚(yú) (體長(zhǎng)18．2～21．3 mm)出現(xiàn)明顯的卵巢腔和卵原細(xì)胞 (圖2-F)。103 d，幼魚(yú)(體長(zhǎng)40．2～46．4 mm)出現(xiàn)清晰的卵巢小葉，細(xì)胞分裂快速，性腺不斷增大 (2-G)。123 d，幼魚(yú)(體長(zhǎng)50．1～56．4 mm)經(jīng)過(guò)卵原細(xì)胞大量分裂，性腺不斷發(fā)育，能看到卵巢小葉上有少量卵母細(xì)胞出現(xiàn) (圖2-H)。

15℃條件下，幼魚(yú)發(fā)育明顯緩慢，孵化后73 d，幼魚(yú) (體長(zhǎng)18．4～19．9 mm)才出現(xiàn)明顯的卵巢腔和卵原細(xì)胞 (圖2-I)。143 d，幼魚(yú) (體長(zhǎng)55．9～63．4 mm)有明顯的卵巢小葉，卵巢小葉上有大量的卵原細(xì)胞和少量卵母細(xì)胞 (圖2-J)。

2．2．3 精巢的分化 孵化43 d之后，精巢發(fā)育明顯晚于卵巢。原始性腺細(xì)胞的有絲分裂幾乎處于靜止?fàn)顟B(tài)，沒(méi)有出現(xiàn)任何縫隙 (圖3-A)。

21℃條件下，孵化后 68 d，幼魚(yú) (體長(zhǎng)21．3～24．5 mm)性腺中才可觀察到在生殖腺柄部出現(xiàn)裂縫狀的輸精管原基，此結(jié)構(gòu)標(biāo)志著該性腺向精巢方向分化 (圖 3-B)。93 d，幼魚(yú) (體長(zhǎng)28．4～30．6 mm)精巢內(nèi)精原細(xì)胞分裂迅速，數(shù)量增加，精小葉明顯，結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，至此精巢完成了第Ⅰ期的分化 (圖3-C)。113 d，幼魚(yú) (體長(zhǎng)75．6～93．1 mm)精小葉之間緊密排列，彼此之間充滿結(jié)締組織，精小葉內(nèi)還可以看到大量的精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞 (圖3-D)。

17℃條件下，孵化后 83 d，幼魚(yú) (體長(zhǎng)25．1～27．4)性腺中才觀察到輸精管原基 (圖3-E)。98 d，能觀察到精小葉和少量精原細(xì)胞(圖3-F)。113 d，幼魚(yú) (體長(zhǎng) 54．2 ～66．8 mm)的精小葉發(fā)育明顯，精原細(xì)胞大量分裂，性腺明顯增大 (圖3-G)。

15℃條件下，幼魚(yú)發(fā)育較21℃條件下緩慢，幾乎停滯。孵化后93 d，幼魚(yú) (體長(zhǎng)19．3～21．4 mm)性腺中僅能觀察到不十分明顯的精小葉 (圖3-H)，由于試驗(yàn)設(shè)計(jì)，取樣時(shí)期較短，并沒(méi)有樣本觀察到初級(jí)精母細(xì)胞的出現(xiàn)。

