銅綠假單胞菌毒性蛋白ExoU的研究進(jìn)展

鞠曉紅，李正花，馬愛(ài)新，李 瑤

銅綠假單胞菌毒性蛋白ExoU的研究進(jìn)展

鞠曉紅1，李正花2，馬愛(ài)新1，李 瑤1

銅綠假單胞菌是一種重要的條件致病菌，有多種毒力因子，其中Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)在其引起的急性感染中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，是銅綠假單胞菌感染、致病的重要因素。T3SS主要通過(guò)靶向輸送4種效應(yīng)蛋白(ExoS、ExoT、ExoU和ExoY)對(duì)宿主細(xì)胞發(fā)揮毒性作用。其中ExoU是最具破壞性的蛋白，與感染的發(fā)生、預(yù)后及治療密切相關(guān)。本文主要將近年來(lái)與毒性蛋白ExoU有關(guān)的研究進(jìn)展做一簡(jiǎn)要綜述，旨在為銅綠假單胞菌感染的控制及治療提供參考。

銅綠假單胞菌；Ⅲ型分泌系統(tǒng)；ExoU；多重耐藥；毒力基因

銅綠假單胞菌廣泛分布于自然界及人和動(dòng)物機(jī)體皮膚、呼吸道及腸道中，是一種常見(jiàn)的條件致病菌。在機(jī)械性氣道損傷、免疫抑制或患有艾滋病、腫瘤的患者常引起急性肺炎，尤其肺纖維化患者更易引起致死性感染[1]。目前已知銅綠假單胞菌成功感染宿主細(xì)胞并導(dǎo)致疾病的主要原因是Ⅲ型分泌系統(tǒng)(typeⅢsecretion system,TTSS)的作用，通過(guò)T3SS將毒性蛋白ExoS、ExoT、ExoU和ExoY直接注入宿主細(xì)胞，引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞壞死，有利于細(xì)菌的入侵和擴(kuò)散并逃避宿主吞噬細(xì)胞的吞噬或降解[2,3]。4種蛋白中，ExoU是主要毒性蛋白，ExoU陽(yáng)性菌株在體內(nèi)外均可引起細(xì)胞壞死、死亡，直接關(guān)系到感染患者的病情進(jìn)展及預(yù)后，在致病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4-5]。因此，深入探討毒性蛋白ExoU在感染中的作用及機(jī)制，成為研發(fā)新藥靶標(biāo)、有效預(yù)防和治療銅綠假單胞菌感染的迫切需要。

1 ExoU蛋白的基因控制

ExoU蛋白的表達(dá)和分泌由銅綠假單胞菌T3SS的毒力基因?qū)xoU/spcU決定。spcU基因編碼ExoU蛋白的分子伴侶SpcU(一種小分子酸性蛋白)，常與ExoU以1∶1的比例在菌細(xì)胞內(nèi)特異性結(jié)合，阻止蛋白不恰當(dāng)聚合或分泌、提高分泌前及分泌時(shí)的穩(wěn)定性，但本身不向菌細(xì)胞外分泌。銅綠假單胞菌T3SS涉及的相關(guān)基因有43個(gè)，其中exoU/spcU位于染色體上與轉(zhuǎn)位、分泌和調(diào)節(jié)相關(guān)基因不同的基因島(genomic island)上。Kulasekara BR等[6]對(duì)來(lái)自美國(guó)不同醫(yī)院的6株銅綠假單胞菌利用酵母重組克隆技術(shù)進(jìn)行exoU/spcU基因島檢測(cè)，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)3個(gè)ExoU基因島(分別命名為A島、B島和C島)，均插入在tRNALys基因中，占據(jù)兩個(gè)開(kāi)放讀碼框架(ORF)。A島長(zhǎng)度為81.17 kb，包含77個(gè)ORF，GC平均含量57.0%，明顯低于核基因組的66.7%，exoU/spcU位于第76和77 兩個(gè)ORF；B島長(zhǎng)度為29.85 kb，包含41個(gè)ORF，GC平均含量56.8%，exoU/spcU位于第26和27 兩個(gè)ORF；C島長(zhǎng)度為3.89 kb，包含3個(gè)ORF，exoU/spcU位于第2和第3個(gè)ORF，與A島極其相似，起始部位的256 bp 85.2%與A島相同，3個(gè)基因島兩端的正向重復(fù)序列完全一致。進(jìn)一步將A島的基因序列與質(zhì)粒pKLC102上的exoU基因序列比較，發(fā)現(xiàn)二者高度同源。 pKLC102整合酶基因93%與A島相同，使其有能力插入到染色體tRNALys基因位點(diǎn)兩側(cè)，據(jù)此推斷銅綠假單胞菌的ExoU基因島可能來(lái)源于與pKLC102質(zhì)粒親緣關(guān)系密切的帶有插入序列和轉(zhuǎn)座子的整合型質(zhì)粒。推測(cè)最初銅綠假單胞菌可能通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移獲得攜帶有exoU/spcU基因的祖先質(zhì)粒(ancestral plasmid)，隨后發(fā)生染色體整合，在整合過(guò)程中維持質(zhì)粒獨(dú)立存在和轉(zhuǎn)移的部分必須基因被刪除或缺失，最終導(dǎo)致整合的外源基因以基因島的形式穩(wěn)定存在于染色體基因組中，exoU/spcU基因轉(zhuǎn)移罕見(jiàn)。不同銅綠假單胞菌ExoU基因島中許多保守片段也有較大變化，但全部保留有完整的exoU/spcU基因?qū)?，由此認(rèn)為選擇分泌功能性ExoU蛋白可能是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境壓力的進(jìn)化結(jié)果。

