水通道蛋白分子成像研究

林艷紅，孫夕林，程雁，吳泳儀，申寶忠

水孔通道蛋白（aquaporin，AQPs）又稱水通道蛋白，是一組高度保守的跨膜轉運蛋白，以四聚體的形式富集于細胞膜，對水具有高度選擇通透性。水通道蛋白由Peter Agre在1993年首先發(fā)現(xiàn)，其功能的發(fā)現(xiàn)徹底改變了傳統(tǒng)的關于水分子在細胞膜上自由擴散的理念[1，2]。目前，哺乳動物體內至少發(fā)現(xiàn)13種高度同源的水通道蛋白亞型（AQP0-AQP12），其中，水甘油通道蛋白（AQP3，7，9，10）除可以轉運水分子外也可轉運某些小的中性溶質分子如甘油、尿素等。研究證實水通道蛋白廣泛分于全身各組織器官，介導著不同類型細胞膜上水和小分子物質的跨膜轉運，對維持體內滲透壓及內穩(wěn)態(tài)的平衡具有十分重要的生理意義。近年來，隨著對AQPs研究的不斷深入，在某些病理情況下，如心血管系統(tǒng)疾病、神經系統(tǒng)退行性疾病、腫瘤的血管生成和細胞遷移等，AQPs分布和表達也發(fā)生了改變[3]。因此，水通道蛋白已經成為許多疾病重要的治療靶點，對其功能的調控具有十分重要的治療意義。目前，亟需研發(fā)一種在體、實時、定量的AQPs檢測方法，快速準確的檢測出活體組織細胞中AQPs的表達及分布。分子成像可在活體狀態(tài)下實現(xiàn)細胞和分子水平生物學過程的可視化，并可進行定性和定量分析，將復雜的生物過程轉換成直觀圖像，實現(xiàn)關鍵分子靶點的在體、實時動態(tài)成像，有助于推動AQPs基礎研究向臨床應用的轉化。

分子影像學在AQPs檢測中的應用

近年來，隨著分子生物學和分子醫(yī)學的發(fā)展，疾病的研究進入到分子時代，分子影像學應運而生。分子影像學是指在活體狀態(tài)下，在細胞和分子水平上應用影像學方法對人或動物體內的生物學過程進行成像，進而開展定性和定量研究的一門學科，具有無創(chuàng)、活體、實時動態(tài)、高特異性、高靈敏度等優(yōu)點[4]。研究表明分子影像已成功實現(xiàn)EGFR、VEGFR、HIF-1α、OSP-1等腫瘤關鍵分子靶點的在體、實時動態(tài)可視化及精確定量分析[5-8]。目前，主要分子成像方法包括MRI分子成像、光學分子成像、超聲分子成像以及核醫(yī)學等成像方法。其中，MRI、PET成像技術對于AQPs成像具有廣闊的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

1.MRI-DWI在AQPs分子成像中應用

擴散加權成像（diffusion-weighted imaging，DWI）通過檢測人體組織中水分子擴散運動受限的方向和程度，間接反映組織微觀結構的變化，是從細胞及分子水平研究疾病病理生理狀態(tài)的一種技術，已廣泛應用于臨床。

傳統(tǒng)DWI成像原理：布朗運動即組織中水分子的不規(guī)則隨機運動，是DWI的成像基礎。純水中的水分子擴散運動充分自由，而在活體組織中，生物膜及液體中的大分子將限制水分子的自由運動，當水分子所處組織結構和分子環(huán)境不同時，水分子擴散程度及信號衰減也不同，DWI則通過檢測組織內水分子的擴散狀態(tài)來反映組織結構的特點以及發(fā)現(xiàn)病變[9]。

一般來說，DWI對組織及細胞內水分子擴散運動的敏感程度用b值表示，b值為擴散敏感度，其反映施加的梯度脈沖強度和持續(xù)時間，b值越高，對水分子擴散運動越敏感，組織信號衰減越明顯。常規(guī)的擴散加權成像假設人體組織是單一均勻物質，水分子隨機運動造成的組織擴散加權信號的衰減程度隨著b值的增加呈單指數(shù)衰減。然而，活體組織中水分子的擴散運動既有細胞內、外和跨細胞運動，同時也存微循環(huán)（灌注），在毛細血管中，水分子除了做布朗運動外，還隨著血液流動，其內的水分子運動與毛細血管網(wǎng)的結構及血流速度密切相關。因此，在實際情況下單指數(shù)模型的假設無法反映真實的組織成分和結構變化。隨著生物組織擴散研究的不斷優(yōu)化，Le Bihan等[10]在1986年首次提出了基于IVIM雙指數(shù)模型。該模型同時考慮到體素內存在的分子擴散和血液微循環(huán)，認為組織擴散由兩部分組成，即快速擴散質子池（細胞外擴散、血管內水分子、灌注）和慢速擴散質子池（細胞內擴散、血管外水分子），通過采集多個b值將水分子擴散與血液灌注分離，相對單指數(shù)模型而言可更好地反映生物組織DWI信息。

