中國湖南漢族人群胰島素樣生長因子-1 rs972936位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與阿爾茨海默病的相關(guān)性分析

陳麗穎 杜小平

1.長沙市第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南長沙410006；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南長沙410008

中國湖南漢族人群胰島素樣生長因子-1 rs972936位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與阿爾茨海默病的相關(guān)性分析

陳麗穎1杜小平2▲

1.長沙市第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南長沙410006；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南長沙410008

目的研究部分漢族人群IGF-1 rs972936的單核苷酸多態(tài)性與阿爾茨海默病的相關(guān)性。方法本研究于2009年4月～2011年12月期間，篩選170例湖南漢族AD患者與147例性別、年齡匹配的健康人群，其IGF-1 rs972936位點(diǎn)的基因型、等位基因采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測并分析。結(jié)果IGF-1 rs972936 GG、AG和AA在兩組間的分布頻率：AD組48.82%、38.23%、12.94%，對照組20.41%、40.82%、38.78%；等位基因G、A分布頻率為：AD組67.94%、32.06%，對照組40.82%、59.18%，以上各頻率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論IGF-1 rs972936的GG基因型、G等位基因可能為湖南漢族人群AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素。

阿爾茨海默??；胰島素樣生長因子-1；單核苷酸多態(tài)性；基因

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）為中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以進(jìn)行性記憶力喪失及認(rèn)知功能退化為臨床主要表現(xiàn)，多伴有精神癥狀和人格障礙。AD具有三大特征性病理學(xué)改變，包括神經(jīng)纖維纏結(jié)、老年斑、海馬錐體細(xì)胞顆?？张葑冃裕话悴±砀淖儼X室擴(kuò)大（記憶、語言、海馬區(qū)）、腦溝增寬、皮質(zhì)廣泛萎縮、血管淀粉樣變性、星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)及大量神經(jīng)元細(xì)胞突觸缺失[1-3]。較之于研究透徹的病理學(xué)改變，AD的病因未明、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，眾多復(fù)雜的遺傳和環(huán)境因素參與其中，近年來又以遺傳易感基因異常為研究熱點(diǎn)，其中早老素1基因、早老素2基因、淀粉樣前體蛋白基因、載脂蛋白Eε4基因?yàn)橐汛_定的4種AD易感基因。IGF-1具有強(qiáng)大的神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用，通過促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化等作用，參與神經(jīng)變性過程，影響AD發(fā)病機(jī)制。國外已有研究證明IGF-1 rs972936基因多態(tài)性能影響AD患者血清中的IGF-1濃度[4，5]，影響疾病進(jìn)程，國內(nèi)尚無相關(guān)報(bào)道。本研究通過應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms，PCR-RFLP）檢測IGF-1 rs972936的單核苷酸多態(tài)性，從遺傳易感基因?qū)W角度為AD提供分子遺傳學(xué)診斷依據(jù)，進(jìn)一步探討IGF-1與AD病理學(xué)機(jī)制的相互關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本課題所選取的研究對象選自中國湖南地區(qū)漢族人群，均簽署知情同意書。研究資料收集時(shí)間段為2009～2012年。170例AD患者選自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院附屬一醫(yī)院、湘雅附屬二醫(yī)院、湖南省第二人民醫(yī)院住院患者及長沙市第三福利院，其中病程≤1年7例，1年＜病程＜2年28例，2年≤病程＜3年26例，3年≤病程＜4年27例，4年≤病程＜5年16例，5年≤病程＜6年24例，6≤病程＜10年30例，病程≥10年12例。147例正常健康人群均來自湘雅醫(yī)院體檢中心。兩組年齡構(gòu)成、性別比例均匹配。統(tǒng)計(jì)兩組間的性別構(gòu)成比、起病年齡資料，年齡比較采用t檢驗(yàn)，性別比較采用χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 性別及年齡在AD組、正常對照組間的匹配檢測

