六味地黃湯水提醇溶部位對(duì)2型糖尿病大鼠胰島及腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

戴 冰，吳沁璇，肖子曾*，周芳亮，曹璐婷，曾呈茜，范金茹，肖望重，歐陽(yáng)林旗

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

六味地黃湯水提醇溶部位對(duì)2型糖尿病大鼠胰島及腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

戴 冰1，吳沁璇2，肖子曾2*，周芳亮2，曹璐婷2，曾呈茜2，范金茹1，肖望重1，歐陽(yáng)林旗1

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的研究六味地黃湯水提醇溶部位對(duì)2型糖尿病大鼠胰島及腎臟的影響。方法采用高糖、高脂飼料喂養(yǎng)4周后，再行腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）且空腹血糖(FBG)≥16．7 mmol/L的大鼠建立2型糖尿病動(dòng)物模型，將其隨機(jī)分為空白組、模型組、羅格列酮組和六味地黃湯水提醇溶部位組，觀察給藥1個(gè)月后大鼠空腹血糖（FBG）和大鼠胰島、腎臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果六味地黃湯水提醇溶部位能降低2型糖尿病大鼠FBG值（P<0.01），對(duì)其受損的胰島及腎臟有修復(fù)作用。結(jié)論六味地黃湯水提醇溶部位能夠修復(fù)2型糖尿病大鼠的胰島及腎臟，胰島及腎臟是具干預(yù)2型糖尿病作用的靶位之一。

六味地黃湯水提醇溶部位；2型糖尿病；胰島；腎臟

2型糖尿?。═2DM）是一種多基因遺傳因素、環(huán)境因素綜合作用引起的內(nèi)分泌代謝性疾病，研究表明，六味地黃湯可以降血糖、血脂，減輕糖尿病大鼠胰島和腎臟的損傷[1]，改善胰島素抵抗[2]（insulin resistance，IR）。六味地黃湯水提醇溶部位為其方水煎液經(jīng)70%乙醇醇沉處理得到[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)該水提醇溶部位可降低T2DM大鼠血糖、胰島素含量，改善IR[4]。但其對(duì)2型糖尿病胰島及腎臟是否有修復(fù)作用，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)將研究六味地黃湯水提醇溶部位對(duì)T2DM大鼠胰島及腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，以進(jìn)一步明確其作用的靶點(diǎn)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)藥物

六味地黃方（熟地黃24 g，山茱萸12 g，山藥12 g，牡丹皮9 g，澤瀉9 g，茯苓9 g），方中藥材由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供；羅格列酮鈉片，太極集團(tuán)重慶涪陵制藥有限公司，批號(hào)：10090198。

1.2 動(dòng)物

80只SD雄性大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量 （180～ 200）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003)，動(dòng)物合格證號(hào)：4304700293，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房：湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。

1.3 試劑

枸櫞酸、磷酸氫二鈉 （臺(tái)山市化工廠有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司）；水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；多聚甲醛（天津市化學(xué)試劑研究所）；無(wú)水乙醇（分析純，天津市科密區(qū)化學(xué)試劑有限公司）。

1.4 儀器

穩(wěn)豪倍易型（ONETOUCH UltraEasyTM）血糖儀及配套血糖試紙，強(qiáng)生（中國(guó)）醫(yī)療器材有限公司；JY3002型電子天平 （上海精密科學(xué)儀器有限公司）；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡 （德國(guó)LEICA公司）；Shandon325型石蠟切片機(jī)（英國(guó)Shandon公司）；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 （上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；MoticB5顯微攝像系統(tǒng) （麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）。

2 方法

2.1 藥物制備[5]

稱取六味地黃方750 g，浸泡30 min，煎煮2次，30 min/次，合并兩次濾液并水浴濃縮，得最終濃度為1.915 g(生藥)/mL的濃縮液。取適量濃縮后的六味地黃湯，用無(wú)水乙醇調(diào)整至70%作醇沉處理，靜置24 h后真空抽濾，抽濾液經(jīng)水浴濃縮，水提醇溶部位最終濃度為11.326 g（生藥）/mL。

2.2 高糖高脂飼料配方[6]

普通飼料70%、豬油10%、蔗糖15%、牛膽酸鈉0.5%、膽固醇2.5%、食鹽2%，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物部制備。

2.3 2型糖尿病大鼠模型的建立

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為正常組(6只)和造模組（74只），分別給予普通飼料和高糖高脂飼料喂養(yǎng)4 w后，所有動(dòng)物禁食不禁水12 h，造模組大鼠腹腔注射STZ 45 mg/（kg·d），正常組腹腔注射等體積枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液，STZ注射72 h（提前10 h禁食不禁水）后，斷尾取血檢測(cè)各組大鼠空腹血糖，F(xiàn)BG≥16.7 mmol/L者視為造模成功[6]。