3 討論

3.1 溫度對(duì)紅鰭東方鲀性別比例的影響

研究表明，魚(yú)類的性別決定和分化機(jī)制多種多樣，總體來(lái)說(shuō)可以分為基因型性別決定 (genetic sex determination，GSD)和環(huán)境型性別決定 (environmental sex determination，ESD)兩種類型。ESD指子代的性別主要由環(huán)境因子決定，精卵所處環(huán)境的溫度、濕度、pH和一些不確定的因素均有可能影響到子代的性別。已有報(bào)道表明，多種魚(yú)類的性腺分化方向受到溫度影響，魚(yú)類的溫度依賴型性別決定 (temperaturedependentsexdetermination，TSD)最早在爬行動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)。Witschi在高溫32℃下培育美洲林蛙的蝌蚪，發(fā)現(xiàn)有雄性化的趨勢(shì)［15］。而且對(duì)于性別比例的影響在多種硬骨魚(yú)類中都有報(bào)道［16-19］，在多數(shù)魚(yú)類中，如銀漢魚(yú)Atherinid、麗魚(yú)科 Cichlids、金魚(yú) Carassius auratus和鯰形目Siluriform，低溫能引起雌性分化，高溫能導(dǎo)致雄性比例升高。泥鰍Misgurnus anguillicaudatus和大鱗副泥鰍Paramisgurnus dabryanus胚胎在20～30℃時(shí)發(fā)育，隨著溫度的升高雄性率明顯提高，最高可達(dá)80%以上［20］。但是在少數(shù)魚(yú)類中，如鱸，高溫能誘導(dǎo)雌性率，而低溫能使雄性率升高［16］。服部亙宏等［21］報(bào)道，孵化后2～3周開(kāi)始低溫培育紅鰭東方鲀苗種，可以顯著提高稚魚(yú)的雄性比例。本研究中，雄性化比例隨溫度的降低而升高。在21℃條件下，雄性率最高為51．57%±0．06%，在17℃條件下，雄性率最高為59．60%±3．49%，在15℃條件下，雄性率最高可達(dá)到74．70%±2．79%。將孵化后不同時(shí)期的魚(yú)苗在相同溫度下進(jìn)行培育，對(duì)魚(yú)苗的雄性率沒(méi)有呈現(xiàn)出相同的上升或下降趨勢(shì)。15℃條件下，孵化后45 d對(duì)魚(yú)苗進(jìn)行培育的雄性率為 (64．38%±4．62%)，低于孵化后75 d開(kāi)始培育魚(yú)苗的雄性率(74．70%±2．79%)。而17℃條件下，孵化后45 d培育魚(yú)苗的雄性率 (59．60%±3．49%)和 75 d培育魚(yú)苗的雄性率 (58．34%±0．40%)幾乎相同。在本試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，在孵化后15 d對(duì)魚(yú)苗進(jìn)行低溫處理，對(duì)魚(yú)苗的攝食量和活動(dòng)能力有很大影響，且容易發(fā)生病變，使成活率極低。同時(shí)，通過(guò)石蠟組織切片對(duì)魚(yú)苗樣本進(jìn)行生理性別的鑒定發(fā)現(xiàn)，低溫可以提高紅鰭東方鲀雄性化率，與服部亙宏等［21］的研究結(jié)果一致。但對(duì)于是否發(fā)生性逆轉(zhuǎn)需要今后進(jìn)行遺傳性別鑒別。

圖2 不同溫度下紅鰭東方鲀的卵巢分化Fig.2 Ovarian differentiation of radfin puffer Takifugu rubripes at different temperature

圖3 不同溫度下紅鰭東方鲀的精巢分化Fig.3 Testis differentiation of radfin puffer Takifugu rubripes at different temperature

3.2 紅鰭東方鲀性腺的分化方式

魚(yú)類的性別分化一般分為雌雄異體、雌雄同體和兼性3種類型。Yamamoto［22］根據(jù)文獻(xiàn)將雌雄異體型分為兩種，一是分化型雌雄異體型，即在早期的性腺發(fā)育過(guò)程中未分化性腺，直接發(fā)育為精巢或卵巢，如大鱗副泥鰍［23］、鯉 Cyprinus carpio［24］等;二是未分化型雌雄異體型，即未分化性腺先分化為卵巢狀結(jié)構(gòu)，然后在半數(shù)左右個(gè)體中卵巢狀結(jié)構(gòu)退化而精巢結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，如斑馬魚(yú) Danio rerio［25］等。本研究中，紅鰭東方鲀?cè)缙谛韵侔l(fā)育過(guò)程中，半數(shù)左右個(gè)體未分化性腺直接發(fā)育為卵巢，另外半數(shù)個(gè)體則直接發(fā)育為精巢，因此，紅鰭東方鲀的性腺分化屬于分化型雌雄異體型，與Matsuura等［8］的研究結(jié)果一致。

