規(guī)?；N場進口奶牛隱孢子蟲種類、基因亞型鑒定及其生物安全評價

王臣榮，齊 萌，李俊強，張振杰，劉鵬飛，余復(fù)昌，曹建科，寧長申，張龍現(xiàn)

規(guī)?；N場進口奶牛隱孢子蟲種類、基因亞型鑒定及其生物安全評價

王臣榮，齊 萌，李俊強，張振杰，劉鵬飛，余復(fù)昌，曹建科，寧長申，張龍現(xiàn)

目的 為了解進口奶牛寄生的隱孢子蟲對引種場污染情況及是否影響隱孢子蟲種類和基因型在當(dāng)?shù)氐姆植?。方?采用PCR方法檢測河南省某規(guī)?；N場奶牛隱孢子蟲感染情況。結(jié)果 基于18S rRNA基因位點進行PCR檢測，奶牛隱孢子蟲總感染率為17.8%(90/507)，鑒定出4種隱孢子蟲，分別為微小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲、芮氏隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲，隱孢子蟲感染率隨牛年齡增長而呈遞減趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。斷奶前犢牛以微小隱孢子蟲為優(yōu)勢感染種，斷奶前犢牛腹瀉與微小隱孢子蟲感染呈正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。基于gp60基因位點，43份微小隱孢子蟲陽性樣品成功擴增出35份，序列分析顯示35個微小隱孢子蟲均為人獸共患基因亞型IIdA19G1， 而奶牛引種地(澳大利亞)的牛源微小隱孢子蟲均為IIa亞型家族存在顯著不同。結(jié)論 證實微小隱孢子蟲為犢牛腹瀉病原之一，IId亞型為中國獨特分布的微小隱孢子蟲亞型，其基因亞型存在地理隔離遺傳特征，引種青年牛和成年牛不影響當(dāng)?shù)刂匾双F共患蟲種微小隱孢子蟲基因亞型分布，從這個角度考慮不具有生物安全重要性。

隱孢子蟲；種類；基因亞型；鑒定；奶牛

隱孢子蟲是重要的人獸共患原蟲之一，宿主譜包括人在內(nèi)的260多種脊椎動物，可致以腹瀉為主要臨床癥狀的隱孢子蟲病[1]。隱孢子蟲多通過“糞-口”途徑傳播，牛被認為是人類隱孢子蟲病的重要傳染源，牛糞污染水源和食物是導(dǎo)致人體隱孢子蟲病暴發(fā)的主要因素[2-3]。寄生于牛的隱孢子蟲主要有4種：微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)、安氏隱孢子蟲(Cryptosporidiumandersoni)、牛隱孢子蟲(Cryptosporidiumbovis)和芮氏隱孢子蟲(Cryptosporidiumryanae)[1]。微小隱孢子蟲是最重要的人獸共患隱孢子蟲蟲種，世界范圍內(nèi)人體隱孢子蟲病例約45%由該蟲引起，而其它3個寄生于牛的蟲種均具有宿主特異性[1,4]。研究表明，冠狀病毒(coronavirus)、輪狀病毒(rotaviruses)、腸毒素性大腸桿菌(enterotoxicEscherichiacoli)和微小隱孢子蟲是引起犢牛腹瀉的4個主要病原，以輪狀病毒和微小隱孢子蟲更為常見[5]。

微小隱孢子蟲具有廣泛的宿主范圍，為闡明該蟲種動力學(xué)傳播和人獸共患的潛在威脅性，基因亞型分析工具常用于該蟲群體遺傳結(jié)構(gòu)鑒定和人獸共患風(fēng)險評價[6-7]。研究表明，微小隱孢子蟲群體遺傳存在較大的種內(nèi)變異，基于60-kDa 糖蛋白(gp60)基因分為IIa-i，IIk-o共14個亞型家族，其中IIa和IId亞型家族可在人和反芻動物之間傳播，而IIc和IIe亞型家族僅通過人-人途徑傳播，其它亞型家族多具有宿主特異性[4,6,8-12]。