2.4 分組給藥

T2DM造模組大鼠隨機(jī)分為模型組13只、羅格列酮組14只0.81 mg/（kg·d）、六味地黃湯水提醇溶部位組14只6.75 g生藥/（kg·d），正常組大鼠為空白組大鼠，連續(xù)灌胃給藥30 d，實(shí)驗(yàn)大鼠存活28只?？瞻缀湍Ｐ徒M灌服等體積蒸餾水，給藥劑量按照60 kg成人與200 g大鼠體表面積折算。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 2型糖尿病大鼠模型不同時(shí)間的FBG檢測(cè) 分別于給藥10、20、30 d后取空白組與模型組大鼠禁食10 h，斷尾取血檢測(cè)其FBG。

2.5.2 各組大鼠造模后給藥30 d的體質(zhì)量檢測(cè)分別于給藥10、20、30 d后取各組大鼠，檢測(cè)其體質(zhì)量。

2.5.3 給藥30 d后大鼠FBG檢測(cè) 給藥30 d后，分別取各組存活大鼠禁食10 h，斷尾取血檢測(cè)FBG。

2.5.4 HE染色觀察各組大鼠胰島及腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的病理改變 上述檢測(cè)完成后，各組大鼠再按0.35 g/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉，解剖，迅速剪取大鼠胰腺、腎臟組織，4%多聚甲醛固定。上述采集的大鼠胰腺及肝臟組織常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片、烘烤、脫蠟、復(fù)水、HE染色及封片，顯微鏡下觀察其形態(tài)及其組織結(jié)構(gòu)，確定胰島的位置，比較相同視野下大鼠胰島及胰島β細(xì)胞的變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 2型糖尿病大鼠模型30 d的FBG變化

模型組與空白組比較，模型組大鼠第10、20、30天的FBG均明顯高于空白組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示該模型的血糖穩(wěn)定性良好。如圖1所示。

3.2 各組大鼠造模后給藥30 d的體質(zhì)量變化

模型組大鼠與空白組比較，模型組大鼠第10、20、30天的體質(zhì)量均明顯低于空白對(duì)照組，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），體質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，提示T2DM大鼠體瘦虛弱。六味地黃湯的提醇溶部位及羅格列酮組能改善模型組大鼠體質(zhì)量，但與其比較差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示六味地黃湯水提醇溶部位及羅格列酮改善T2DM大鼠體質(zhì)量效果不明顯。如圖2所示。

圖1 2型糖尿病模型大鼠30 d的FBG變化(±s)

圖2 各組大鼠給藥30 d體質(zhì)量的變化(±s)

3.3 六味地黃湯水提醇溶部位對(duì)2型糖尿病大鼠FBG的影響

給藥1個(gè)月后，模型組大鼠與空白組比較，F(xiàn)BG≥16.7 mmol/L，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），提示模型組模型穩(wěn)定；六味地黃湯水提醇溶部位組與模型組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示六味地黃湯水提醇溶部位可以降低2型糖尿病胰島素抵抗大鼠的空腹血糖；羅格列酮組與模型組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示對(duì)照藥物能夠改善2型糖尿病大鼠血糖；六味地黃湯水提醇溶部位組與羅格列酮組無(wú)顯著性差異，提示六味地黃湯水提醇溶部位降血糖作用與對(duì)照藥物相當(dāng)。如表1所示。

3.4 六味地黃湯水提醇溶部位對(duì)2型糖尿病大鼠胰島組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

空白組大鼠胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、規(guī)則，輪廓界限清楚；組織切片可見胰島細(xì)胞排列整齊，胞漿飽滿，其中的胰島β細(xì)胞核呈規(guī)則卵圓形，核仁清晰，染色均勻。模型組大鼠胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，形狀不規(guī)則，萎縮嚴(yán)重；胰島細(xì)胞空泡變性，排列紊亂，細(xì)胞胞漿缺失、塌陷嚴(yán)重，胰島β細(xì)胞細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核周間隙擴(kuò)張，數(shù)目減少，出現(xiàn)凋亡早期狀態(tài)。六味地黃湯水提醇溶部位組可改善胰島結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞紊亂的受損情況，使其形狀相對(duì)清晰可見，無(wú)明顯萎縮，β細(xì)胞數(shù)量增多、細(xì)胞胞漿豐富。提示2型糖尿病大鼠胰島組織形態(tài)結(jié)構(gòu)受損，六味地黃湯水提醇溶部位可改善模型大鼠受損的胰島，其藥效與羅格列酮作用相似。如封三彩圖圖3所示。

表1 給藥后各組大鼠FBG值比較 （±s）

表1 給藥后各組大鼠FBG值比較 （±s）

注：與空白組比較**P＜0.01；與模型組比較##P<0.01。

組別空白組模型組羅格列酮組六味地黃湯水提醇溶部位組n 6 8 8 6劑量g/（kg·d)——8.1×10-46.75給藥30 d后FBG (mmol/L) 5.77±0.15 22.00±0.98** 11.98±0.79**##10.33±1.25**##