3.3 紅鰭東方鲀性腺發(fā)育的低溫處理時(shí)間

對(duì)大多數(shù)魚(yú)類的研究發(fā)現(xiàn)，影響性腺早期分化方向的有效溫度處理時(shí)間應(yīng)該在組織學(xué)性腺分化之前，或者與組織學(xué)性腺分化同時(shí)［26-27］。研究通過(guò)控制溫度誘導(dǎo)紅鰭東方鲀?nèi)刍仨毩私饧t鰭東方鲀的性腺分化的過(guò)程和規(guī)律，以掌握溫度處理的最適時(shí)機(jī)。盡管可能因?yàn)樯羁臻g、種群密度和食物的可得性等條件差異而造成不同試驗(yàn)結(jié)果有所差異，但根據(jù)對(duì)紅鰭東方鲀性腺早期發(fā)育進(jìn)行的預(yù)備試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紅鰭東方鲀適宜生長(zhǎng)溫度為14～27℃。高溫環(huán)境下容易發(fā)生病變，如餌料易變質(zhì)，污染水質(zhì);而低溫環(huán)境下魚(yú)體活動(dòng)能力下降，攝食量下降，轉(zhuǎn)換餌料時(shí)會(huì)出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，在低于13℃時(shí)，魚(yú)苗幾乎停止生長(zhǎng)。因此，本試驗(yàn)中設(shè)計(jì)15、17、21℃ 3個(gè)溫度，為了保證試驗(yàn)準(zhǔn)確性，培育過(guò)程中水溫變化在1℃以內(nèi)。本試驗(yàn)過(guò)程中，從孵化后45 d、75 d分別進(jìn)行溫度控制，從溫度處理開(kāi)始后各自培育65 d，之后在21℃條件下繼續(xù)養(yǎng)殖。從魚(yú)苗的生長(zhǎng)情況和組織學(xué)觀察來(lái)看，溫度的設(shè)置比較合理。

3.4 溫度對(duì)紅鰭東方鲀性腺早期分化的影響

溫度通過(guò)影響性腺發(fā)育的方向而間接決定魚(yú)類的性別，Desprez等［4］認(rèn)為，在低溫環(huán)境下，體積小的魚(yú)比體積大的魚(yú)耐受性要低。雌魚(yú)的生長(zhǎng)速度要比雄魚(yú)快，更容易受低溫環(huán)境的影響。田永勝等［28］研究表明，高溫可以促進(jìn)半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis生殖細(xì)胞的增殖和卵母細(xì)胞的發(fā)育，致使雌性比例升高。本研究中發(fā)現(xiàn)，孵化后23 d，在15℃條件下的試驗(yàn)組樣品中還未觀察到原始生殖細(xì)胞，且之后性腺發(fā)育也明顯慢于其他兩組。17℃試驗(yàn)組樣本性腺中細(xì)胞分裂速度明顯緩慢，發(fā)育到同一階段的性腺之間相比較，可以看出，低溫組性腺較小，細(xì)胞數(shù)量少于高溫試驗(yàn)組。精巢的發(fā)育過(guò)程中也有相似的情況。試驗(yàn)中孵化后的魚(yú)苗，在溫度環(huán)境不同的條件下培育，結(jié)果造成了性腺發(fā)育快慢的明顯不同?？梢?jiàn)，在適當(dāng)溫度范圍內(nèi)，溫度的提高有助于細(xì)胞的分裂，推動(dòng)性腺的發(fā)育和分化。

［1］何亞，王華，王偉，等．溫度對(duì)不同體質(zhì)量紅鰭東方鲀幼魚(yú)耗氧率和排氨率的影響［J］．大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，29(5):481-485

［2］姜志強(qiáng)．，吳立新，郝拉娣，等．海水養(yǎng)殖魚(yú)類生物學(xué)及養(yǎng)殖［M］．北京:海洋出版社，2004:61．

［3］鈴木譲．ゲノム育種によりトラフグの新品種作出をめざす［J］．生物機(jī)能開(kāi)発研究所紀(jì)要，2010，10:9-23．

［4］Desprez D，Melard C．Effect of ambient water temperature on sex determination in the blue tilapia Oreo-chromis aureus［J］．Aquaculture，1998，162:79-84．

［5］范兆廷．水產(chǎn)動(dòng)物育種學(xué)(修訂版)［M］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2013:175．

［6］桂建芳．魚(yú)類性別和生殖的遺傳基礎(chǔ)及其人工控制［M］．北京:科學(xué)出版社，2007:51．

［7］Goto R，Tatsunari M，Kawamata K，et al．Effects of temperature on gonadal sex determination in barfin flounder(Verasper moseri)［J］．Fisheries Science，1999，65:884-887．

