饑餓脅迫24 h對(duì)小鼠認(rèn)知功能及海馬區(qū)前腦啡肽原表達(dá)的影響

謝靜濤，唐 晉，王宏寶，羅佳輝，王 潔

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)應(yīng)用心理學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

饑餓脅迫24 h對(duì)小鼠認(rèn)知功能及海馬區(qū)前腦啡肽原表達(dá)的影響

謝靜濤，唐 晉，王宏寶，羅佳輝，王 潔

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)應(yīng)用心理學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

目的觀察饑餓脅迫對(duì)小鼠認(rèn)知功能和大腦海馬區(qū)前腦啡肽原表達(dá)的影響。方法將40只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和饑餓24 h組 （下稱(chēng)饑餓組），Morris水迷宮和八臂迷宮測(cè)試小鼠的認(rèn)知功能。RT-PCR檢測(cè)大腦海馬區(qū)前腦啡肽原mRNA表達(dá)變化情況。結(jié)果饑餓組與對(duì)照組比較，①在Morris水迷宮測(cè)試中，饑餓組潛伏期明顯縮短（P＜0.05），通過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)和穿越目標(biāo)停留時(shí)間百分增加比（P＜0.05）；②在八臂迷宮測(cè)試中，饑餓組參考記憶錯(cuò)誤和工作記憶錯(cuò)誤減少（P＜0.05）；③在RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前腦啡肽原實(shí)驗(yàn)中，饑餓組小鼠大腦海馬區(qū)前腦啡肽原表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論①饑餓脅迫可增強(qiáng)小鼠的認(rèn)知功能；②饑餓脅迫通過(guò)降低小鼠大腦海馬區(qū)前腦啡肽原來(lái)增強(qiáng)認(rèn)知功能；③腦腸肽水平的調(diào)整可能是“脾藏意主思”功能實(shí)現(xiàn)的途徑之一。

“脾藏意主思”；饑餓脅迫；學(xué)習(xí)記憶；前腦啡肽原；海馬

“脾藏意主思”是中醫(yī)經(jīng)典藏象理論之一。歷代醫(yī)家及現(xiàn)代學(xué)者均認(rèn)為此處的“意”和“思”在心理學(xué)領(lǐng)域?qū)儆凇罢J(rèn)知”和“情緒”的范疇[1]，即中醫(yī)的脾胃功能除了與情緒關(guān)系密切，而且與意識(shí)活動(dòng)之間也相互影響。近年來(lái)隨著“腦腸肽”概念的提出及其深入研究，“脾藏意”的中醫(yī)理論重新被重視，不少人從“腦腸肽”的角度，闡述脾胃功能與認(rèn)知功能之間的密切關(guān)聯(lián)，并以臨床治療的效果佐證兩者之間的關(guān)系。有研究者發(fā)現(xiàn)攝食與腦腸肽有著重要的聯(lián)系[2]。在饑餓狀態(tài)下，腦—腸軸中的某些肽類(lèi)物質(zhì)被激發(fā)，使胃腸局部分泌的激素發(fā)生改變，這些激素有很多作用于神經(jīng)系統(tǒng)。結(jié)合臨床大量脾虛而導(dǎo)致認(rèn)知功能下降的病例，本課題組大膽地假設(shè)：機(jī)體的饑飽狀態(tài)與認(rèn)知功能有關(guān)。

本研究以小鼠為研究對(duì)象，從動(dòng)物生存所必須的認(rèn)知功能——注意和記憶入手，觀察饑餓脅迫使小鼠產(chǎn)生適應(yīng)性生理反應(yīng)和對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響。觀察在饑餓狀態(tài)下，小鼠的記憶能力、空間識(shí)別能力及由此大腦生理特征的變化。初步探求中醫(yī)經(jīng)典學(xué)說(shuō)“脾藏意”理論與認(rèn)知行為之間的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

BALB/c雄性小鼠40只，4～6周齡，體質(zhì)量為（20.00±1.32）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)NO.430004700012944，飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑，Invitrogene公司，Cat.No.15596-026；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，上海Fermentas公司，F(xiàn)ermentas K1622；標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量Marker，上海Fermentas公司，#SM0311；PCR Kit with Taq，碧云天生物技術(shù)研究所，D7233。