AQPs的發(fā)現(xiàn)——傳統(tǒng)水單純擴散理念的更新：傳統(tǒng)的擴散加權成像無論是單指數(shù)模型還是雙指數(shù)模型，均認為水分子的跨膜轉運是通過自由擴散進行的。直至1993年，Agre發(fā)現(xiàn)水通道蛋白，提出水分子的跨膜轉運除了自由擴散外，還可以通過水通道蛋白進行。而且進一步研究也驗證了AQP的存在并明確了水分子在組織間自由擴散速度為（1～2）×10-3mm2／s，在AQP跨膜主動轉運過程中擴散速度為0.45×10-3mm2／s。由此可見，水分子在細胞膜上通過AQPs的轉運速度明顯低于其細胞間隙自由擴散速度。因此，鑒于水分子跨膜轉運的實際運動情況，要利用影像技術獲得經AQPs轉運水分子的擴散信息，更為可靠的方法是在雙指數(shù)模型的基礎上，引入更多、更高b值來提高對細胞膜上由AQPs轉運導致擴散運動極度受限水分子的檢測能力。eDWI分子成像即多b值多維度分析的增強版擴散成像（enhance DWI，eDWI），在擴散加權成像過程中通過采用連續(xù)、多個不同梯度的b值（包括低b值b＜200s／mm2、中b值300～1700s／mm2及高b值b＞1700s／mm2），獲得反映水分子在組織細胞中不同擴散運動的分子譜。更為有趣的是水分子轉運速率單位（mm2／s）與b值單位（s／mm2）呈倒數(shù)關系，將水分子經由AQPs轉運的速度值0.45×10-3mm2／s取倒數(shù)后（約為2222），恰好符合eDWI高b值范圍（＞1700）。因此，近年來研究認為b值越高，eDWI成像檢測的對象越接近AQPs內轉運的水分子，而高b值條件下的eDWI就能夠利用這一原理特異性的對細胞膜上的AQPs的表達情況進行定量評價[11，12]。

AQPs的eDWI分子成像：李佳慧等[13]采用18個（0～4500）b值，選擇水、對比劑、全血、血漿和紅細胞等不同組織，并用乙酰唑胺作為紅細胞膜水通道蛋白抑制劑進行DWI多b值分子成像。實驗結果表明，低b值（0～200）時能夠區(qū)分不同組織，具有較高的組織特異性；高b值（＞1700）時純水和血漿信號基本可以忽略，獲得的水分子擴散的信息主要來自于經水通道蛋白的轉運，從而獲得AQPs在細胞膜表達及分布信息。在此基礎之上，李秋菊等[14]進行大鼠肝臟纖維化模型中AQPs的DWI多b值分子成像，研究表明與傳統(tǒng)DWI相比，高b值可以檢測早期肝臟纖維化中的變化。肝臟纖維化早期AQP1呈明顯高表達，加入抑制劑乙酰唑胺后，高b值下AQP1的表達與表觀擴散系數(shù)呈明顯的相關性，為肝臟纖維化診斷及分期提供了新的途徑。

2.PET在AQPs分子成像中的應用

正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography，PET），可在分子水平上洞察人體功能代謝、基因及蛋白表達狀態(tài)，并進行定量，是目前分子影像最主要的成像方法之一[15]。PET分子成像的關鍵是能夠特異性識別分子靶點的靶向分子成像探針的構建，分子成像探針的設計通常是通過修飾和標記靶點的特異性配體、抑制劑、拮抗劑、激動劑、底物以及酶類。