3.5 六味地黃湯水提醇溶部位對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

空白組大鼠腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰、規(guī)則；組織切片可見皮質(zhì)腎小球、腎小管排列規(guī)則，腎小球、腎小囊體積、囊腔腔隙正常，腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊，形狀不規(guī)則；腎小球體積增大，球囊腔窄小，毛細(xì)血管球基膜增厚；腎小管擴(kuò)張且部分管腔內(nèi)蛋白管型，出現(xiàn)早期的腎功能衰退；其上皮細(xì)胞肥大且部分片狀壞死伴間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。六味地黃湯水提醇溶部位組能改善腎臟結(jié)構(gòu)模糊，形狀不規(guī)則的狀況，使其腎小球體積縮小，囊腔腔隙增大，腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，其水腫、壞死及間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，管腔內(nèi)蛋白管型減少，提示2型糖尿病大鼠腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)受損，六味地黃湯水提醇溶部位可改善模型大鼠受損腎臟的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，其藥效與羅格列酮作用相當(dāng)。如封三彩圖圖4所示。

4 討論

2型糖尿病約占糖尿病患者總數(shù)的85%～90%，其發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中，胰島的形態(tài)及其組織結(jié)構(gòu)都會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的受損情況,這將會(huì)導(dǎo)致胰島功能障礙，如胰島萎縮、空泡變性，胰島β細(xì)胞數(shù)目減少等[7]。同時(shí)該病早期會(huì)發(fā)生腎小球肥大、腎小管內(nèi)皮細(xì)胞肥大和基底膜增厚等病理性損傷[8]，而其占2型糖尿病腎病發(fā)病率的10%～20%，糖尿病患者死于腎衰竭的就有5%～10%[9]，因此，保護(hù)胰島及腎臟對(duì)于治療2型糖尿病有著重要的意義。

目前用于2型糖尿病研究的動(dòng)物模型，多采用高脂喂養(yǎng)加小劑量STZ或四氧嘧啶的方法建立2型糖尿病胰島素抵抗大鼠模型，且STZ采用尾靜脈注射或腹腔注射，預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)參照大部分文獻(xiàn)腹腔注射30[10]、35[11]mg／kg STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠成模率較低，穩(wěn)定性較差，成模大鼠血糖在一定時(shí)間內(nèi)下降，故本實(shí)驗(yàn)參照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果給予大鼠腹腔注射STZ 45 mg／kg的劑量，模型組大鼠成模后血糖(20.39±2.75)mmol／L，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)一個(gè)月后血糖(22.00±2.76)mmol／L，模型穩(wěn)定。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大鼠死亡率較高，這可能與成模后分籠喂養(yǎng)時(shí) （4只/籠）大鼠間打斗、拒食高脂飼料，以及藥物對(duì)模型大鼠體質(zhì)量的改善不明顯，導(dǎo)致大鼠體瘦虛弱有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)六味地黃湯水提醇溶部位能明顯降低2型糖尿病大鼠血糖，并使其胰島的空泡變性、萎縮和胰島β細(xì)胞數(shù)目減少以及腎小球肥大、腎小管上皮細(xì)胞肥大、基底膜增厚等一系列損傷明顯減輕。表明六味地黃湯水提醇溶部位能夠改善2型糖尿病大鼠受損胰島及腎臟的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，對(duì)胰島及腎臟起到一定的修復(fù)作用。然該水提醇溶部位的修復(fù)作用機(jī)制及其藥效成分有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Liuwei Dihuang Decoction Alcohol Precipitation Extract on Pancreas and K idney of Type 2 Diabetic Rats

DAI Bing1,WU Qinxuan2,XIAO Zizeng2*,ZHOU Fangliang2,CAO Luting2,ZENG Chengxi2,FAN Jinru1,XIAO Wangzhong1, OUYANG Linqi1
（1.The first Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China；2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China）

ObjectiveTo study the effects of Liuwei Dihuang decoction alcohol precipitation extract on pancreas and kidney of type 2 diabetic rats.MethodsAfter feeding high sugar and fat diet for four weeks,the rats were intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)with FBG≥16.7 mmol/L to establish type 2 diabetic models.All rats adaptive feeding one week,then randomly divided into control group and model group.Then the model rats were random ly divided into blank group,model group,rosiglitazone group and Liuwei Dihuang group.The fasting blood glucose(FBG),and morphological structure of the pancreas islet and kidney in rats with given medicine for one month,were observed.ResultsLiuweidihuang Decoction alcohol precipitation extract could decrease the level of FBG (P<0.01)，and showed repair effects on damaged pancreas islet and kidney.ConclusionLiuweidihuang Decoction alcohol precipitation extract can repair the pathology damage of pancreas islet and kidney in type 2 diabetic rats，pancreas islet and kidney were one of the targets of its intervention.

Liuwei Dihuang decoction alcohol precipitation extraction;type 2 diabetes mellitus;pancreas islet;Kidney

R285.5；R587.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.006

2014－10－29

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13JJ3096）；湖南省科學(xué)技術(shù)廳科技計(jì)劃一般項(xiàng)目（2010FJ4091）；湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開放基金項(xiàng)目（11K046）；湖南省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（201460）；長(zhǎng)沙市科技局項(xiàng)目（K1106040-31）。

戴 冰，女，主任藥師，教授，主要從事中藥藥理學(xué)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

*肖子曾，男，教授，E-mail：xiaozz573@126.com。