應(yīng)用實時高分辨率熔解曲線技術(shù)檢測巴爾通體

劉云彥，宋秀平，劉起勇，陳忠科，栗冬梅

應(yīng)用實時高分辨率熔解曲線技術(shù)檢測巴爾通體

劉云彥1,2，宋秀平1，劉起勇1，陳忠科2，栗冬梅1

目的 應(yīng)用實時高分辨率熔解曲線PCR技術(shù)建立特異性強、靈敏度高和穩(wěn)定性好快速檢測巴爾通體物種方法。方法 查找巴爾通體屬特有基因ssrA特異引物進行常規(guī)PCR擴增，隨后將擴增產(chǎn)物連接到pEASY?-T5 Zero克隆載體上制備標(biāo)準(zhǔn)品。優(yōu)化擴增反應(yīng)的退火溫度和引物濃度，評估實時高分辨率熔解曲線方法的特異性、敏感性及重復(fù)性，并與常規(guī)PCR進行比較。結(jié)果 優(yōu)化的退火溫度為60 ℃，引物濃度均為300 nmol/L。特異性實驗結(jié)果顯示只有巴爾通體物種擴增出熒光信號，且相對應(yīng)的熔解溫度值為81.05 ℃±0.31，陰性對照菌株均未見熒光信號和熔解曲線；敏感性實驗結(jié)果顯示在20 μL的反應(yīng)體系中，實時高分辨率熔解曲線方法檢測漢賽巴爾通體物種最低檢出限為3.82×101個拷貝，比常規(guī)PCR敏感性提高了100倍，此外也顯示出良好的線性關(guān)系和擴增效率，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999，E值分別為98.4%。重復(fù)性實驗結(jié)果顯示組內(nèi)和組間的變異系數(shù)值為0.30%～0.62%和0.29%～0.36%，在允許范圍內(nèi)。結(jié)論 建立的實時高分辨率熔解曲線PCR方法特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好，可快速地檢測鑒定巴爾通體物種，為巴爾通體所引起的貓抓病、戰(zhàn)壕熱、心內(nèi)膜炎、桿菌性血管瘤和卡瑞恩病等一系列疾病的早期快速診斷、監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查等研究提供有效手段。

高分辨率熔解曲線；巴爾通體；貓抓??；戰(zhàn)壕熱

巴爾通體(Bartonellaspp.)屬于變形菌綱、根瘤菌目、巴爾通體科、巴爾通體屬，是一群革蘭染色陰性、氧化酶陰性、營養(yǎng)條件要求苛刻、兼性細胞內(nèi)寄生的需氧桿菌，主要寄生在人、貓、狗和嚙齒動物等血管內(nèi)皮細胞和紅細胞內(nèi)，通過跳蚤、體虱和白蛉等傳播，可引起人類患有貓抓病、戰(zhàn)壕熱、桿菌性血管瘤、心內(nèi)膜炎和卡瑞恩病等疾病。盡管在自然界存在已久、分布廣泛，且有該病暴發(fā)流行，但人們對巴爾通體認知程度仍然有限，所引起的疾病也經(jīng)常被忽視。隨著新發(fā)傳染病的出現(xiàn)，目前已定義了27個種，引發(fā)疾病譜也相當(dāng)復(fù)雜，我國已經(jīng)把巴爾通體病定為14種新發(fā)傳染病之一。近年來，感染人類疾病的巴爾通體種類越來越多，共報道13種，有五日熱巴爾通體(B.quintana，Bq)、漢賽巴爾通體(B.henselae，Bh)、文森巴爾通體博格霍夫亞種 (B.vinsoniisubsp.berkhoffii，Bvb)、文森巴爾通體阿魯潘亞種(B.vinsoniisubsp.arupensis，Bva)、文森巴爾通體文森亞種(B.vinsoniisubsp.vinsonii，Bvv)、阿爾薩斯巴爾通體(B.alsatica，Ba)、伊麗莎白巴爾通體(B.elizabethae，Be)、克勒巴爾通體(B.koehlerae，Bk)、CandidatusB.mayotimonensis、桿菌樣巴爾通體 (B.bacilliformis, Bb)、格拉漢姆巴爾通體(B.grahamii)、克氏巴爾通體(B.clarridgeiae)和特利波契巴爾通體(B.tribocorum)[1-2]。