我國已成為世界上最大種牛進口國，2008-2013年從澳大利亞、新西蘭和烏拉圭等國進口奶牛46萬頭。在我國與主要進口國雙邊簽署的動物檢疫條款中，隱孢子蟲未作為檢查項目。

1 材料方法

1.1 樣品采集 調(diào)查樣品來自河南省某規(guī)?；N奶牛場，該場于2013年4月20日從澳大利亞引進1 000頭荷斯坦成年奶牛，采用人工授精方式進行配種繁育。2014年6月至2014年12月對該場隨機經(jīng)直腸采集507頭奶牛新鮮糞便樣品，其中有腹瀉癥狀的斷奶前犢牛85頭，每份10～30 g，裝入潔凈自封袋中，記錄信息，帶回實驗室，置4 ℃保存。奶牛年齡劃分參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)部《奶牛標準化規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范(試行)》，<60 d為斷奶前犢牛，61～180 d為斷奶后犢牛，181～450 d為育成牛，>450 d 為成年牛。

1.2 DNA提取 取200 mg糞便樣本，用美國OMEGA Bio-Tek公司生產(chǎn)的糞便DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Stool DNA Kit，D4015-02)，購于鄭州科貿(mào)生物技術(shù)有限公司，按說明書步驟操作，提取的DNA置-20 ℃保存。

1.3 PCR擴增 基于18S rRNA基因?qū)λ袠悠愤M行隱孢子蟲檢測和蟲種鑒定，引物及反應(yīng)程序參照Xiao等[13]的方法?；趃p60基因?qū)ξ⑿‰[孢子蟲進行基因亞型鑒定，引物及反應(yīng)程序參照Sulaiman等[14]的方法。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)體系中使用的酶為KOD-plus酶0.5 μL (日本TOYOBO公司生產(chǎn)，購于鄭州科貿(mào)生物技術(shù)有限公司)，每次PCR擴增均設(shè)陽性對照樣品和陰性對照樣品。電泳結(jié)束后在電泳凝膠成像系統(tǒng)儀中觀察拍照。

1.4 測序 PCR產(chǎn)物測序委托北京諾賽基因有限公司完成，采用雙脫氧終止法進行雙向測序，測序儀為ABI PRISMTM?3730 XL DNA Analyzer (Applied Biosystems，USA)。在GenBank上用Blast進行同源序列搜索，應(yīng)用Clustal X 1.83進行比對分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)分析采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 隱孢子蟲感染情況 基于18S rRNA基因位點對507份樣品進行PCR擴增和測序，90份鑒定為隱孢子蟲陽性，總感染率為17.8%。鑒定出4種隱孢子蟲，以微小隱孢子蟲為優(yōu)勢感染蟲種，所占陽性樣品比例為47.8%，牛隱孢子蟲、賴氏隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲所占比例分別為41.1%、5.6%和5.6%。見表1。隱孢子蟲感染率隨牛年齡增長而呈遞減趨勢，斷奶前犢牛感染率達38.8%，斷奶后犢牛、育成牛和成年牛的感染率分別為15.6%、3.8%和1.0%。見表1。不同年齡段奶牛隱孢子蟲感染率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。斷奶前犢牛以微小隱孢子蟲為優(yōu)勢感染蟲種，斷奶后犢牛、育成牛和成年牛均以牛隱孢子蟲為優(yōu)勢感染蟲種。見表1。

2.2 不同臨床癥狀斷奶前犢牛感染情況 本次調(diào)查中，斷奶前犢牛多在7～25 d出現(xiàn)腹瀉癥狀。斷奶前腹瀉和未腹瀉犢牛隱孢子蟲的感染率分別為44.7%和32.5%，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2。斷奶前犢牛微小隱孢子蟲為優(yōu)勢蟲種，與腹瀉呈正相關(guān)關(guān)系，斷奶前腹瀉與未腹瀉犢牛微小隱孢子蟲感染率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。斷奶前犢牛感染牛隱孢子蟲與腹瀉呈負相關(guān)關(guān)系，斷奶前腹瀉與未腹瀉犢牛的牛隱孢子蟲感染率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表1 不同年齡段奶牛隱孢子蟲感染情況Tab.1 Infection of Cryptosporidium in dairy cattle in different age