1.3 主要儀器

MT-200Morris水迷宮視頻跟蹤分析測(cè)試系統(tǒng)，成都泰盟軟件有限公司；RM-200八臂迷宮分析測(cè)試系統(tǒng)，成都泰盟軟件有限公司；Mastercycler nexus PCR儀，Eppendorf公司；Tanon-4100凝膠成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；5417R低溫高速離心機(jī)，eppendorf公司；PYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 小鼠分組和干預(yù) 實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，讓小鼠進(jìn)行Morris水迷宮和八臂迷宮的學(xué)習(xí)。學(xué)習(xí)后達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和饑餓24 h組（下稱(chēng)饑餓組），每組10只。對(duì)饑餓組小鼠饑餓24 h進(jìn)行禁食干預(yù)，期間正常飲水；對(duì)照組小鼠正常進(jìn)食和飲水，遵循動(dòng)物倫理學(xué)指導(dǎo)。

1.4.2 Morris水迷宮訓(xùn)練 將小鼠放入直徑為150 cm的圓形水池中，恐水的本能迫使小鼠會(huì)盡快尋找水中隱蔽的平臺(tái)。訓(xùn)練時(shí)將小鼠從槽壁4個(gè)不同方位依次放入。每次待小鼠找到平臺(tái)后讓其在平臺(tái)上休息30 s，再進(jìn)行下一次訓(xùn)練。水中尋找平臺(tái)的時(shí)限為60 s。即60 s內(nèi)未找到平臺(tái)則視為尋找失敗。訓(xùn)練為上、下午2個(gè)時(shí)段，連續(xù)7 d。7 d后在60 s內(nèi)能找到平臺(tái)者進(jìn)入實(shí)驗(yàn)分組。

1.4.3 八臂迷宮訓(xùn)練 八臂迷宮由中央?yún)^(qū)向四周延伸相同角度和長(zhǎng)度的八個(gè)臂所構(gòu)成。中央?yún)^(qū)有人工控制的小門(mén)。在固定長(zhǎng)臂最遠(yuǎn)端放置食餌。小鼠置于中央?yún)^(qū)小盒內(nèi)后，試驗(yàn)者離開(kāi)實(shí)驗(yàn)間,保持環(huán)境安靜15 s，開(kāi)啟所有小門(mén)，任小鼠自由選擇進(jìn)入放射狀臂中攝取食餌。通過(guò)監(jiān)控系統(tǒng)觀察實(shí)驗(yàn)小鼠10 min內(nèi)在迷宮中的攝食活動(dòng)情況。每天訓(xùn)練1次，連續(xù)7 d。能夠進(jìn)入有餌臂且全部吃完者視為訓(xùn)練成功，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)分組。

1.4.4 RT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平 采用頸椎脫臼法處死小鼠，冰上操作，取出大腦的海馬組織，將組織于-80℃中保存。提取RNA，合成cDNA。用RT-PCR方法，以GAPDH內(nèi)參為對(duì)照，檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平 （見(jiàn)表1）。引物由上海生工公司合成，反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸8 min，4℃保存。檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平。1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試 （1）Morris水迷宮測(cè)試指標(biāo) 小鼠放入水中到其找到平臺(tái)的時(shí)間為潛伏期。記錄潛伏期，觀察1 min內(nèi)小鼠在平臺(tái)所在象限停留時(shí)間百分比、通過(guò)該平臺(tái)位置的次數(shù)，以此作為記憶能力的指標(biāo)；（2）八臂迷宮測(cè)試指標(biāo) 小鼠第1次進(jìn)入無(wú)餌臂攝食稱(chēng)為參照記憶錯(cuò)誤；第2次重新進(jìn)入該無(wú)餌臂攝食稱(chēng)為工作記憶錯(cuò)誤。記錄參照記憶錯(cuò)誤和工作記憶錯(cuò)誤的次數(shù)。

1.5.2 Penk mRNA和GAPDH mRNA水平的觀察 取PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)前腦啡肽原和GAPDH的mRNA表達(dá)水平（見(jiàn)表1），通過(guò)對(duì)電泳結(jié)果拍照，用Quantity one軟件分析，計(jì)算前腦啡肽原mRNA與GAPDH的比值，統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)腦腸肽表達(dá)變化情況，分析小鼠大腦海馬區(qū)前腦啡肽原差異性表達(dá)[3]。