目前，對巴爾通體物種的檢測方法主要是分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測、常規(guī)PCR、實時熒光定量PCR和高分辨率溶解曲線技術(shù)((High-resolution melting analysis, HRM)檢測。該菌生長緩慢、營養(yǎng)條件要求苛刻而難于分離培養(yǎng)，一般應(yīng)用胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞培養(yǎng)基或腦心浸液血瓊脂中加入5%-10%的兔血、羊血或馬血(脫纖維抗凝)，在濕潤條件下，25-37 ℃培養(yǎng)7-14 d，甚至更長時間，沒有特征性，不能用于菌種鑒定。血清學(xué)檢測通常用IFA法和ELISA法檢測抗體[3]，Bh和Bq有市售的檢測試劑盒，Bvb國外僅有個別實驗室能夠進行，該方法在判讀結(jié)果時有一定的主觀性，靈敏度和特異性均不高，且容易與衣原體等其他微生物出現(xiàn)交叉反應(yīng)。常規(guī)PCR檢測存在引物結(jié)合缺乏特異性、實驗室污染和臨床樣品中PCR抑制物存在造成假陰性等，且在基因擴增后還需進一步瓊脂糖凝膠電泳測序來驗證，相對步驟繁瑣耗時。實時熒光探針PCR方法依據(jù)序列特異性探針區(qū)別物種，增加了特異性和靈敏度，但需要昂貴的探針，近年來在傳染病病原檢測上日漸普及，目前國外報道通過擴增ssrA基因建立實時熒光探針PCR方法檢測巴爾通體屬[4]，國內(nèi)本實驗室已建立了單重實時熒光定量PCR方法檢測Bh、Bq (尚未發(fā)表)和 Bvb[5]，其他實驗室也有報道采用TaqMan-MGB探針技術(shù)建立了檢測Bh和Bq單重實時熒光定量PCR方法[6-8]，根據(jù)HRM技術(shù)的特定熔解溫度值(Melting temperature,Tm)和熔解曲線建立檢測巴爾通體物種方法。

1 材料與方法

1.1 菌株和生物樣本DNA 巴爾通體基因組DNA包括Bh ATCC 49882、Bq ATCC VR-358、Bvb ATCC 51672、Bb、Bc ATCC 51734、Bva ATCC 700727、Bvv ATCC VR-152、Be ATCC 49927、Bg ATCC 700132、道志巴爾通體(B. doshiae, Bd)ATCC 700133和Bt CIP 105476；根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、人、貓、犬、兔、羊、鼠和蜱基因組DNA均為中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所媒介生物控制室保存。

1.2 主要儀器設(shè)備與試劑 實時熒光定量PCR儀，CFX96，BioRad；臺式高速離心機，5804R，Eppendorf；微量核酸濃度測定儀，NanoDrop-1000，Thermo Fisher Scientific。

QIAamp DNA Mini Kit購自QIAGEN公司，2×TransTaq-T PCR SuperMix和克隆試劑pEASY?-T5 Zero Cloning Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；MeltDoctorTMHRM Master Kit購自Applied Biosystems 公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司。

1.3 靶基因引物篩選與合成 查找相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)巴爾通體特有基因有16S-23S rRNA[9]和ssrA[4]，引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以Bh物種為例來檢測驗證該方法的敏感性、擴增效率和重復(fù)性。提取Bh標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 51672 TM DNA為模板，用上述引物做常規(guī)PCR擴增目的片段297 bp；PCR產(chǎn)物回收純化后連接到pEASY?-T5 Zero Cloning 載體上；將連接后載體導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆子，選取陽性菌落進行PCR鑒定，對鑒定正確的菌落搖菌提質(zhì)粒，作為繪制定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品。質(zhì)粒和含有重組子的陽性菌分別保存于-20 ℃和-70 ℃。

