柚皮苷的大鼠血漿蛋白結合率研究

李季泓

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·藥學研究·

柚皮苷的大鼠血漿蛋白結合率研究

李季泓

目的 研究柚皮苷的大鼠血漿蛋白結合率。方法使用平衡透析法模擬柚皮苷在體內與血漿蛋白結合的過程，并建立測定柚皮苷的高效液相色譜-質譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)方法，測定低、中、高3個濃度(100、600、3 600 ng/mL)的柚皮苷在透析袋內血漿中和透析袋外緩沖液中的濃度，計算血漿蛋白結合率。結果低、中、高3個濃度的柚皮苷在體外與大鼠的平均血漿蛋白結合率分別為91.5%、90.5%和96.3%，3個濃度之間的血漿蛋白結合率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論柚皮苷與大鼠血漿蛋白高度結合。

柚皮苷；血漿蛋白結合率；大鼠；平衡透析法

0 引言

柚皮苷是一種雙氫黃酮類化合物，主要存在于蕓香科植物，同時也是化橘紅、骨碎補、枳實等中藥的主要有效成分之一[1]。研究表明，柚皮苷具有降脂、抗腫瘤、解痙、鎮(zhèn)痛、調節(jié)血糖等藥理作用[2-6]。柚皮苷在體內可通過與腸內P-糖蛋白交互作用影響藥物的吸收，還能影響細胞色素P450的活性，從而影響此酶相關底物的代謝[7]。

血漿蛋白結合率是藥物代謝過程中的一個重要參數(shù)之一，目前關于柚皮苷的血漿蛋白結合率研究的文獻報道很少。本研究采用平衡透析法研究了柚皮苷的大鼠血漿蛋白結合率，為進一步闡述柚皮苷的體內代謝行為和藥效學提供了依據，同時為進一步提高以柚皮苷為主要活性成分的藥物的臨床合理應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Thermp TSQ Quantum Access液相色譜質譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子化源(ESI)(美國Thermo公司)；Sigma冷凍離心機(德國Sigma公司)；MD25透析袋，截留范圍8 000～14 000(北京鼎國生物技術有限責任公司)。柚皮苷對照品(110722-200309，純度>98%，中國藥品生物制品檢定所)；橙皮苷對照品(110721-200211，內標，中國藥品生物制品檢定所)。乙腈、甲醇為色譜純(美國Fisher公司)；純凈水由MilliQ純水制備系統(tǒng)制備；其余試劑均為分析純。

1.2 動物 健康Wistar大鼠，雄性，體重(200±10.0)g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗前禁食24 h，自由飲水。

2 方法

2.1 對照品溶液的配制 精密稱取柚皮苷對照品2.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配成濃度為200 μg/mL的儲備液。精密吸取該儲備液2.5 mL，用甲醇稀釋至25 mL，配成濃度為20 μg/mL的工作溶液，吸取該溶液適量進行一系列稀釋，得到系列濃度的對照品溶液和低、中、高(150、1 000、4 000 ng/mL)3個濃度的質控(QC)溶液。

2.2 空白透析液的配制 準確稱量磷酸氫二鉀14.11 g，磷酸二氫鉀2.59 g，氯化鈉1.99 g，以適量超純水溶解，并補充體積至1 L，得pH 7.4磷酸緩沖液，即空白透析液。

2.3 空白大鼠血漿的制備 取Wistar大鼠5只，眼眶靜脈取血，置肝素抗凝離心管中，3 500 r/min離心5 min，分離血漿，混合，備用。

2.4 LC-MS/MS分析條件

2.4.1 液相色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%甲酸(25∶75，v/v)；流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.4.2 質譜條件 ESI源，采用正離子檢測模式，離子噴射電壓(IS)：4 000 V；毛細管溫度：350 ℃；鞘氣(N2)：40 L/min；輔助氣(N2)：10 L/min；掃描方式為選擇性離子監(jiān)測(SRM)；用于定量分析的離子反應分別為柚皮苷：m/z 579→271和橙皮苷 m/z 609→301，碰撞能量分別為30 eV和25 eV。

2.5 樣品處理

2.5.1 透析內液血漿樣品的預處理 精密吸取透析平衡后的袋內血漿50 μL，置于1.5 mL具塞試管中，加入50 μL內標溶液(1 000 ng/mL)和50 μL甲醇，混勻，然后加入250 μL甲醇，渦旋1 min混合均勻，10 000 r/min離心5 min，取上清10 μL進行LC-MS/MS分析。

2.5.2 透析外液樣品的預處理 取透析外液，用孔徑0.45 μm的水系過濾器過濾后吸取50 μL，依次加入50 μL內標溶液、50 μL甲醇，渦旋混合均勻，取10 μL進行LC-MS/MS分析。

2.6 分析方法驗證考察

2.6.1 標準曲線 取空白血漿或空白透析液50 μL，加入柚皮苷標準品系列溶液50 μL，配制相當于空白血漿或空白透析液中濃度為50、150、500、1 000、2 000和5 000 ng/mL的樣品，按“2.5”項下方法操作，建立工作曲線。用加權最小二乘法[8]以柚皮苷的峰面積(y)對其濃度(c)作圖，求得直線回歸方程。

2.6.2 準確度與精密度 取空白血漿或空白透析液50 μL，按“2.6.1”項下方法操作，配成低、中、高3個濃度(150、1 000和4 000 ng/mL)的QC樣品?？疾旆椒ǖ娜諆群腿臻g精密度(RSD，%)和準確度(RE，%)。

2.6.3 提取回收率 取空白血漿50 μL，按“2.6.1”項下方法操作，配成低、中、高(150、1 000、4 000 ng/mL)3個QC濃度，每個濃度3個樣本，考察方法的提取回收率。