一般認(rèn)為，在T3SS 4種毒素蛋白的結(jié)構(gòu)基因exoS、exoT、exoU和exoY中，同一株銅綠假單胞菌不能同時(shí)攜帶exoS和exoU基因，二者互為排斥[7-8]。由于exoS基因缺乏基因島的典型特征，目前認(rèn)為exoS與基因島無(wú)關(guān)，因此推測(cè)exoU與exoS基因相互排斥不可能是質(zhì)粒不相容的結(jié)果，exoS基因可能在exoU/spcU基因整合進(jìn)細(xì)菌染色體之前已經(jīng)被菌體獲得，由于遺傳因素將隨后進(jìn)入菌體的ExoU基因島刪除[6]。也有人認(rèn)為可能是二者占據(jù)相同的基因位點(diǎn)因而互相排斥[9]。但最近幾年國(guó)內(nèi)外的多項(xiàng)研究均顯示在同一株銅綠假單胞菌中可以同時(shí)檢測(cè)到exoS和exoU基因[10-12]，具體機(jī)制不明，是否意味著細(xì)菌在環(huán)境壓力下發(fā)生基因位點(diǎn)改變、抑或毒力增強(qiáng)的結(jié)果？今后仍需進(jìn)一步加強(qiáng)研究工作。

2 ExoU蛋白結(jié)構(gòu)

ExoU是由687個(gè)氨基酸殘基組成、分子量74 kD的水溶性蛋白質(zhì)，以往研究認(rèn)為ExoU由3個(gè)結(jié)構(gòu)域(domain)組成，從N端到C端分別是分子伴侶結(jié)構(gòu)域、磷脂酶A2(PLA2)結(jié)構(gòu)域和膜定位結(jié)構(gòu)域[13]。Claire G等[14]根據(jù)功能進(jìn)一步將分子伴侶結(jié)構(gòu)域劃分為兩個(gè)子域(subdomain)，是序列上不連續(xù)而空間構(gòu)象相鄰的兩部分。Halavaty AS等[15]研究認(rèn)為，ExoU實(shí)際折疊成4個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖1[15])，結(jié)構(gòu)域內(nèi)部存在多個(gè)無(wú)序區(qū)域(圖中Ⅰ～Ⅷ表示)，其中PLA2活性結(jié)構(gòu)域無(wú)序基序最多，推測(cè)可能是細(xì)菌控制正確發(fā)揮PLA2活性的一種生理機(jī)制。ExoU分泌后在輔助活化因子作用下，無(wú)序基序轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄越Y(jié)構(gòu)，發(fā)揮PLA2的細(xì)胞毒活性?？臻g構(gòu)象上分子伴侶SpcU與其中的3個(gè)功能區(qū)相接觸。

結(jié)構(gòu)域1是分子伴侶SpcU結(jié)合區(qū)(SpcU-BD)，由不連續(xù)的兩部分組成，靠近N端的55-101位氨基酸和C端的472-502位氨基酸區(qū)域，其中65-101位氨基酸殘基折疊成1個(gè)α螺旋和4個(gè)β片層結(jié)構(gòu)，是與分子伴侶相結(jié)合的最主要部位；472-502位氨基酸殘基折疊成1個(gè)β片層和4個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，沒(méi)有結(jié)合SpcU的能力，推測(cè)可能作為一個(gè)獨(dú)特的“平臺(tái)”結(jié)構(gòu)，其功能是執(zhí)行兩個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域(PLA2域和膜定位域)的橋聯(lián)。