表2 不同臨床癥狀斷奶前犢牛隱孢子蟲感染情況Tab.2 Infection of Cryptosporidium in different clinical signs in pre-weaned calves

2.3 斷奶前犢牛隱孢子蟲種類分布 0～7 d、8～14 d、15～21 d、22～28 d、29～35 d、36～42 d、43～49 d和50`56 d犢牛隱孢子蟲感染分別為17.4%、66.7%、42.1%、38.5%、52.0%、29.4%、18.2%和5.6%，統(tǒng)計學(xué)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。不同周齡斷奶前犢牛隱孢子蟲蟲種分布存在顯著差異，僅在<35 d犢牛中發(fā)現(xiàn)微小隱孢子蟲感染，4 d即可檢查到該蟲感染，8～14 d 犢牛該蟲感染率最高，為64.1%；牛隱孢子蟲則主要感染4～7周齡犢牛，29～35 d 犢牛該蟲感染率最高，為40.0%；芮氏隱孢子蟲偶見感染4周齡后犢牛；未發(fā)現(xiàn)有C.andersoni感染。見圖1。

2.4 微小隱孢子蟲基因亞型序列分析 基于gp60基因位點對43份微小隱孢子蟲進行基因亞型鑒定，成功擴增出35條序列。經(jīng)Blast搜索和Clustal X 1.83 比對，所得35條序列均與微小隱孢子基因亞型IIdA19G1(GenBank登錄號：HQ009809)序列同源性為100%，該基因亞型為河南省奶牛源微小隱孢子蟲優(yōu)勢亞型。

圖1 不同周齡斷奶前犢牛隱孢子蟲蟲種分布

Fig.1 Distribution ofCryptosporidiumspecies in different week ages of pre-weaned calves

3 討 論

不同國家和地區(qū)，牛隱孢子蟲病流行率存在差異較大，與其飼養(yǎng)管理、樣本數(shù)量、年齡段分布以及檢測方法等因素有關(guān)。本研究中奶牛隱孢子蟲總感染率為17.8%，其中斷奶前犢牛感染率最高，為38.8%，高于河南省、陜西省和寧夏回族自治區(qū)斷奶前犢牛隱孢子蟲感染率，分別為21.5%(172/801)、20.2%(52/258)和10.2%(19/186)[9,15-16]，低于黑龍江省斷奶前犢牛隱孢子蟲感染率47.7%(72/151)[17]。斷奶后犢牛感染率為15.6%，高于黑龍江省(5.5%，8/145)和河南省(11.3%，86/758)斷奶后犢牛隱孢子蟲感染率[18-19]。在澳大利亞西部，犢牛隱孢子蟲感染率為48%(26/54)[20]，東南部新南威爾士州斷奶前犢牛隱孢子蟲感染率為22.3%(81/364)[21]。美國一項調(diào)查研究顯示，<8周齡的斷奶前犢牛隱孢子蟲感染率最高，為45.8%，依次是3～12月齡斷奶后犢牛(18.5%)和1～2歲的母牛(2.2%)[22]；國內(nèi)的研究數(shù)據(jù)也顯示幼齡奶牛隱孢子蟲感染率高于成年牛[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染率隨牛年齡增長而呈遞減趨勢，與先前的國內(nèi)外報道相一致。