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

AD篩選標(biāo)準(zhǔn)：采用《精神障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)和統(tǒng)計(jì)手冊》（DSM-IV-R），美國神經(jīng)病學(xué)、言語障礙、卒中研究所（NINCDS），阿爾茨海默病及相關(guān)疾病協(xié)會工作組（NINCDS-ADRDA）診斷標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)診斷方法和把握度分三類：明確的AD、可能性大的AD、可能的AD。對“可能的AD”需通過MMSE量表、CDR癡呆登記量表、Hanchiski缺血量表、畫鐘試驗(yàn)進(jìn)一步評判。排除標(biāo)準(zhǔn)：突然發(fā)病及卒中樣起?。话l(fā)病或病程早期出現(xiàn)局灶神經(jīng)功能缺損或癲癇及步態(tài)異常；早期錐體外系癥狀或其他內(nèi)科疾病引起記憶及相關(guān)癥狀，包括腦血管病、嚴(yán)重抑郁狀態(tài)、中毒和代謝異常。

正常健康對照組入組標(biāo)準(zhǔn)：①日常生活各項(xiàng)功能良好；②MMSE量表評分≥27分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在嚴(yán)重軀體疾病、糖尿病、高脂血癥及腫瘤的患者；②MMSE量表評分＜27分。

1.3 研究方法

1.3.1 DNA提取采集靜脈血4～5 mL，充分搖勻，乙二胺四乙酸（ethylene-diaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝，采用酚、氯仿法提取DNA。

1.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）過程①引物設(shè)計(jì)與檢測：目標(biāo)基因的單核苷酸多態(tài)性序列應(yīng)用Gene Bank檢索，Primer Premer 5.0、Blast軟件設(shè)計(jì)并檢測引物。IGF-1 rs972936位點(diǎn)上游引物：5’-GTGGTATGTGTAGTTATTCTGACATCCAG-3’下游引物：5’GTGTCTGGCTGTGGCTCTTAG 3’。PCR反應(yīng)體系（共10μL）：10×PCR Buffer 1.0μL，dNTP 0.5μL，gDNA 0.3μL，上、下游引物各0.1 uL，加去離子水補(bǔ)充至10μL。②PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃40 s，共20個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸6min。每次提取4～7μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，均勻點(diǎn)樣至2.5%的瓊脂糖凝膠篩孔內(nèi)，設(shè)置150 V電壓、0.5×TBE電泳緩沖液電泳30 min，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物條帶利用凝膠圖像系統(tǒng)觀察并分析、照相。

1.3.3 酶切過程IGF-1的rs972936位點(diǎn)的酶切反應(yīng)體系：內(nèi)切酶MvaI（10U/μL）0.1μL；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL；緩沖液1.5μL；加雙蒸水（ddH2O）至總體積15μL，靜置于37℃恒溫水浴箱并過夜。

1.3.4 電泳過程每次提取4～7μL的PCR酶切產(chǎn)物均勻點(diǎn)樣至3.0%的瓊脂糖凝膠篩孔內(nèi)，0.5×TBE電泳緩沖液，電泳條件設(shè)定為150 V電壓，時(shí)間為30 min，每個(gè)電泳條帶分別對應(yīng)的基因型分別呈現(xiàn)于凝膠成像系統(tǒng)，確定并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件、Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖表繪制。Hardy-Weinberg平衡檢測法檢測樣本的群體代表性。性別資料用正態(tài)變量（x±s）表示，t檢驗(yàn)用于組間計(jì)量資料的比較，χ2檢驗(yàn)用于組建計(jì)數(shù)資料的比較。P值取雙側(cè)概率，若P＜0.05為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。基因計(jì)數(shù)方法測定IGF-1 rs972936位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率，等位基因頻率=（2×純合子+雜合子）/（2×受檢人數(shù)）。

2 結(jié)果

2.1 人群代表性檢驗(yàn)

應(yīng)用Hardy-Weinberg平衡法檢測，IGF-1 rs972936基因型、等位基因在AD組的基因分布頻率檢測結(jié)果：χ2=2.542，P=1.111，對照組的基因分布頻率檢測結(jié)果：χ2=3.54，P=0.06，符合遺傳平衡（P＞0.05）。見表2。