結(jié)構(gòu)域2是PLA2活性區(qū)(PLA2-D)，以往研究認(rèn)為這一區(qū)域位于107-357位氨基酸之間，而Halavaty AS等[15]通過(guò)純化的ExoU晶體結(jié)構(gòu)研究認(rèn)為，這一區(qū)域可能實(shí)際開(kāi)始于102位氨基酸，延伸至471位氨基酸，357位異亮氨基酸之后的基序可能有助于反平行β片層結(jié)構(gòu)形成，以利于與膜定位區(qū)和SpcU結(jié)合。PLA2酶催化區(qū)與其他已知的磷脂酶具有很低的序列同源性，但核心β片層與人類胞漿型PLA2(c PLA2)和植物patain樣PLA2結(jié)構(gòu)高度相似[16-17]。PLA2活性和細(xì)胞毒性高度依賴Ser142、氧陰離子洞(Oxyanion hole)及Gly286，三者空間構(gòu)象相鄰。Ser142和Asp344構(gòu)成ExoU蛋白的催化二分體(catalytic dyad)，任何一個(gè)位點(diǎn)被替換或變異都會(huì)使PLA2活性喪失。Ser142位于漏斗樣結(jié)構(gòu)中心，周圍包繞許多柔韌的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，3個(gè)甘氨酸(Gly111,112,113)在相鄰位置構(gòu)成氧陰離子洞作為支撐骨架，維持磷脂酶反應(yīng)中間過(guò)渡狀態(tài)的電荷穩(wěn)定；酶催化位點(diǎn)Asp344位于無(wú)序區(qū)Ⅲ。Lys178是ExoU進(jìn)入宿主細(xì)胞后的泛素化位點(diǎn)。一旦ExoU在細(xì)胞膜上定位，Lys178即成為泛素化的目標(biāo)。Lys178靠近酶活性中心，位于具有高度柔韌性的區(qū)域，側(cè)鏈距離Ser142約7埃。然而泛素化的結(jié)果不是導(dǎo)致ExoU蛋白降解，而是使ExoU蛋白活化的關(guān)鍵步驟，詳細(xì)機(jī)制尚未闡明，推測(cè)可能是泛素修飾后引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)重排的結(jié)果[18]。

503-603位氨基酸殘基和604-687位氨基酸殘基分別構(gòu)成了ExoU的第3個(gè)和第4個(gè)結(jié)構(gòu)域，主要發(fā)揮膜定位功能，使效應(yīng)蛋白靶向進(jìn)入宿主細(xì)胞膜的區(qū)域。結(jié)構(gòu)域3形成左手螺旋，而結(jié)構(gòu)域4形成的螺旋束同時(shí)與分子伴侶和PLA2區(qū)域相連。679-683位氨基酸變異菌株不能與細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PI(4,5)P2)結(jié)合，提示ExoU的細(xì)胞膜靶位點(diǎn)是PI(4,5)P2，而發(fā)揮膜定位的關(guān)鍵基序是679-683位氨基酸殘基[14]。不過(guò)，多數(shù)研究認(rèn)為膜定位區(qū)位于550-687氨基酸之間，屬于1個(gè)獨(dú)立功能區(qū)[19-20]。至于ExoU的功能區(qū)到底如何劃分更為合理，有待于對(duì)ExoU作用機(jī)制的更深入研究。

圖1 銅綠假單胞菌ExoU蛋白結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of ExoU of Pseudomonas aeruginosa

3 ExoU蛋白的生物學(xué)活性及調(diào)控

ExoU是具有強(qiáng)大細(xì)胞毒性的磷脂酶A家族成員，主要表現(xiàn)為PLA2活性，屬于鈣非依賴性磷脂酶，又稱含patatin磷脂酶結(jié)構(gòu)域酯酶，是一種天然表面活性劑，未被T3SS分泌時(shí)，與分子伴侶SpcU以1:1比例結(jié)合成無(wú)活性復(fù)合物。分泌后選擇性與真核細(xì)胞膜上的PI(4,5)P2結(jié)合，在輔助因子的協(xié)同作用下ExoU蛋白被激活，刺激宿主細(xì)胞釋放大量花生四烯酸進(jìn)而生成生物活性介質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞變圓、皺縮，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞骨架崩潰、裂解死亡，細(xì)胞死亡的主要原因是壞死[19,21-22]。在Hela細(xì)胞感染模型中，培養(yǎng)液中預(yù)先加入PI(4,5)P2可明顯增強(qiáng)ExoU的細(xì)胞毒性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PI(4,5)P2不是通過(guò)增加細(xì)菌數(shù)量而是通過(guò)增強(qiáng)效應(yīng)發(fā)揮細(xì)胞毒作用[14]。在鼠肺炎模型中，活化的ExoU能引起巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞急性細(xì)胞毒反應(yīng)；在人類嚴(yán)重的銅綠假單胞菌感染病例，ExoU能特異性殺傷中性粒細(xì)胞，降低患者免疫防御能力，使患者更易發(fā)生二重感染[23]。除了主要的細(xì)胞毒活性外，在上皮細(xì)胞ExoU還能激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和AP-1介導(dǎo)的促炎基因表達(dá)[24]，激活NK-κB信號(hào)通路，刺激IL-8基因表達(dá)及IL-8分泌[25]。