放射性核素標記AQPs特異性結合配體的分子成像：關于水通道蛋白，分子成像探針的設計構建之一就是用放射性核素標記的水分子以及甘油（水甘油通道蛋白），然而，由于水對于AQPs亞型并沒有特異性，使其較難廣泛應用于PET研究。目前，研究表明通過放射性核素標記甘油可以用來構建水甘油通道的分子成像探針。Yuriko Saito等[16]用14C-甘油作為分子成像探針并分別在agAQPs不同表達水平的腫瘤細胞及相應鼠移植瘤模型中進行該探針的放射性分布研究。細胞水平研究表明agAQPs的表達水平與14C-甘油的攝取呈正相關，與agAQPs低表達的腫瘤細胞相比，agAQPs過表達腫瘤細胞對甘油的攝取量明顯增加，加入特異性抑制劑后，甘油的攝取以劑量依賴的方式降低；與離體實驗結果相反，荷瘤鼠的在體研究結果表明不同agAQPs表達水平的腫瘤中14C-甘油的攝取并沒有顯著不同，但值得注意的是agAQPs高表達腫瘤中放射性活性與血漿相似，均以時間依賴的方式進行衰減，而agAQPs低表達腫瘤的放射性則保持恒定。研究表明14C-甘油構建的分子成像探針可以用來評估agAQPs的表達水平，對于特異性靶向agAQPs的分子成像有潛在應用價值。

放射性核素標記AQPs特異性抑制劑的分子成像：另外一種AQPs分子探針的設計方案為利用放射性核素標記其小分子特異性抑制劑。Yukihiro等[17]利用放射性核素11C標記AQP4的特異性抑制劑TGN-020，合成了靶向AQP4的分子成像探針[11C]TGN-020，利用該探針分別對AQP4野生型和AQP4空白鼠進行PET成像，實驗結果顯示與空白組小鼠相比，野生型小鼠對該探針呈明顯的整體的高攝取，與以前報道的AQP4在肌肉和骨骼肌中選擇性分布相一致；另外，兩組老鼠的心臟對[11C]TGN-020均呈明顯高攝取，這可能是由于[11C]TGN-020對AQP1也有一定的親和力，文獻報道AQP1與AQP4有大約60%的同源性（圖1）。同時，該研究小組對[11C]TGN-020在腦組織中的攝取情況進行了離體驗證，將小鼠殺死后取腦組織再次進行PET成像，WT組小鼠的腦組織對[11C]TGN-020有明顯的高攝取，KO組小鼠的腦組織呈較低攝?。▓D2）。

隨后，該研究小組首次進行了[11C]TGN-020在健康人體的PET成像研究[18]，圖像后處理后得到顯示顱內放射性配體分布的圖像，圖像顯示在軟腦膜及血管周圍的星形膠質終足細胞以及脈絡叢部位有明顯的[11C]TGN-020濃聚，這與已經報道的AQP4在顱內的分布一致（圖3）。

以上研究結果表明，[11C]TGN-020可以特異性的與AQP4靶向結合，是放射性標記AQPs特異性抑制劑的首次應用，為AQPs的在體分子成像研究奠定了基礎。雖然TGN-020對AQP1一定的親和力，但考慮到AQP4在腦部的分布特異性，其仍可以作為AQP4PET成像的特異性探針，提供AQP4表達及分布的定量數(shù)據(jù)，并對某些與AQP4相關疾病的嚴重程度進行分析。

AQPs分子成像面臨的挑戰(zhàn)與展望

在AQPs離體研究的基礎上，利用分子影像技術可在體揭示AQPs在疾病發(fā)生過程中的表達與分布變化并進行定量分析，同時，由于AQPs特殊的結構與功能作用方式，使AQPs的分子成像希望與挑戰(zhàn)并存。

1.eDWI開啟AQPs分子成像全新途徑及面臨的挑戰(zhàn)

圖1 [11 C]TGN-020鼠在體PET成像。a）AQP4WT鼠；b）AQP4KO鼠[17]。

圖2 [11 C]TGN-020離體鼠腦組織的PET成像。a）WT鼠；b）KO鼠[17]。

圖3 [11 C]TGN-020健康人腦組織在體PET成像[18]。

研究表明eDWI多b值擴散加權成像可以在體、實時、動態(tài)的進行AQPs分子成像，有利于推動AQPs基礎研究向臨床應用的轉化，開啟了AQPs分子成像的全新途徑，具有廣闊的發(fā)展前景。但目前關于AQPs eDWI分子成像研究仍相對較少，且多處于離體水平，需要進一步開展更多的在體及相關臨床應用研究；同時，要實現(xiàn)AQPs的精確定量仍存在一些挑戰(zhàn)，如隨著b值的增高，DWI圖像信噪比降低、易發(fā)生變形和失真，同時，由于連續(xù)多b值掃描，獲得圖像數(shù)據(jù)量大，數(shù)據(jù)后處理復雜等[12]。針對以上挑戰(zhàn)，可從以下幾個方面提高MR設備性能及掃描技術，如增加磁場的均勻性、空間線性和保真度，配置更高密度的靶線圈及增大掃描視野等，此外，高性能的專用圖像后處理系統(tǒng)及質量控制軟件也是實現(xiàn)AQPs精確定量分析的重要基礎工具。