2.2 IGF-1 rs972936位點(diǎn)的酶切產(chǎn)物判定

PCR-RFLP檢測IGF-1 rs972936位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物長度為193 bp。含多態(tài)性位點(diǎn)鳥嘌呤（G）的基因型可被限制性內(nèi)切酶MvaI特異性酶解完全，產(chǎn)生125 bp、68 bp兩個(gè)片段；含多態(tài)性位點(diǎn)腺嘌呤（A）的基因型則不會被酶解。最終電泳后的酶切產(chǎn)物有三種類型：第一型：IGF-1 rs972936位點(diǎn)為AA基因型，僅顯示193 bp一條條帶，產(chǎn)物完全未被酶切；第二型：IGF-1 rs972936位點(diǎn)為GG基因型，顯示125 bp、68 bp兩條條帶，產(chǎn)物被完全酶切；第三型：IGF-1 rs972936位點(diǎn)為AG基因型，顯示193 bp、125 bp、68 bp三條條帶，產(chǎn)物被部分酶切。見圖1。

圖1 IGF-I rs972936位點(diǎn)的PCR酶切產(chǎn)物電泳圖

2.3 IGF-1 rs972936位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率

GG、AG和AA三種基因型在AD組和對照組總體分布頻率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=39.102，P=0.000＜0.05），G、A等位基因在兩組間的總體分布頻率亦存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=46.491，P=0.000＜0.05）。見表2。AD組與對照組相比：GG基因型、G等位基因分布頻率顯著增高，AA基因型、A等位基因分布頻率顯著降低，見封三圖1。

表2 IGF-1 rs972936位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布[n（%）]

3 討論

人類胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）又稱生長介素，為一單鏈堿性多肽，基因編碼產(chǎn)物為IGF-I。IGF-I基因位于第12號染色體，全長90 kb，含有6個(gè)外顯子、6個(gè)內(nèi)含子[6]。IGF-1信號肽氨基端序列和羧基端分別由外顯子1、外顯子3的5’端編碼；外顯子3的剩余部分及外顯子4編碼成熟的IGF-1肽鏈段，而翻譯終止碼包含在外顯子5、6內(nèi)[7]。

IGF-1具有廣泛的中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用并維持大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[8-10]，它能阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡[11，12]、促進(jìn)神經(jīng)元血管再生及重塑、減少缺血缺氧對神經(jīng)元的損害、促進(jìn)神經(jīng)髓鞘合成及存活[13]。國外大量研究表明，IGF-1能干預(yù)AD病情進(jìn)展，維持認(rèn)知功能[14]。AD的特征性病理改變包括Aβ蛋白沉積及磷酸化tau蛋白形成，IGF-1可通過胰島素降解酶（IDE）的競爭性抑制作用間接或直接調(diào)節(jié)大腦中Aβ蛋白的水平，從而對抗Aβ蛋白毒性[15]。IGF-1/胰島素信號通路可負(fù)反饋調(diào)節(jié)糖原合成激酶-3β（GSK-3β）/磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-p70 S6K通路，減少tau蛋白磷酸化、增加其與微管結(jié)合[16]。Schubert和Carro等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)[17，18]，損壞老鼠大腦中該信號通路可致過度磷酸化tau（Hpf-tau）蛋白形成，伴隨認(rèn)知功能障礙。此外，IGF-1對AD的影響還包括能提高海馬的神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元興奮性、維持突觸可塑性[19]、保護(hù)中樞膽堿能系統(tǒng)[20，21]，因此，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中IGF-1濃度下降或基因功能異常與AD發(fā)病、病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

本研究顯示，IGF-1 rs972936的AA、AG、GG三種基因型在AD組及對照組的頻率分布顯示：12.94%、38.23%、48.82%；38.78%、40.82%、20.41%。A、G等位基因在AD組、對照組的頻率分布顯示：32.06%，67.94%；59.18%，40.82%，χ2檢驗(yàn)顯示基因型、等位基因在兩組間的分布均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AD組與對照組相比，GG基因型、G等位基因分布頻率顯著增高，AA基因型、A等位基因分步頻率則顯著低于對照組。進(jìn)一步推論，GG基因型、G等位基因?yàn)橹翧D發(fā)病的危險(xiǎn)因素，即攜帶GG基因型、G等位基因人群的AD患病風(fēng)險(xiǎn)顯著增高；而攜帶AA基因型和A等位基因人群的AD患病風(fēng)險(xiǎn)則顯著降低，為AD發(fā)病的保護(hù)因素。

基因多態(tài)性產(chǎn)生的原因?yàn)閱魏塑账嶙儺?，其本質(zhì)是DNA核苷酸排列順序的差異。基因突變發(fā)生于外顯子、啟動(dòng)子、編碼區(qū)內(nèi)，則可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生錯(cuò)誤的mRNA片段、或影響轉(zhuǎn)錄速度，改變蛋白質(zhì)活性或合成沒有活性的蛋白質(zhì)?；蚍蔷幋a區(qū)的突變對基因功能無明顯改變。