同ExoS、ExoT和ExoY相似，ExoU發(fā)揮細(xì)胞毒活性需要真核細(xì)胞提供輔助因子的協(xié)同刺激，這是細(xì)菌的一種重要自我保護(hù)機(jī)制，因?yàn)镋xoU完全有能力水解細(xì)菌自身細(xì)胞膜，這種細(xì)胞輔助因子的真核細(xì)胞特異性使銅綠假單胞菌能選擇性的破壞宿主細(xì)胞而不影響細(xì)菌的自身安全及產(chǎn)毒。在體外，將純化的重組ExoU(rExoU)與脂質(zhì)體共培養(yǎng)檢測(cè)不到PLA2活性，而與酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞提取液共培養(yǎng)即可檢測(cè)到PLA2活性，經(jīng)蛋白酶或加熱處理細(xì)胞提取液后PLA2活性顯著降低，提示在真核細(xì)胞中存在蛋白類輔助因子。目前認(rèn)為真核細(xì)胞泛素、泛素化蛋白及Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)可能是這種毒素的重要活化因子[26,27]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[26,28]，SOD1經(jīng)處理消除酶活性(如去除金屬離子)后依然能夠活化ExoU，說(shuō)明輔助因子SOD1可能不是通過(guò)酶活性，而是通過(guò)誘導(dǎo)ExoU發(fā)生結(jié)構(gòu)重排使其發(fā)揮活性效應(yīng)。Benson MA等[18]采用位點(diǎn)定向的自旋標(biāo)記技術(shù)(SDSL)結(jié)合電子順磁共振光譜技術(shù)(EPR)研究rExoU功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，在S137R1中加入SOD1和脂質(zhì)體能發(fā)生明顯的光譜變化，并且存在SOD1濃度依賴性；在S643R1中單獨(dú)加入脂質(zhì)體無(wú)光譜變化，但加入SOD1后發(fā)生顯著光譜改變，推測(cè)ExoU的構(gòu)象改變可能發(fā)生在酶催化活性部位和C端區(qū)域。純化的ExoU/SpcU復(fù)合物，即使在輔助因子SOD1過(guò)剩時(shí)，仍然缺乏水解磷脂類似物(如花生四烯?；蛑Ｄ憠A)的能力，推測(cè)ExoU的輔助活化因子和分子伴侶SpcU可能以相似的方式與蛋白結(jié)合，因而二者相互競(jìng)爭(zhēng)，SpcU的存在抑制PLA2活性發(fā)揮[15]。PI(4,5)P2與泛素共存時(shí)，能發(fā)揮協(xié)同作用增強(qiáng)ExoU的PLA2活性；PI(4,5)P2含量減少的酵母細(xì)胞突變體，對(duì)ExoU介導(dǎo)的殺細(xì)胞效應(yīng)敏感性下降，由此推測(cè)PI(4,5)P2可能是一種新型的ExoU共激活因子[21]。

4 ExoU蛋白相關(guān)性實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

目前圍繞銅綠假單胞菌ExoU蛋白的檢測(cè)主要包括三方面內(nèi)容，一是直接檢測(cè)蛋白，二是檢測(cè)蛋白編碼基因exoU，三是檢測(cè)蛋白的PLA2生物學(xué)活性。由于T3SS分泌效應(yīng)蛋白的先決條件是有適宜的環(huán)境條件，并與宿主細(xì)胞密切接觸，由宿主細(xì)胞提供輔助活化因子，因此蛋白直接檢測(cè)和PLA2活性檢測(cè)不適用于臨床分離菌株常規(guī)檢查，一般只用于實(shí)驗(yàn)室研究。目前臨床應(yīng)用較多的是基因檢測(cè)，通過(guò)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因、測(cè)序，檢測(cè)臨床分離菌株exoU基因攜帶率，間接反映ExoU蛋白與臨床疾病類型、病情進(jìn)展、預(yù)后及耐藥等相關(guān)性。