2.6.4 穩(wěn)定性 取空白血漿50 μL，按“2.6.1”項下方法操作，配成低、中、高(150、1 000、4 000 ng/mL)3個濃度，考察血漿樣品處理后室溫放置4 h和-20 ℃保存1周的穩(wěn)定性。

2.7 血漿蛋白結合率測定 本研究采用平衡透析法研究柚皮苷的大鼠血漿蛋白結合率。將透析袋剪成約10 cm左右的小段，用蒸餾水煮沸5 min，再用60 ℃蒸餾水沖洗2 min后在緩沖液中浸泡，4 ℃保存?zhèn)溆?。將處理后的透析袋一端折疊，結扎，將1 mL空白血漿加入透析袋內，將透析袋另一端扎緊，將其懸浮于盛有15 mL緩沖液的廣口瓶中，膜外緩沖液中樣品質量濃度分別為100、600和3 600 ng/mL，將透析袋內外液面調節(jié)至同一水平面，并避免透析袋貼于瓶壁。將瓶口密封后，于4 ℃靜置48 h至藥物擴散平衡。透析結束后，使用10%高氯酸溶液檢查透析外液有無蛋白漏出，有漏出者視為作廢。平衡結束后，分別吸取袋內、袋外樣本，采用建立的LC-MS/MS方法測定其濃度，并使用下列公式計算血漿蛋白結合率：PB ratio(%)=(Cinside-Coutside)/Cinside×100%，其中，PB ratio為血漿蛋白結合率；Cinside為袋內血漿中藥物的濃度；Coutside為袋外透析液中藥物的濃度。

3 結果

3.1 方法學驗證 在本研究條件下，空白血漿、空白透析液不干擾柚皮苷的測定(見圖1)。在空白血漿或空白透析液中，柚皮苷在50.0～5 000 ng/mL范圍內線性關系良好(r>0.998)，典型回歸曲線分別為y=0.001 4+0.028 2 c和y=0.003 2+0.045 4 c，方法的定量下限為50.0 ng/mL。透析內液和透析外液低、中、高3個濃度(150、1 000和4 000 ng/mL)的QC樣品連續(xù)測定3 d的準確度和精密度良好，日間和日內精密度均在±15%之間，準確度在-7.82～6.45之間。透析袋內血漿中柚皮苷的提取回收率在90.2%～93.5%之間。穩(wěn)定性考察結果表明血漿樣品在室溫放置4 h和-20 ℃保存1周穩(wěn)定。

3.2 透析平衡時間的確定 為了考察透析平衡時間，將處理過的透析袋一端扎緊，吸取1 mL空白血漿加入透析袋內，將透析袋另一端扎緊，使其懸浮于盛有15 mL含藥緩沖液(600 ng/mL)的廣口瓶中。將瓶口密封后，置于37 ℃水浴中，分別在12、24、36、48和60 h吸取透析袋內外液適量進行LC-MS/MS分析，測定透析袋內外液的濃度，以當日標準曲線計算透析袋內外柚皮苷的質量濃度，以二者比值確定藥物從袋內外自由擴散達到平衡的時間。結果顯示，48 h時，袋內、外溶液中柚皮苷的質量濃度相等，表明擴散48 h已達到平衡，因此設定平衡透析時間為48 h。

圖1 袋內血漿中柚皮苷的典型HPLC-MS/MS色譜圖

3.3 血漿蛋白結合率測定 柚皮苷的大鼠血漿蛋白結合率測定結果見表1，低、中、高3個濃度的柚皮苷的血漿蛋白結合率在90.5%～96.3%之間。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對不同濃度樣品的血漿蛋白結合率進行單因素方差分析，結果顯示，低、中、高3個濃度之間的血漿蛋白結合率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 柚皮苷大鼠血漿蛋白結合率測定結果

4 討論

藥物血漿蛋白結合是指藥物與血漿中的蛋白結合，形成藥物-大分子復合物[9]。藥物與血漿蛋白之間的結合反應對藥物的消除有重要影響，通常情況下，血漿蛋白結合率高的藥物入血后分布較慢，消除半衰期較長。本文研究的結果顯示，柚皮苷的血漿蛋白結合率較高，約為70%。文獻報道[10]，口服給藥后柚皮苷的消除半衰期約為5 h，應屬于常速消除的藥物，與其較高的血漿蛋白結合率所提示的消除時間較長不相吻合，這可能與柚皮苷在腸內細菌作用下發(fā)生脫糖基化反應，主要以苷元形式吸收入血有關[11]。

血漿蛋白結合率的研究方法主要有平衡透析法、超過濾法、超速離心法和凝膠過濾法等[12]，而平衡透析法是研究血漿蛋白結合率的經典方法，簡單、經濟，因此，本實驗選擇此方法來測定柚皮苷的血漿蛋白結合率。

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Study on plasma protein binding rate of naringin in rats

LI Ji-hong

(Department of Pharmacy,Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China)

Objective To study the plasma protein binding rate of naringin in rats.MethodsUnder three different concentrations (100,600 and 3 600 ng/mL),this paper used equilibrium dialysis method to imitate the binding process between naringin and the plasma protein of rats,and determined the concentration of naringin in and out of the dialysis membrane by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method.The binding rate was calculated.ResultsUnder the experimental concentrations,the plasma protein binding rates of naringin in rats were 91.5%,90.5% and 96.3% at low,middle and high concentrations,respectively.There was no significant difference among the three concentrations.ConclusionNaringin is highly bound to plasma proteins in rats.

Naringin; Plasma protein binding rate; Rat; Equilibrium dialysis

2014-01-15

遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科，沈陽 110032

10.14053/j.cnki.ppcr.201505020