IGF-1 rs972936位點(diǎn)位于基因內(nèi)含子區(qū)域，主要調(diào)節(jié)基因剪接點(diǎn)部位的活性。Teo Vargas[22]等證實(shí)了IGF-1 rs972936基因多態(tài)性與外周血循環(huán)中的IGF-1濃度相關(guān)，AD組高于正常對照組，其中攜帶GG基因型及G等位基因AD患者血清的IGF-1濃度高于AG、AA基因型及攜帶A等位基因的患者（[GG]（143.9± 8.6）ng/m L vs[GA]（115.2±9.2）ng/m L P=0.027，[AA]（95.8± 14.6）ng/mL，P=0.015）。隨年齡增長，血腦屏障及IGF-1信號通路功能下降[23，24]，大腦血管、脈絡(luò)叢的功能受到干擾，致IGF-1敏感性降低[25]，表現(xiàn)為外周循環(huán)的IGF-1濃度代償性增高而中樞濃度下降（即IGF-1抵抗），最終導(dǎo)致大腦中Aβ蛋白清除減少、過度磷酸化tau蛋白形成，最終誘發(fā)AD。因此，推測IGF-1 rs972936位點(diǎn)的基因多態(tài)性可能通過以下途徑影響AD的發(fā)?。篏G基因型、G等位基因能干擾正?；蚬δ埽⑼ㄟ^改變基因剪接位點(diǎn)的活性，致IGF-1信號通路受損，從而產(chǎn)生IGF-1抵抗、IGF-1敏感性降低，導(dǎo)致中樞IGF-1濃度下降而外周循環(huán)代償性增高；信號通路受損后，GSK-3β通路所受的負(fù)反饋抑制作用降低，磷酸化tau蛋白增多，中樞的Aβ蛋白清除減少、沉積增多，誘發(fā)AD。除此之外，外周循環(huán)中的IGF-1透過血腦屏障需借助于IGF載體蛋白（IGFBPS），并同時(shí)結(jié)合IGF-1R才能作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因而不能排除IGF-1 rs972936位點(diǎn)多態(tài)性對IGFBPS、IGF-1R產(chǎn)生的干擾作用，阻礙IGF-1透過血腦屏障，致使其中樞神經(jīng)系統(tǒng)濃度降低。本實(shí)驗(yàn)由于條件限制，未能進(jìn)一步測定AD患者和正常對照組外周循環(huán)中的IGF-1濃度，因此，以上作用機(jī)制的推論僅為猜測，關(guān)于IGF-1 rs972936位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性究竟如何改變AD的易感性，仍有待深入研究與探討。

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Correlation analysis on insulin-like grow th factor-1 rs972936 single nueleotide polymorphism among Chinese Han population in Hu’nan w ith Alzheimer's disease

CHEN Liying1DU Xiaoping2
1.Department of Neurology,Changsha Fourth Hospital,Changsha 410006,China;2.Department of Neurology,Central South University Xiangya Hospital,Changsha 410008,China

ObjectiveTo investigate the relation between IGF-1 rs972936 single nueleotide polymorphism in some Chinese Han population and Alzheimer's disease.M ethods170 AD patients of Chinese Han population in Hunan and 147 healthy volunteerswith matched genders and ageswere sleeved during April 2009 and December 2011.The genotype and allele of IGF-1 rs972936 were detected and analyzed by PCR-RFLP.ResultsThe distribution frequencies of IGF-1 rs972936 GG,AG,and AA were 48.82%,38.23%,and 12.94%in the AD group,and 20.41%,40.82%,and 38.78%in the control group.The distribution frequencies of alleles G and A were 67.94%and 32.06%in the AD group,and 40.82%and 59.18%in the control group.The above differences in distribution frequencieswere all statistically significant(P＜0.05).ConclusionGenotype of GG and allele G of IGF-1 rs972936 are probably risk factors of AD in Chinese Han population in Hunan.

Alzheimer's disease;Insulin-like growth factor-1;Single nueleotide polymorphism;Gene

R346

A

1673-9701（2015）36-0017-04

2015-10-15）

▲通訊作者