5 ExoU與臨床疾病

由于存在地區(qū)、環(huán)境、用藥習(xí)慣及疾病類型等差異，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道ExoU蛋白編碼基因exoU檢出率相差很大，比較趨向一致的結(jié)果是exoU陽(yáng)性菌株感染病例一般較為嚴(yán)重。36株燒傷患者傷口分泌物檢出的多藥耐藥銅綠假單胞菌中，exoU基因100%陽(yáng)性[29]。糖尿病足患者感染exoU陽(yáng)性菌株與exoS陽(yáng)性菌株相比具有更低的治愈率(25% vs 65.2%)和更高的截肢率(33.3% vs 8.7%)[30]。Idris SN等研究認(rèn)為[31]exoU陽(yáng)性菌株存在感染部位和性別差異，更易引起呼吸道感染(61%)，在男性患者中檢出率更高(83%)。Garey KW等[32]回顧性分析122例銅綠假單胞菌感染的菌血癥患者，發(fā)現(xiàn)exoS陽(yáng)性檢出率明顯高于exoU(72.1% vs 27%)，但二者致死率未見(jiàn)顯著差異(35% vs 43%)，推測(cè)菌血癥患者死亡率高的原因可能與銅綠假單胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，容易導(dǎo)致DIC和感染性休克有關(guān)[33]。今后應(yīng)通過(guò)增加樣本類型和樣本量，同時(shí)檢測(cè)exoU陽(yáng)性菌株的蛋白表達(dá)狀況，進(jìn)一步探討ExoU與臨床疾病及病情嚴(yán)重程度的確切相關(guān)性。

6 ExoU與耐藥相關(guān)性

近年來(lái)，隨著廣譜抗菌藥物的大量應(yīng)用、甚至濫用，銅綠假單胞菌耐藥問(wèn)題日益突出，碳青霉烯類、氟喹諾酮類藥物耐藥成為威脅感染患者生命的重要因素，在南韓59.6%的碳青霉烯類耐藥的銅綠假單胞菌表現(xiàn)為對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥[34]。Hye等[11]分析66株碳青霉烯類藥物耐藥的銅綠假單胞菌發(fā)現(xiàn)，exoU攜帶率遠(yuǎn)高于exoS(66.7% vs30.3%)，與exoS陽(yáng)性菌株相比exoU陽(yáng)性菌株對(duì)氟喹諾酮藥物具有更高的耐藥率(93.2% vs 45%)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)exoU陽(yáng)性菌株氟喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDRs)多位點(diǎn)突變率高達(dá)90.9%，顯著高于exoS陽(yáng)性菌株的35%，同時(shí)攜帶兩種基因的菌株100%屬于多位點(diǎn)變異。Mellissa[35]等分析270株銅綠假單胞菌，其中54%氟喹諾酮耐藥，exoU陽(yáng)性菌株耐藥率63%，明顯高于exoS陽(yáng)性菌株的49%，多點(diǎn)突變率顯著高于exoS陽(yáng)性菌株(53% vs 39%)，突變位點(diǎn)以Thr83lle和Ser87Leu為主，突變率達(dá)70%。歐洲的一項(xiàng)調(diào)查結(jié)果同樣顯示[36]，exoU陽(yáng)性菌株與銅綠假單胞菌的多藥耐藥性及氟喹諾酮耐藥之間存在明顯相關(guān)性，認(rèn)為可能exoU陽(yáng)性菌株更能適應(yīng)氟喹諾酮藥物富集的環(huán)境。角膜炎患者分離的銅綠假單胞菌耐藥分析亦顯示[37]，exoU陽(yáng)性菌株與陰性菌株相比對(duì)環(huán)丙沙星、慶大霉素、氧氟沙星具有更高的耐藥性。

關(guān)于exoU陽(yáng)性菌株耐藥性更強(qiáng)的詳細(xì)機(jī)制目前還不清楚，推測(cè)可能與下列因素有關(guān)：①外排泵系統(tǒng)過(guò)度表達(dá)：在加有外排泵抑制劑(EPI)時(shí)，97%的exoU陽(yáng)性菌株對(duì)左氧氟沙星的MIC值降低至少8倍，其中55%的耐藥菌株重新表現(xiàn)為對(duì)氟喹諾酮敏感[35]；②與細(xì)菌啟動(dòng)SOS應(yīng)答有關(guān)：低濃度左氧氟沙星即可啟動(dòng)細(xì)菌的SOS應(yīng)答，誘導(dǎo)產(chǎn)生具有“錯(cuò)誤傾向”的DNA修復(fù)酶，引起細(xì)菌廣泛的基因突變[38]。由此推測(cè)，在藥物壓力下exoU陽(yáng)性菌株在SOS應(yīng)答中可能更傾向于產(chǎn)生耐藥相關(guān)聚合酶，通過(guò)耐藥突變的發(fā)生使細(xì)菌得以存活；③與細(xì)菌DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有關(guān)[35]：某些基因的啟動(dòng)子對(duì)DNA超螺旋狀態(tài)的變化高度敏感，超螺旋可能改變啟動(dòng)子區(qū)結(jié)構(gòu)使其進(jìn)入轉(zhuǎn)錄、表達(dá)狀態(tài)，推測(cè)exoU陽(yáng)性菌株可能攜帶有拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)敏感啟動(dòng)子，氟喹諾酮類藥物作用于細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶使DNA超螺旋狀態(tài)改變，致使細(xì)菌拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)敏感的耐藥基因表達(dá)。

