應(yīng)用變性高效液相色譜法檢測幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥性

吳文冰,蔡鵬威,方超英,沈 菁，陳 雯

應(yīng)用變性高效液相色譜法檢測幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥性

吳文冰1,蔡鵬威2,方超英3,沈 菁1，陳 雯1

目的 建立DHPLC快速檢測Hp對克拉霉素耐藥性的新方法。方法 抽提56份經(jīng)紙片瓊脂擴(kuò)散法鑒定為克拉霉素耐藥的Hp菌株DNA及其對應(yīng)的胃粘膜組織標(biāo)本DNA，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增23S rRNA區(qū)187 bp基因，運(yùn)用DHPLC技術(shù)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行突變分析，并進(jìn)行DNA測序。結(jié)果 56份克拉霉素耐藥的Hp菌株DNA經(jīng)DHPLC分析，有51份存在異源雙鏈峰，測序證實(shí)均存在點(diǎn)突變，5份無異源雙鏈峰，測序證實(shí)無點(diǎn)突變，故DHPLC對基因突變耐藥菌株的敏感性和特異性為100%，而且56份組織標(biāo)本DNA檢測結(jié)果與菌株DNA檢測結(jié)果一致。結(jié)論 DHPLC可應(yīng)用于Hp對克拉霉素耐藥性的快速檢測，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

幽門螺桿菌；23S rRNA；克拉霉素耐藥；變性高效液相色譜法;基因突變

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp是一種在人類胃粘膜中發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陰性微需氧菌，它與各種消化性疾病，例如消化性潰瘍、胃炎及淋巴相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等關(guān)系密切，是胃癌的高危因素之一?？死顾厥歉蜨p感染最重要的抗生素之一，近年來其耐藥性呈上升趨勢，而Hp對克拉霉素耐藥是導(dǎo)致治療失敗的主要原因。變性高效液相色譜法(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)可自動檢測單堿基替代及小片段核苷酸的插入或缺失,已被證實(shí)為一種快速、簡便的檢測基因突變的技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于腫瘤和遺傳病等的基因研究。本研究應(yīng)用DHPLC來檢測Hp的23S rRNA V區(qū)DNA序列突變，探討23S rRNA V區(qū)基因與耐克拉霉素的的相關(guān)性及其耐藥的分子機(jī)制，同時(shí)為臨床提供更為簡便、經(jīng)濟(jì)、快速的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集本院胃鏡室尿素酶快速檢測法(福建三強(qiáng)公司)陽性的胃竇部或胃體部粘膜活檢標(biāo)本160份，其中確診為消化性潰瘍62份，胃炎98份，男性104份，女性56份，年齡20～72歲，平均年齡(37.1±13.9)歲，所有研究對象均簽署知情同意書。所有活檢標(biāo)本經(jīng)充分研磨混勻后分成兩份，一份用于抽提組織DNA，另一份用于培養(yǎng)及藥敏鑒定。

1.2 研究方法

1.1.1Hp的培養(yǎng)及藥敏鑒定 培養(yǎng)采用含Hp選擇添加劑(OXOID公司)的哥倫比亞瓊脂(OXOID公司)培養(yǎng)基，微需氧環(huán)境(5%的O2，10%的CO2及850%的N2)培養(yǎng)5 d，所得單個(gè)菌落經(jīng)顯微鏡鏡檢形態(tài)吻合，且尿素酶、過氧化氫酶及氧化酶均陽性的判定為Hp。藥敏鑒定參照文獻(xiàn)[1]采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，即取純培養(yǎng)72 h的菌落，用生理鹽水調(diào)成1.0×108CFU/mL，接種于含5%羊血的水解酪蛋白(Mueller-Hinton，M-H)培養(yǎng)基平板，在培養(yǎng)基平板中央貼15 μg的克拉霉素藥敏紙片(OXOID公司)，微需氧環(huán)境(5%的O2，10%的CO2及85%的N2)培養(yǎng)5 d，采用臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(2012)標(biāo)準(zhǔn)，用游標(biāo)卡尺讀取抑菌環(huán)直徑，當(dāng)抑菌環(huán)直徑大于17 mm時(shí)為克拉霉素敏感菌株，當(dāng)抑菌環(huán)直徑小于13 mm時(shí)為克拉霉素耐藥菌株。