1.5 質(zhì)?？截悢?shù)濃度換算 Bh質(zhì)粒濃度通過核酸濃度測定儀測得為89.2 ng/μL。pEASY?-T5 Zero Cloning 載體的堿基數(shù)為3 953 bp，每個堿基的平均分子量為660 Da/bp。將所制備的質(zhì)粒濃度換算成拷貝數(shù)，其中每μL樣品中檢測基因拷貝數(shù)按照以下公式估算：樣品拷貝數(shù)=濃度ng/L×阿伏伽德羅常數(shù)×10-9/(660×重組質(zhì)粒堿基數(shù))。通過計算得出拷貝數(shù)濃度分別為1.91×1010拷貝/μL 。

1.6 反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù) 常規(guī)PCR反應(yīng)體系20 μL：10 μL 2×TransTaq-T PCR Super Mix，0.6 μL上、下游引物(10 μmol/L)，2 μL模板，去離子水補齊。擴增程序：94 ℃ 5 min，1個循環(huán)；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 24 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。

HRM 實時PCR反應(yīng)條件：反應(yīng)體系采用20 mL，Melt DoctorTM HRM Master Kit為10 mL，上、下游引物(10 mmol/L)別為0.6 mL，DNA模板DNA 1 mL，無核酸酶水補齊。擴增程序：第一步95 ℃預(yù)變性7 min，一個循環(huán)；第二步，95 ℃變性15 s，60 ℃退火溫度1 min，40個循環(huán)。熔解程序為：95 ℃變性30 s，70 ℃冷卻1 min，然后升溫至95 ℃(0.2 ℃采集一次熒光)。 使用伯樂CFX96實時熒光定量PCR儀器自帶的軟件CFX Manager software v.2進行分析。

常規(guī)PCR反應(yīng)體系20 μL：10 μL 2×TransTaq-T PCR Super Mix，0.6 μL上、下游引物(10 μmol/L)，2 μL模板，去離子水補齊。擴增程序：94 ℃ 5 min，1個循環(huán)；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 24 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.7 反應(yīng)條件優(yōu)化

1.7.1 退火溫度優(yōu)化 以Bh陽性對照質(zhì)粒DNA為模板，55 ℃～65 ℃進行梯度定量PCR，每個梯度溫度設(shè)置3個復(fù)孔，設(shè)置1個陰性對照孔。根據(jù)擴增反應(yīng)的循環(huán)閾值(Cycle threshold value，Ct)、擴增曲線的熒光信號強度和熔解曲線篩選最佳退火溫度。

1.7.2 引物濃度優(yōu)化 以Bh陽性對照質(zhì)粒DNA為模板，引物濃度為100 nmol/L、200 nmol/L、300 nmol/L、400 nmol/L和500 nmol/L，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，設(shè)置1個陰性對照孔。根據(jù)擴增反應(yīng)的Ct、擴增曲線的熒光信號強度熔解曲線熒光選擇最優(yōu)引物濃度。

1.8 敏感性分析 用10×倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(100～107拷貝/μL)作為模板進行 HRM實時熒光定量PCR，取模板2 μL引物濃度均為300 nmol/L來檢測該方法的敏感性。

1.9 特異性分析 HRM實時熒光PCR特異性分析：將11種巴爾通體標(biāo)準(zhǔn)菌株、21株國內(nèi)分離巴爾通體菌株、20株非巴爾通體細菌、犬、貓、人、鼠和蜱等的基因組DNA的濃度調(diào)整至大約1～10 ng/μL左右，取模板1 μL進行定量PCR檢測該方法的特異性。