目前國(guó)內(nèi)有關(guān)T3SS及其效應(yīng)蛋白與細(xì)菌耐藥相關(guān)性的研究較少，現(xiàn)有的研究資料關(guān)于exoU基因和ExoU蛋白與銅綠假單胞菌耐藥是否相關(guān)存在分歧。吳愛(ài)武等研究認(rèn)為[10]，銅綠假單胞菌多重耐藥菌株與非多重耐藥菌株exoU攜帶率無(wú)顯著性差異(10% vs 11.76%)，多重耐藥菌株exoU基因檢出率明顯低于exoS基因(10% vs 73.33 %)，認(rèn)為可能與檢測(cè)標(biāo)本量較少，且未檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物有關(guān)。安浩君等[39]對(duì)感染性心內(nèi)膜炎患者血標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示，多重耐藥菌株中exoU基因與exoS基因檢出率相比無(wú)顯著差異(42.67% vs 49.33%)。然而，董晨曉等[40]對(duì)43株臨床分離銅綠假單胞菌的研究結(jié)果與上述觀點(diǎn)相反，結(jié)果顯示exoU陽(yáng)性菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物耐藥率明顯高于exoS陽(yáng)性菌株，認(rèn)為攜帶exoU的菌株有更高的耐藥性。不同研究結(jié)果的差異可能與不同地區(qū)、不同感染來(lái)源的菌株有關(guān)，但T3SS效應(yīng)基因及效應(yīng)蛋白與耐藥及多重耐藥的關(guān)聯(lián)應(yīng)進(jìn)一步加以深入研究實(shí)，以期為多重耐藥菌株感染的控制提供策略。

綜上所述，目前盡管已對(duì)銅綠假單胞菌T3SS的毒性蛋白ExoU和其編碼基因exoU的認(rèn)識(shí)和研究取得了很大進(jìn)展，但許多確切機(jī)制仍有待于進(jìn)一步闡明，如控制ExoU分泌的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、是否還有未知的激活ExoU發(fā)揮毒性效應(yīng)的共刺激因子、共刺激因子與宿主細(xì)胞膜結(jié)合靶位如何協(xié)同增強(qiáng)毒性作用，以及針對(duì)ExoU蛋白分泌、活化的抑制劑篩選問(wèn)題等，是今后需要不斷努力的方向。

[1]Folkesson A, Jelsbak L, Yang L, et al. Adaptation ofPseudomonasaeruginosato the cystic fibrosis airway: an evolutionary perspective[J]. Nat Rev Microbiol, 2012, 10(12): 841-851.

[2]Engel J, Balachandran P. Role ofPseudomonasaeruginosatype III effectors in disease[J]. Curr Opin Microbiol, 2009, 12(1): 61-66.

[3]Hauser AR. The type III secretion system ofPseudomonasaeruginosa: infection by injection[J]. Nat Rev Microbiol, 2009, 7(9): 654-665.

[4]Howell HK, Logan LK, Hausera AR. Type III secretion of ExoU is critical during earlyPseudomonasaeruginosapneumonia[J]. MBio, 2013, 4(2): e00032

[5]Schulert GS, Feltman H, Rabin SDP, et al. Secretion of the toxin ExoU is a marker for highly virulentPseudomonasaeruginosaisolates obtained from patients with hospital-acquired pneumonia[J]. J Infect Dis, 2003, 188(11): 1695-1706.

[6]Kulasekara BR, Kulasekara HD, Wolfgang MC, et al. Acquisition and evolution of theexoUlocus inPseudomonasaeruginosa[J]. J Bacteriol, 2006, 188(11): 4037-4050.

[7]Andersson DJ. The biological cost of mutational antibiotic resisitance: any practical conclusion?[J]. Curr Opin Microbiol, 2006, 9(5): 461-465.

[8]Lin HH, Huang SP, Teng HC, et al. Presence of theexoUgene ofPseudomonasaeruginosais correlated with cytotoxicity in MDCK cells but not with colonizationin BALB/c mice△[J]. J Clin Microboil, 2006, 44(12): 4596-4597.

[9]Lei CB, Chao Y, Sun XH, et al. Detection of virulence genes inPseudomonasaeruginosaand its clinical significance[J]. Clin J Clin Lab Sci, 2011, 29(4): 301-303. (in Chinese) 類承斌，晁艷，孫相紅，等.銅綠假單胞菌毒力基因檢測(cè)及臨床意義[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2011，29(4)：301-303.

[10]Wu AW, Huang JR. Detection and analysis of gene exoS and exoU inPseudomonasaeruginosa[J]. Chin J Health Lab Tech, 2013, 23(1): 129-132. (in Chinese) 吳愛(ài)武，黃孑然.銅綠假單胞菌exoS、exoU基因的檢測(cè)與分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013,23(1)：129-132.