1.1.2Hp的DNA抽提及PCR擴(kuò)增 隨機(jī)抽取50份克拉霉敏感菌株和所有克拉霉素耐藥菌株，采用QIAamp DNA Mini Kit和DNeasy Tissue kit(Qiagen公司)分別抽檢菌株及其對應(yīng)的胃粘膜組織DNA，嚴(yán)格按操作說明書進(jìn)行，所得產(chǎn)物作為模板，根據(jù)GenBank中Hp的23S rRNA V 區(qū)DNA序列(編號U27270)設(shè)計(jì)合成PCR擴(kuò)增引物，上游引物為：5′- CGTAACGAGATGGGAGCTGT -3′，下游引物為：5′- ACTCCATAAGAGCCAAAGCCC -3′(上海鉑尚公司合成)，PCR條件：95 ℃變性30 s，95 ℃30 s、57 ℃30 s及72 ℃30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸2 min，取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，其余產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱。

1.1.3 DHPLC分析 以幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(編號：NCTC11637，本實(shí)驗(yàn)室保存)為DHPLC分析的標(biāo)準(zhǔn)參考模板，將敏感菌和耐藥菌的菌株及組織DNA的PCR產(chǎn)物分別和標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA的PCR產(chǎn)物等量混和，采用WAVETM2100型分析儀(Transgenomic公司，美國)進(jìn)行檢測，在儀器分析軟件推薦的變性溫度上下1～2 ℃范圍內(nèi)篩選出最佳變性溫度，所得數(shù)據(jù)采用隨機(jī)分析軟件WAVEMaker?進(jìn)行分析。

1.1.4 DNA測序 將50份敏感菌和耐藥菌的菌株DNA及其對應(yīng)的胃粘膜組織DNA送上海鉑尚公司進(jìn)行測序。

2 結(jié) 果

2.1 克拉霉素耐藥率 從160份活檢樣本中鑒定出56份耐克拉霉素的Hp，耐藥率為35%。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果 50份敏感菌和56份耐藥菌的菌株和胃粘膜組織抽提所得的DNA均擴(kuò)增出特異性條帶，擴(kuò)增片段大小為187 bp，與設(shè)計(jì)的片段大小相一致，見圖1-2。

1: NCTC11637 wild-type; 2:Helicobacterpyloriresistant isolates; 3:Helicobacterpylorisensitivity isolates; M: DL500 DNA Marker (Takara).

圖1 幽門螺桿菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Fig.1 PCR product of clinicalHelicobacterpyloriisolates

2.3 DHPLC分析結(jié)果 56份耐藥菌的菌株DNA

1-16:Helicobacterpyloriresistant isolates; M: DL500 DNA Marker (Takara).

圖2 部分耐藥菌菌株DNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Fig.2 PCR product of someHelicobacterpyloriresistant isolates

和胃粘膜組織DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)DHPLC分析，結(jié)果完全一致。其中51份存在異源雙鏈峰，異常峰一致的樣本為同一基因突變型；5份無異源雙鏈峰，峰型與野生型一致。50份敏感菌菌株DNA和胃粘膜組織DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)DHPLC分析，結(jié)果也完全一致，均無異源雙鏈，峰型與野生型一致。DHPLC分析結(jié)果見,圖3。

A: NCTC11637 wild-type; b: the point mutations of A2142G; c: the point mutations of A2143G.