2.靶向分子成像探針的構建是實現(xiàn)AQPs分子成像的關鍵

AQPs特異性抑制劑的研發(fā)是構建高親和性、高靶向性分子成像探針的重要前提，由于小分子特異性抑制劑篩選方法的不足以及AQPs亞型之間的高度同源性，AQPs特異性抑制劑仍處于研究階段。目前，AQPs的抑制劑主要包括離子類抑制劑、小分子有機化合物類抑制劑以及多肽類抑制劑。離子類抑制劑[19-21]，如Hg＋、Ag＋、Au3＋等金屬離子以及四乙胺等非金屬離子，可與胞外段特定的結構域相互作用，形成空間位阻，封閉水孔通道。但該類抑制劑的亞型特異性較小且具有一定的毒性，一定程度上限制其臨床應用。近年來，乙酰唑胺、布美他尼及其衍生物（AqB013）、TGN-020（2-甲酰氨基-1，3，4-噻二唑）等小分子類抑制劑的研究越來越受到研究者的重視，是目前研究較為廣泛的一類AQPs抑制劑。研究表明乙酰唑胺[22，23]是最早提出來的AQPs抑制劑，盡管對其抑制作用仍存在爭議，但目前研究學者認為其主要抑制AQP1的活性，且已有研究進行了11C標記甲基乙酰唑胺的初步合成。TGN-020[17，18，24]在體外和體內試驗中均可以明顯抑制AQP4的轉運活性，并成功進行了放射性標記其類似物的PET成像。布美他尼及其衍生物（AqB013）等[25]袢利尿劑具有AQP1和AQP4抑制活性，其中，AqB013對AQPs的抑制作用更加明顯，有望成為AQPs選擇性抑制劑化學合成基礎。多肽類抑制劑被認為是特異性最高的一類抑制劑[26，27]。研究發(fā)現(xiàn)單克隆抗體aquaporumab可以與AQP4-IgG自身抗體競爭特異性結合AQP4，抑制AQP4介導的水分子轉運。隨著AQPs抑制劑作用機制及AQPs分子結構研究的不斷深入，以高親和性、高靶向性抑制劑為前體構建的分子成像探針有望實現(xiàn)AQPs的分子成像。

3.多模態(tài)成像體系引領AQPs分子成像未來發(fā)展趨勢

近年來，隨著分子影像技術的迅速發(fā)展，研究者們嘗試將PET與常規(guī)的影像學技術相結合，如PET／CT、PET／MR，逐步形成了多模態(tài)成像體系，一次成像可同時得到感興趣區(qū)生理功能信息及解剖結構信息是分子影像學近年來最大的進步，同時也代表了分子影像學的發(fā)展方向。目前，PET／CT已廣泛應用于臨床，并取得較大的臨床效果；與此同時，PET／MR也逐步完成向臨床應用轉化[28]。與PET／CT相比，PET／MR避免了CT帶來的放射性損傷，并提高了軟組織分辨率。值得注意的是，PET／MR可實現(xiàn)PET提供的定量信息與MR特有的功能性磁共振成像（fMRI）序列，如eDWI、DCE和MRS等特定功能序列同步采集，即一次掃描可同時獲得反應組織代謝的PET信息和反應組織解剖結構與功能的MR信息，保證了感興趣區(qū)時間和空間位移上的一致性，將兩種信息同步融合后分析，可進行精確定量，實現(xiàn)了真正意義上的優(yōu)勢互補。研究表明利用PET／MR同步采集特性，可進行一定腦功能的實時監(jiān)測研究[29]。針對AQPs水分子轉運功能的實時性與動態(tài)性，通過PET／MR可實現(xiàn)其在體、實時動態(tài)、精確定量成像，在多角度、多維度及多層次精細反映AQPs分布及表達狀態(tài)，實現(xiàn)了APQs真正意義上的結構、功能與分子一體化成像，為AQPs的分子成像開辟了一條全新的途徑，同時，多模態(tài)分子成像體系也是未來AQPs分子影像研究的發(fā)展趨勢。

綜上所述，AQPs是許多疾病發(fā)生發(fā)展進程中的關鍵分子靶點，分子影像學是多學科交叉領域。隨著AQPs特異性抑制劑以及影像設備的不斷發(fā)展，分子成像技術可實現(xiàn)對AQPs表達水平及分布狀態(tài)在體、實時、動態(tài)成像，為臨床篩選分子靶向治療優(yōu)勢人群、療效檢測提供可靠依據(jù)，使AQPs分子成像的臨床轉化成為可能。

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