感染牛的隱孢子蟲蟲種較多，除4種自然宿主為牛的隱孢子蟲蟲種外，還有7種隱孢子蟲和一個基因型可感染?？苿游颷24]。本研究發(fā)現(xiàn)該引種場奶牛感染4種主要感染牛隱孢子蟲蟲種，以微小隱孢子蟲為優(yōu)勢感染蟲種，與大多數(shù)發(fā)達國家研究報道相一致，微小隱孢子蟲幾乎是感染斷奶前犢牛的唯一蟲種[4]。在中國河南省、黑龍江省和陜西省的調(diào)查結(jié)果顯示，牛隱孢子蟲是感染斷奶前犢牛的主要蟲種，而在寧夏回族自治區(qū)的調(diào)查結(jié)果顯示微小隱孢子蟲是感染斷奶前犢牛的優(yōu)勢蟲種，表明犢牛感染微小隱孢子蟲與地理區(qū)域分布有一定關(guān)系[9,12,15-17]。同樣在澳大利亞的研究也表明犢牛感染微小隱孢子蟲與地理分布有關(guān)，在澳大利亞西部斷奶前犢牛微小隱孢子蟲感染率為17.6%，而在維多利亞州感染率為46.3%[24]。在美國、丹麥、瑞士等國家的研究發(fā)現(xiàn)，牛隱孢子蟲是斷奶后牛主要的感染蟲種[1,4]，而在中國的大多數(shù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)安氏隱孢子蟲是斷奶后牛主要的感染蟲種[19]，本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)牛隱孢子蟲是該場斷奶后牛感染的優(yōu)勢蟲種，或與該引種場建場時間較短相關(guān)。

不同的隱孢子蟲可導(dǎo)致牛表現(xiàn)出不同的臨床癥狀，安氏隱孢子蟲多感染青年牛和成年牛，雖不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，但可引起泌乳牛產(chǎn)奶量下降[19,23]。牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲一般不會導(dǎo)致牛表現(xiàn)任何臨床癥狀[17,21]。微小隱孢子蟲則主要感染斷奶前犢牛，可引起犢牛水樣腹瀉、脫水，甚至死亡[6]。犢牛腹瀉是一個復(fù)雜的，多因素的疾病，與宿主對病原體抵抗力相關(guān)，微小隱孢子蟲是最常見的犢牛腹瀉病原之一[5]。先前國內(nèi)有關(guān)微小隱孢子蟲引起犢牛腹瀉的報道較少，近來在中國西北地區(qū)某奶牛場暴發(fā)由微小隱孢子蟲引起的隱孢子蟲病，犢牛群體出現(xiàn)嚴重的水樣腹瀉并導(dǎo)致死亡，調(diào)查發(fā)現(xiàn)2～3周齡的斷奶前犢牛感染率最高，達83.3%(40/48)[12]。在澳大利亞的一項調(diào)查顯示，斷奶前腹瀉犢牛的隱孢子蟲感染率為73.5%(144/196)，其中以微小隱孢子蟲為主要蟲種，所占陽性比列為59.4%[24]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，斷奶前犢牛多在7～25 d出現(xiàn)腹瀉癥狀，且主要由微小隱孢子蟲引起。因此，應(yīng)加強對犢牛糞便的無害化處理，尤其是防止糞便污染水源。

牛源微小隱孢子蟲可引起人體急性或慢性腹瀉，導(dǎo)致免疫功能低下者水樣腹瀉甚至死亡，但并非所有牛源微小隱孢子蟲均可人獸共患[7-8]。近年來，國內(nèi)有關(guān)奶牛源微小隱孢子種類和基因亞型鑒定的報道較多，基于gp60基因位點，奶牛源微小隱孢子蟲分離株的基因亞型均為IId亞型家族，存在人獸共患風(fēng)險[9,12,17]。本研究中，35個微小隱孢子分離株的基因亞型均為IIdA19G1，與Wang等[9]報道的河南省牛源微小隱孢子分離株的基因亞型相一致。目前，在中國已有11個微小隱孢子基因亞型被鑒定，在奶牛體內(nèi)僅見2個IId亞型家族感染，分別為IIdA15G1和IIdA19G1。而在澳大利亞，14個奶牛源微小隱孢子蟲基因亞型則均屬于IIa亞型家族，分別為II aA15G2R1、IIaA16G3R1、IIa-A17G2R1、IIaA18G2R1a、IIaA18G2R1b、IIaA18G3R1、IIaA18G4R1、II aA19G3R1a、IIaA19G3R1b、IIaA20G2R1、IIaA20G3R1、IIaA20G4R1、IIaA21G3R1和II aA23G3R1。微小隱孢子蟲主要感染幼齡牛，本次調(diào)查的養(yǎng)殖場所引進種牛均為成年牛，一定程度上隔離了不同微小隱孢子蟲基因亞型的擴散和傳播。大量群體遺傳學(xué)研究表明微小隱孢子蟲的存在獨特的地理遺傳隔離特征[6-8]，本研究結(jié)果進一步支持微小隱孢子蟲的基因亞型與地理分布存在明顯相關(guān)性。