表1 penk、GAPDH基因引物序列信息表

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“±s”表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 饑餓對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.1.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)探索饑餓對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響 與對(duì)照組小鼠相比，饑餓組小鼠尋找隱匿平臺(tái)潛伏期明顯明顯變短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，說(shuō)明饑餓組小鼠空間學(xué)習(xí)能力得到提升；饑餓組在穿越平臺(tái)的次數(shù)增加(P<0.05)以及目標(biāo)象限游泳時(shí)間占總時(shí)間百分比比重增加(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明饑餓組小鼠空間記憶力得到改善，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.1.2 八臂迷宮實(shí)驗(yàn)探索饑餓對(duì)小鼠空間記憶錯(cuò)誤的影響 與對(duì)照組小鼠相比，饑餓組小鼠的記憶錯(cuò)誤次數(shù)相對(duì)對(duì)照組小鼠來(lái)說(shuō)，其參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)減少和工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)也減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明饑餓有利于小鼠在空間記憶力上自主判斷，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 水迷宮和八臂迷宮探索小鼠認(rèn)知功能（n=10，±s）

表2 水迷宮和八臂迷宮探索小鼠認(rèn)知功能（n=10，±s）

注：與對(duì)照組比較*P<0.05。

組別對(duì)照組饑餓組潛伏期（s）38.97±11.30 30.50±5.83*穿臺(tái)次數(shù)（次）3.10±0.99 4.10±0.88*目標(biāo)象限（%）35.78±3.91 40.09±4.08*參考記憶錯(cuò)誤（次）4.50±2.27 2.40±1.17*工作記憶錯(cuò)誤（次）3.20±1.32 1.70±1.16*

2.2 饑餓對(duì)小鼠海馬區(qū)前腦啡肽原表達(dá)的影響

饑餓組小鼠的海馬區(qū)前腦啡肽原 Penk/ GAPDH mRNA的表達(dá)量為0.58±0.05，對(duì)照組為0.47±0.03，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），說(shuō)明小鼠認(rèn)知功能增強(qiáng)與腦腸肽中的腦啡肽降低有緊密的聯(lián)系，饑餓可以通過(guò)降低小鼠大腦海馬區(qū)前腦啡肽原來(lái)增強(qiáng)認(rèn)知功能（結(jié)果見(jiàn)圖1）。

圖1 小鼠海馬組織penk和GAPDH mRNA表達(dá)電泳圖

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，脾胃為“后天之本”，脾胃健方能受納食物、消化和運(yùn)輸水谷，化生五味，以養(yǎng)四肢百骸。有人通過(guò)實(shí)驗(yàn)建造脾虛小、大鼠模型來(lái)研究脾胃功能與大腦學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：脾胃健則思維敏捷，注意力集中，脾胃虛則健忘，腦力下降[4]。王群等[5]發(fā)現(xiàn)反復(fù)饑餓2 d；喂食3 d/60 d地循環(huán)可引起大鼠空間學(xué)習(xí)能力記憶障礙。慢性間歇性饑餓可導(dǎo)致大鼠早期學(xué)習(xí)記憶能力下降[6]。胡意員等[7]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期高脂飲食可損傷小鼠的工作記憶和空間記憶。以上研究結(jié)果均因外在或內(nèi)在原因?qū)е铝似⑽腹δ苁軗p，從而影響了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，使“脾”難以發(fā)揮其“藏意主思”的功能。然而在其本身功能對(duì)照而并不需要進(jìn)行運(yùn)化之時(shí)，“脾”是如何“藏意主思”或者說(shuō)能否“藏意主思”？謝靜濤等[8]曾對(duì)24名在校大學(xué)生進(jìn)行觀察：發(fā)現(xiàn)禁食44 h后的自愿者其注意的集中能力不但沒(méi)有下降反而有所增強(qiáng)，注意的分配能力與對(duì)照組相比沒(méi)有差異。本次研究采用饑餓24 h的小鼠，利用Morris水迷宮和八臂迷宮檢測(cè)小鼠的認(rèn)知能力，結(jié)果在饑餓脅迫下小鼠空間認(rèn)知能力得到增強(qiáng)。這與邵鄰相等[9]采用電迷路法進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)饑餓應(yīng)激狀態(tài)下的小鼠學(xué)習(xí)能力增強(qiáng)、記憶能力有提高趨勢(shì)的研究結(jié)果大致一致。說(shuō)明長(zhǎng)期饑餓會(huì)導(dǎo)致病理性變化，但短暫饑餓反而使實(shí)驗(yàn)鼠能作出適應(yīng)性的生理反應(yīng)。