圖3 DHPLC分析結(jié)果

Fig.3 Analysis of the DHPLC

2.4 50份敏感菌的菌株DNA和胃粘膜組織DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA測序，結(jié)果完全一致，與NCTC11637野生株DNA完全一致。 56份耐藥菌的菌株DNA和胃粘膜組織DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA測序，結(jié)果也完全一致，其中51份存在異源雙鏈峰，有31份為A2142G，20份為A2143G，測序結(jié)果見圖4。

3 討 論

克拉霉素的化學(xué)名稱是6-甲基紅霉素, 是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素之一。其抗菌機(jī)制是其能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并結(jié)合在Hp23S rRNA功能區(qū)V區(qū)的50S大亞基上，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶，影響核糖體的位移過程，阻止肽鏈的延長，從而抑制細(xì)菌蛋白合成，達(dá)到清除Hp的目的[2]，此外克拉霉素具有對酸穩(wěn)定和在胃黏膜中濃度高、口服后生物利用率高和不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，加之臨床上含克拉霉素的三聯(lián)療法與不含克拉霉素的三聯(lián)療法相比，Hp根除率可以提高10%～20%，因此克拉霉素很快成為了根除Hp治療方案的主要抗菌藥物。

A: NCTC11637 wild-type; b: the point mutations of A2142G; c: the point mutations of A2143G.

圖4 DNA測序圖

Fig.4 Sequencing of the DNA

隨著克拉霉素的廣泛使用，臨床上逐漸開始出現(xiàn)耐克拉霉素的Hp，早期的耐藥率基本低于10%，而近年來其耐藥率呈明顯的上升趨勢，超過了20%(如亞洲為21%，美國為29.3%)[3]，更為嚴(yán)重的是在兒童中也出現(xiàn)了高耐藥的Hp[4]，因此闡明克拉霉素的耐藥機(jī)制迫在眉睫，目前有關(guān)克拉霉素耐藥機(jī)制的研究越來越多，使人們對克拉霉素的耐藥有了比較全面深入的研究，最主要的機(jī)制可能克拉霉素結(jié)合靶位突變有關(guān)，包括：23S rRNA V區(qū)的肽基轉(zhuǎn)移酶基因編碼區(qū)域出現(xiàn)點(diǎn)突變和23S rRNA轉(zhuǎn)錄后甲基化區(qū)域的突變[5-6]，前者是目前比較公認(rèn)的重要耐藥機(jī)制之一，包括A2143G、A2142G、A2142C、A2115G、G2141A、C2147G、T2190C、C2195T、A2223G和C2694A[7]，這些突變表明任何V區(qū)基因突變都可能導(dǎo)致Hp對克拉霉素的耐藥，其中以A2143G和A2142G最常見，但不同地區(qū)，不同種族，不同人群的主要突變類型可不相同，如Vega等研究認(rèn)為兒童以A2143G基因突變?yōu)橹?，成人以A2142G基因突變?yōu)橹鱗8]。其次還與多重耐藥流出泵(multidrug resistance efflux pump)基因改變[9-11]，大環(huán)內(nèi)酯類藥物之間的交叉耐藥[12-13]，以及rRNA甲基化酶引起大環(huán)內(nèi)酯類藥物失活、細(xì)胞膜滲透性下降、大環(huán)內(nèi)酯類藥物排出增加等[14]有關(guān)。

目前檢測Hp耐藥的方法可以分為兩類：一類是表型檢測，另一類是基因型檢測。表型檢測主要是培養(yǎng)加藥敏鑒定(包括瓊脂糖稀釋法和Etest法)，但Hp培養(yǎng)條件較為苛刻，且培養(yǎng)周期較長，一般要1～2周才能出報(bào)告，而且由于活檢標(biāo)本污染等原因?qū)е缕溆?0%的漏檢率，從而限制了其臨床應(yīng)用。隨著對Hp耐藥研究的深入，越來越多的研究表明Hp23S rRNA的V區(qū)基因點(diǎn)突變是導(dǎo)致Hp耐藥的主要原因，于是基于PCR的分子生物學(xué)方法被引入了Hp耐藥的檢測，1996年Versalovic等[15]首次通過PCR-限制性片段長度多態(tài)性證實(shí)了Hp23S rRNA的V區(qū)的A2142G和A2143G與Hp耐藥有關(guān)，此后人們相繼應(yīng)用PCR-寡核苷酸連接分析法、PCR-DNA酶聯(lián)免疫測定法DNA、PCR逆轉(zhuǎn)錄雜交線探針分析法、 PCR選擇性同源雜交分析法等檢測Hp的基因點(diǎn)突變，這些方法的操作都相對復(fù)雜，而且耗時(shí)，難以在臨床推廣。