國內(nèi)有關(guān)微小隱孢子蟲對動物致病性研究資料較少，本研究證實微小隱孢子蟲是斷奶前犢牛腹瀉的主要病原之一，IId亞型為中國獨特分布的微小隱孢子蟲亞型，其基因亞型存在地理隔離遺傳特征，引種青年牛和成年牛不影響當(dāng)?shù)刂匾双F共患蟲種微小隱孢子蟲基因亞型分布，從這個角度考慮不具有生物安全重要性，為防控隱孢子蟲病傳播奠定了基礎(chǔ)。

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Species and subtype identification ofCryptosporidiumspp.from dairy cattle in an imported farm and its biosafety evaluation

WANG Chen-rong,QI Meng,LI Jun-qiang,ZHANG Zhen-jie,LIU Peng-fei,YU Fu-chang,CAO Jian-ke,NING Chang-shen,ZHANG Long-xian

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity/InternationalJointResearchLaboratoryforZoonoticDiseasesofHenanProvince,Zhengzhou450002,China)

We investigated the effect ofCryptosporidiumfrom imported cow in the local area and the distribution effect ofCryptosporidiumspecies and genotypes in the local area. Using polymerase chain reaction (PCR), we studied the infection ofCryptosporidiumfrom dairy cattle in an imported farm in Henan Province. The overall infection rate ofCryptosporidiumin dairy cattle was 17.8% (90/507) based on 18SRNA gene locus.Cryptosporidiumparvum,Cryptosporidiumbovis,CryptosporidiumryanaeandCryptosporidiumandersoniwere found. Significant differences were observed between the infection rate of sampling and age (P<0.01). The infection rate ofCryptosporidiumdecreased with age increasing in dairy cattle.Cryptosporidiumparvumwere the dominatingCryptosporidiumspp. in pre-weaning calves. We found a positively correlation between the infection ofCryptosporidiumand diarrhea of pre-weaning calves (P<0.01). Thirty-fiveCryptosporidiumparvumwere successfully amplified from 43 positive samples atgp60 gene locus, the subtype of the amplifiedCryptosporidiumparvumwere IIdA19G1, the subtype was different with IIa subtype which were found in imported country (Australia). This study confirmed thatCryptosporidiumparvumis a kind of diarrhea pathogens in dairy calves, the subtype ofCryptosporidiumparvumin China is only IId and the subtype ofCryptosporidiumparvumexist geographical isolation genetic characteristics. It does not have the importance of biological safety from the point that imported heifers and adults do not affect the distribution ofCryptosporidiumspecies and genotypes in the local area.

Cryptosporidium; species; subtype; identification; dairy cattle Support by the Key Program of the National Natural Science Foundation of China (No. 31330079), the Innovation Scientists and Technicians Troop Construction Projects of Henan Province (No. 134200510012), and the Program for Science and Technology Innovative Research Team at the University of Henan Province (No. 012IRTSTHN005)

Zhang Long-xian, Email: zhanglx8999@henau.edu.cn

國家自然科學(xué)基金重點項目(No.31330079), 河南省科技創(chuàng)新人才計劃(No.134200510012), 河南省高校科研創(chuàng)新團隊項目(No. 012IRTSTHN005)聯(lián)合資助

張龍現(xiàn)，Email: zhanglx8999@henau.edu.cn

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南省人獸共患病國際聯(lián)合實驗室，鄭州 450002

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.004

S855.9

A

1002-2694(2015)11-1005-05

2015-04-13；

2015-07-21