腦啡肽是同時(shí)存在于腸道和神經(jīng)系統(tǒng)的腦腸肽。哺乳動(dòng)物的腦啡肽在腦中含量比較高、分布廣泛。目前研究發(fā)現(xiàn)：甲硫氨酸腦啡肽和亮氨酸腦啡肽這兩種腦啡肽共同來(lái)源于前腦啡肽[10]。大量研究已證實(shí)，腦啡肽參與基底核功能和認(rèn)知的調(diào)節(jié)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，內(nèi)源性腦啡肽可能影響杏仁核的結(jié)果和功能，在記憶的調(diào)節(jié)中起著負(fù)向的影響。

綜上所述，饑餓脅迫時(shí)，因生理需求改變了生理代謝水平，促使動(dòng)物體內(nèi)激素、酶、基因表達(dá)發(fā)生改變以利于其物種的生存。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，饑餓脅迫24 h后小鼠海馬組織中前腦啡肽原的含量與對(duì)照組相比明顯下調(diào)。因此筆者推測(cè)一定程度的饑餓可能有利于海馬功能的發(fā)揮。“脾藏意主思”功能的實(shí)現(xiàn)，腦腸肽水平的調(diào)整有可能是其途徑之一，此結(jié)論有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1]謝靜濤，王米渠.試論脾藏意主思的心理病理基礎(chǔ)[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28(4)：10-12.

[2]鄭則寶，郭 義.“脾主思”的現(xiàn)代科學(xué)基礎(chǔ)[J].山東中醫(yī)雜志，2008，27(4)：221-223.

[3]潘寶龍，吉秀亮，楊 焱，等.鋁對(duì)小鼠認(rèn)知能力及β-APP基因表達(dá)的影響[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2010，27(4)：205-208.

[4]錢(qián)會(huì)南，許 紅，沈麗波.健脾與補(bǔ)腎對(duì)脾虛模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)P物質(zhì)、血管活性腸肽的影響 [J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2007，14(1)：36-38.

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[7]胡意員，周利飛，何金彩，等.長(zhǎng)期高脂飲食對(duì)小鼠認(rèn)知功能及情緒的影響[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，43(4)：241-244.

[8]謝靜濤，唐 晉.饑餓狀態(tài)對(duì)注意力的影響[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，24(3)：53-54.

[9]邵鄰相，徐麗珊，淑 靜.饑餓脅迫對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶SOD和心肌丙二醛的影響[J].動(dòng)物學(xué)雜志，2002，37(6)：21-22.

[10]Sollars C，Lecaude S，Lee J，et al.Cloning of prodynorphin cDNAs from the brain of Australian and African lungfish：implications for the evolution of the prodynorphin gene [J].Neu roendocrinology，2004，79(4)：185-196.

（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Hunger Stress on Cognition and the Expression of Proenkephalin in M ice

XIE Jingtao,TANG Jin,WANG Hongbao,LUO Jiahui,WANG Jie
(Department of Applied Psychology,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha.Hunan 410007,China)

Objective To observe the effects of hunger stress on cognition and the expression of proenkephalin in hippocampus of mice.Methods40 mice were random ly divided into the control group and huger for 24 h group (huger group).The cognitive function of mice was examined by Morris water maze and the 8-arm radial maze test.The mRNA levels of PENK in hippocampus were detected by RT-PCR.ResultsCompared with the control group,① The mean time of escape latencies in hunger group was decreased significantly by Morris water maze test(P＜0.05);②In the 8-arm radial maze, the reference memory error and working memory error in hunger group were reduced remarkably(P＜0.05);③The mRNA expressions of PENK were reduced significantly in hippocampus(P＜0.05).Conclusion①The huger stress could increase the cognitive ability of mice;②Starvation could increase the ability of cognition by down-regulating the expression of proenkephalin(PENK)in hippocampus of mice;③The functional realization of,The expression of brain-gut peptides may be one of the realization mechanisms of"spleen storing idea and governing thought".

"spleen storing idea and governing thought"； hunger stress； spatial learning and memory；proenkephalin；hippocampus

R256.3；R965

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.004

2015－01－27

湖南省教育廳資助課題(60010511)；長(zhǎng)沙市科技局資助課題(20258)。

謝靜濤，女，湖南長(zhǎng)沙人，教授，研究方向：中醫(yī)心理學(xué)、心理咨詢(xún)和心理治療。