新近，一種新的高通量篩選DNA序列變異的技術(shù)-變性高效液相色譜法開始逐步應(yīng)用于臨床，該技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)(10 min左右)自動檢測單堿基替代及小片段核苷酸的插入或缺失,其原理是用離子對反向高效液相色譜法分離并檢測異源雙鏈。該方法具有自動化、高通量、快速、檢出率高(可達(dá)95%以上)、檢出DNA片段大小范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，主要用于人類基因多態(tài)性和疾病相關(guān)性的研究。Patrizia Posteraro等首先嘗試將DHPLC應(yīng)用到Hp23S rRNA的V區(qū)基因點(diǎn)突變的檢測，其研究表明DHPLC能檢測到所有81份耐藥菌株和96份胃粘膜組織DNA中點(diǎn)突變，并且每種點(diǎn)突變都伴有特異的洗脫峰型[16]。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在56份耐克拉霉素的Hp耐藥菌株DNA中檢出51份存在峰型異常，經(jīng)基因測序證實(shí)都存在點(diǎn)突變，其中31份為A2142G，20份為A2143G，5份未檢測出峰型異常，基因測序也未見突變，50份敏感菌菌株DNA經(jīng)DHPLC分析均無異源雙鏈峰，基因測序也未見突變，與NCTC11637野生株一致，表明DHPLC對基因突變耐藥菌株的敏感性和特異性均達(dá)到100%，同時(shí)，我們也將這50份敏感菌菌株和56份耐藥菌株對應(yīng)的組織DNA進(jìn)行DHPLC分析，得到了相同的的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示DHPLC不但可以用于菌株DNA，也可以用于組織DNA的檢測，這與Patrizia Posteraro等研究相似，這就為臨床提供了一個(gè)更為快速的檢測方法，從而避免了耗時(shí)的培養(yǎng)過程，更為臨床盡早采取正確的治療方案提供依據(jù)。

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Detection of clarithromycin resistance inHelicobacterpyloriby denaturing high performance liquid chromatography assay

WU Wen-bing1,CAI Peng-wei2,FANG Chao-ying3,SHEN Jing1,CHEN Wen1

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,FujianProvincialHospital,ProvincialClinicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,FujianProvincialSouthHospital,ProvincialClinicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China;3.DepartmentofEndoscopeCenter,FujianProvincialHospital,ProvincialClinicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

The aim of this study is to evaluate the denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) assay for the rapid detection of clarithromycin resistance inHelicobacterpylori. A 187 bp fragment of the 23S rRNA gene was amplified using DNA from 56 clinicalHelicobacterpyloriisolates, which were shown to be resistant to clarithromycin by agar dilution, and directly from the homologous gastric biopsies. DHPLC and sequencing were used to detect mutations in all PCR products. For the 56 resistant isolates, 51 of the 56 resistant isolates showed heteroduplex peaks, which were easily distinguishable from the homoduplex pesks of the wild-typeHelicobacterpylorireference strain. Sequencing revealed point mutations in all the 51 resistant isolates. Five of the 56 resistant isolates showed homoduplex peaks, sequencing revealed no point mutations in all the 5 resistant isolates. Our results suggested that the DHPLC assay, whose sensitivity and specificity were 100% in detecting point mutations, was a valid tool for rapid assessment of clarithromycin resistance inHelicobacterpyloriand that in the future it could be used directly on biopsy specimens, avoiding the need for culture-based methods.

Helicobacterpylori; 23S rRNA; clarithromycin resistance; denaturing high performance liquid chromatography assay; gene mutations

福建省衛(wèi)生廳青年科研課題(No.2009-2-3)資助

蔡鵬威,Email:cpweico@163.com

1.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院 福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，福州 350001； 2.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院 福建省立金山醫(yī)院檢驗(yàn)科，福州 35000； 3.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院 福建省立醫(yī)院內(nèi)鏡中心，福州 350001

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.013

R378

A

1002-2694(2015)11-1050-04

2015-07-02；

2015-09-11