［8］Matsuura S，Naito T，Shincho M，et al．Gonadal sex differentiation in tiger puffer，Takifugu rubripes［J］．Suisanzoshoku，1994，42(4):619-625．

［9］Suzuki N，Okada K，Kamiya N．Gonadal development，sexual differentiation and sex ratio of tiger puffer，Takifugu rubripes［J］．Bulletin of the Nansei National Fisheries Research Institute(Japan)，1996，29(2):39-48．

［10］舒琥，蔡曉閱，劉鋒，等．鲀形目3種魚(yú)的染色體組型分析［J］．動(dòng)物學(xué)雜志，2010，45(2):101-106．

［11］王茂林，姜志強(qiáng)，李榮．紅鰭東方鲀?nèi)扼w誘導(dǎo)的初步研究［J］．水產(chǎn)科學(xué)，2006，25(7):349-352．

［12］郝君，孫效文，孟雪松．紅鰭東方鲀微衛(wèi)星DNA多態(tài)性初步分析［J］．上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，15(1):21-24．

［13］崔建洲，申雪艷，楊官品，等．紅鰭東方鲀基因組微衛(wèi)星特征分析［J］．中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，36(2):249-254．

［14］陳艷翠，高天翔，陳四清，等．紅鰭東方鲀養(yǎng)殖群體生化遺傳變異初步研究［J］．海洋水產(chǎn)研究，2007，28(4):14-20．

［15］李桑，尤永隆，林丹軍，等．澤蛙的性腺分化及溫度對(duì)性別決定的影響［J］．動(dòng)物學(xué)報(bào)，2008(2):271-281．

［16］Blazquez M，Zanuy S，Carillo M，et al．Effects of rearing temperature on sex differentiation in the European sea bass(Dicentrar-chus labrax L．)［J］．Journal of Experimental Zoology Part B:Molecular and Developmental Evolution，1998，281:207-216．

［17］Craig J K，F(xiàn)oote C J，Wood C C．Evidence for temperature-dependent sex determination in sockeye salmon(Oncorhynchus nerka)［J］．Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences，1996，53:141-147．

［18］Strssmann C A，Moriyama S，Hanke E F，et al．Evidence of thermolabile sex determination in pejerrey［J］．Journal of Fish Biology，1996，48:643-651．

［19］Patino R，Davis K B，Schoore J E，et al．Sex differentiation of channel catfish gonads:normal development and effects of temperature［J］．Journal of Experimental Zoology Part B:Molecular and Developmental Evolution，1996，276:209-218．

［20］南平，杜啟艷，燕帥國(guó)，等．溫度對(duì)泥鰍和大鱗副泥鰍性腺分化的影響和CYP19a基因的克隆與時(shí)空表達(dá)［J］．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2005，12(4):408-412．

［21］服部亙宏，宮下盛，澤田好史．トラフグ養(yǎng)殖における雄の優(yōu)占生産［J］．日本水産學(xué)會(huì)誌，2012，78(1):87．

［22］Yamamoto T．Sex differentiation［M］//Fish Physiology(Vol．III)．New York:Academic Press，1969:17-117．

［23］史改花，杜啟艷，張曉亞，等．大鱗副泥鰍性腺發(fā)生和分化的組織學(xué)研究［J］．河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，36(6):163-166．

［24］Komen J，De Boer P，Richter J J．Male sex reversal in gynogentic XX females of common carp(Cyprinus carpio L．)by a recessive mutation in a sex-determining gene［J］．Hered，1992，83(6):431-434．

［25］Maack G，Segner H．Morphological development of the gonads in zebrafish［J］．Journal of Fish Biology，2003，62(4):895-906．

［26］Baroiller J F，D'Cotta H．Environment and sex determination in farmed fish［J］．Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxical Pharmacol，2001，130(4):399-409．

［27］Strussmann C A，Saito T，Usui M，et al．Thermal thresholds and critical period of thermolabile sex determination in two atherinid fishes，Odontesthes bonariensis and Patagonina hatcheri［J］．Journal of Experimental Zoology Part A:Comparative Experimental Biology，1997，278(3):167-177．

［28］田永勝，汪娣，徐營(yíng)，等．溫度對(duì)半滑舌鰨家系生長(zhǎng)及性別的影響［J］．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2011，35(2):176-183．