[11]Cho HH, Kwon KC, Kim S, et al. Correlation between virulence genotype and fluoroquinolone resistance in carbapenem-resistantPseudomonasaeruginosa[J]. Ann Lab Med, 2014, 34(4): 286-292.

[12]Ferreira ML, Dantas RC, Faria AL, et al. Molecular epidemiological survey in quinolone and carbapenem-resistant genotype and its association with type III secretion system inPseudomonasaeruginosa[J]. J Med Microbiol, 2015, 64(Pt3): 262-271.

[13]Galle M, Carpentier I, Beyaert R. Structure and function of the type III secretion system ofPseudomonasaeruginosa[J]. Curr Protein Peptide Scie, 2012, 13(8): 831-842.

[14]Gendrin C, Contreras-Martel C, Bouillot S, et al. Structural basis of cytotoxicity mediated by the type III secretion toxin ExoU fromPseudomonasaeruginosa[J]. PLoS Pathog, 2012, 8(4): e1002637.

[15]Halavaty AS, Borek D, Tyson GH, et al. Structure of the type III secretion effecter protein ExoU in complex with its chaperone SpcU[J]. PLoS One, 2012, 7(11): e49388.

[16]Dessen A, Tang J, Schmidt H, et al. Crystal structure of human cytosolic phospholipase A2 reveals a novel topology and catalytic mechanism[J]. Cell, 1999, 97(3): 349-360.

[17]Rydel TJ, Williams JM, Krieger E, et al. The crystal structure, mutagenesis, and activity studies reveal that patatin is a lipid acyl hydrolase with a Ser-Asp catalytic dyad[J]. Biochemistry, 2003, 42(22): 6696-6708.

[18]Benson MA, Komas SM, Schmalzer KM, et al. Induced conformational changes in the activation of thePseudomonasaeruginosatype III toxin, ExoU[J]. Biophys J, 2011, 100(5): 1335-1343.

[19]Rabin SD, Veesenmeyer JL, Bieging KT, et al. A C-terminal domain targets thePseudomonasaeruginosacytotoxin ExoU to the plasmamembrane of host cells[J]. Infect Immun, 2006, 74(5): 2552-2561.

[20]Stirling FR, Cuzick A, Kelly SM, et al. Eukaryotic localization, activation and ubiquitinylation of a bacterial type III secreted toxin[J]. Cell Microbiol, 2006, 8(8): 1294-1309.

[21]Tyson GH, Hauser AR. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is a novel coactivator of thePseudomonasaeruginosacytotoxin ExoU[J]. Infect Immun, 2013, 81(8): 2873-2881.

[22]Sato H, Frank DW. Intoxication of host cells by the T3SS phospholipase ExoU: PI(4,5)P2-associated, cytoskeletal collapse and late phase membrane blebbing[J]. PLoS One, 2014, 9(7): e103027.

[23]El Solh AA, Akinnusi ME, Wiener-Kronish JP, et al. Persistent infection withPseudomonasaeruginosain ventilator-associated pneumonia[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2008, 178(5): 513-519.

[24]Cuzick A, Stirling FR, Lindsay SL, et al. The type III pseudomonal exotoxin U activates the c-Jun NH2-terminal kinase pathway and increases human epithelial interleukin-8 production[J]. Infect Immun, 2006, 74(7): 4104-4113.

[25]de Lima CD, Calegari-Silva TC, Pereira RM, et al. ExoU Activates NF-kB and Increases IL-8/KC Secretion duringPseudomonasaeruginosaInfection[J]. PLoS One, 2012, 7(7): e41772.

[26]Sato H, Feix JB, Frank DW, et al. Identification of superoxide dismutase as a cofactor for thePseudomonastype III toxin, ExoU[J]. Biochemistry, 2006, 45(34): 10368-10375.

[27]Anderson DM, Schmalzer KM, Sato H, et al. Ubiquitin and ubiquitin-modified proteins activate thePseudomonasaeruginosaT3SS cytotoxin, ExoU[J]. Mol Microbiol, 2011, 82(6): 1454-1467.

[28]Schmalzer KM, Benson MC, Frank DW. Activation of ExoU phospholipase activity requires specific C-terminal regions△[J]. J Bacteriol, 2010, 192(7): 1801-1812.

[29]Zhou XJ, Xu GL, Ying YH. Investigation of resistance genes and virulence factors in drug-resistantPseudomonasaeruginosaisolated from burn department[J]. Clin J Nosocomiol, 2014, 24(7): 1580-1582. (in Chinese) 周曉娟，徐根隆，應(yīng)華永.燒傷科耐藥銅綠假單胞菌耐藥性與毒力基因研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014,24(7):1580-1582.

[30]Zhang J, Chu Y, Wang P, et al. Clinical outcomes of multidrug resistantPseudomonasaeruginosainfection and the relationship with type III secretion system in patients with diabetic foot[J]. Int J Low Extrem Wounds, 2014, 13(3): 205-210.

[31]Idris SN, Desa MN, Aziz MN, et al. Antimicrobial susceptibility pattern and distribution of exoU and exoS in clinical isolates ofPseudomonasaeruginosaat a Malaysian hospital[J]. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 2012, 43(1): 116-123.

[32]Garey KW, Vo QP, Larocco MT, et al. Prevalence of type III secretion system protein exoenzymes and antimicrobial susceptibility patterns from bloodstream isolates of patients withPseudomonasaeruginosa[J]. J Chemother, 2008, 20(6): 714-720.

[33]Chen DY, Liu Y, Xu PP, et al. Apoptosis of vascular endothelial cells induced byP.aeruginosaand its L-forms[J]. Chin J Zoonoses, 2011, 27(1): 37-40. (in Chinese) 陳登宇,劉 勇,徐萍萍，等.銅綠假單胞菌及其L型誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2011,27(1)：37-40.

[34]Lee JY, Ko KS. OprD mutations and inactivation, expression of efflux pumps and AmpC, and metallo-β-lactamases in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates from South Korea[J]. Int J Antimicrob Agents, 2012, 40(2): 168-172.

[35]Agnello M, Wong-Beringer A. Differentiation in quinolone resistance by virulence genotype inPseudomonasaeruginosa[J]. PLoS One, 2012, 7(8): e42973.

[36]Maatallah M, Cheriaa J, Backhrouf A, et al. Population structure ofPseudomonasaeruginosafrom five mediterranean countries: evidence for frequent recombination and epidemic occurrence of CC235[J]. PLoS One, 2011, 6(10): e25617.

[37]Borkar DS, Acharya NR, Leong C, et al. Cytotoxic clinical isolates ofPseudomonasaeruginosaidentified during the Steroids for Corneal Ulcers Trial show elevated resistance to fluoroquinolones[J]. BMC Ophthalmol, 2014, 54(14): 1-6.

[38]Cirz RT, O’Neill BM, Hammond JA, et al. Defining the Pseudomonas aeruginosa SOS response and its role in the global response to the antibiotic ciprofloxacin[J]. J Bacteriol，2006, 188(20): 7101-7110.

[39]An HJ, Chen HG, Li X, et al. Study of gens responsible for the drug resisitance ofPseudomonasaeruginosain patients with infective endocarditis[J]. J Pathog Biol, 2014, 9(12): 1071-1074. (in Chinese) 安浩君，陳慧剛，李霞，等.感染性心內(nèi)膜炎患者分離株銅綠假單胞菌耐藥基因研究[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2014,9(12)：1071-1074.

[40]Dong CX, Song SD, Wang Y, et al. Carrying ofexoSandexoUin 43 clinical isolates ofPseudomonasaeruginosaand their drug resistance[J]. Clin Infect Ctrl, 2010, 9(2): 93-96. (in Chinese) 董晨曉，宋詩(shī)鐸，王悅，等.43株臨床銅綠假單胞菌exoS、exoU基因攜帶及其耐藥性[J].中國(guó)感染控制雜志，2012,9(2)：93-96.

Research progress of toxic protein ExoU inPseudomonasaeruginosa

JU Xiao-hong1,LI Zheng-hua2,MA Ai-xin1,LI Yao1

(1.DepartmentofPathogen,JilinMedicalCollege,Jilin132013,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,theHospitalofChemicalIndustrialCompanyinJilin,Jilin132022,China)

Pseudomonasaeruginosais an important conditioned pathogen with the multitude of virulence factors. Among them, the type Ⅲ secretion system (T3SS) which is the most important pathogenic factors plays a crucial role in the acute infection ofPseudomonasaeruginosa. This system exert cytotoxicity through targeted delivery of protein effector (ExoS, ExoT, ExoU and ExoY) into host cell. In particular, ExoU is a potent cytotoxin closely related to disease development, outcomes and therapy. In this paper, we briefly review research progress on the toxic protein ExoU for recent years, aiming at serving as a guide for infection control and treat ofPseudomonasaeruginosa.

Pseudomonasaeruginosa; type Ⅲ secretion system (T3SS); EoxU; multiple drug resistance; toxic gene

1.吉林醫(yī)藥學(xué)院病原學(xué)教研室，吉林 132013; 2.吉林化工醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 132001; Email：Lijin838@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.018

R378.99

A

1002-2694(2015)11-1069-06

2015-04-17；

2015-08-21