2 結(jié) 果

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 退火溫度優(yōu)化 退火溫度為55.0 ℃、55.7 ℃、57.0 ℃、59.0 ℃、61.4 ℃、63.3 ℃、64.5 ℃和65.0 ℃，通過設(shè)置溫度梯度優(yōu)化退火溫度，結(jié)果其Ct值分別為24.34、23.37、22.17、21.06、20.63、23.21、27.20和30.78，實驗結(jié)果以產(chǎn)生Ct值最小和熒光吸收值最大兩者綜合指數(shù)最高為依據(jù)，且擴增曲線呈現(xiàn)經(jīng)典的“S”，選擇最優(yōu)退火溫度。通常情況下當(dāng)溫度足夠低時，可以保證引物同目的序列有效退火，但同時還要足夠的高溫度以減少非特異性結(jié)合。由圖1顯示各個溫度對實驗結(jié)果影響比較大，當(dāng)溫度過高或過低時，嚴(yán)重影響擴增，Ct值比較大。綜合考慮為了使實驗具有較高的特異性和保持酶的最佳聚合活性，選擇60 ℃為退火溫度，此時也獲得了理想擴增效果，擴增曲線呈現(xiàn)典型的“S”型。

2.1.2 引物濃度優(yōu)化 對引物濃度分別為100 nmol/L、200 nmol/L、300 nmol/L、400 nmol/L和500 nmol/L優(yōu)化結(jié)果進行分析比較，其Ct值均在20.43～21.88之間，引物濃度變化對結(jié)果影響不大。當(dāng)引物濃度為100 nmol/L 時，Ct值相對較大，熒光強度吸收值較低，熔解溫度峰值較低；當(dāng)引物濃度過高時容易出現(xiàn)非特異性擴增和引物二聚體形成。綜合考慮選擇最佳引物濃度為300 nmol/L，此時也獲得了理想的擴增效果，擴增曲線呈現(xiàn)典型的“S”型，熒光強度也比較高(圖2)。

圖1 HRM實時PCR檢測漢賽巴爾通體不同退火溫度的擴增曲線，圖中與Ct所對應(yīng)的溫度從左到右依次為61.4 ℃、59.0 ℃、57.0 ℃、55.7 ℃、55.0 ℃、63.3 ℃、64.5 ℃和65.0 ℃

Fig.1 Amplificattion curve under the different temperatures ofB.henselaeplasmid using HRM real-time PCRCtthe correspording trmperature from lrft fo right were 61.4 ℃,59.0 ℃,57.0 ℃,55.7 ℃,55.0 ℃,63.3 ℃,64.5 ℃ and 65.0 ℃

圖2 HRM實時PCR檢測漢賽巴爾通體不同引物濃度的擴增曲線

Fig.2 Amplification curve under the different concentration of the primers ofB.henselaeplasmid using HRM real-time PCR

圖3 HRM實時熒光定量PCR特異性檢測Fig.3 Result of specificity of HRM real-time PCR assay for the detection of Bartonella spp.

2.3 敏感性檢測 用10×倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(1.91×107～1.91×100拷貝/μL)模板2 μL，引物濃度為300 nmol/L檢測HRM實時熒光定量PCR方法的敏感性。試驗結(jié)果顯示進行實時熒光定量PCR，得到擴增曲線呈典型的S型，符合實時熒光定量PCR擴增曲線的標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線(見圖5)。在20 μL的反應(yīng)體系中，HRM實時熒光定量PCR方法檢測Bh質(zhì)粒最低檢測限分別為3.82×101個拷貝，擴增產(chǎn)物形成單一峰值，且無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)，空白對照沒有擴增信號。此外也顯示出良好的線性關(guān)系和擴增效率，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999，E值分別為98.4%； 常規(guī)PCR檢測這種物種檢測下限 為103拷貝級別，當(dāng)模板濃度為102拷貝/μL時，300 bp附近的條帶隱約可見，很難判斷結(jié)果，101和100拷貝/μL時在300 bp附近沒有可識別的目的片段，此外103拷貝/μL、102拷貝/μL、101拷貝/μL和100拷貝/μL、空白對照均出現(xiàn)了約100 bp的引物二聚體和非特異性擴增帶。重復(fù)實驗結(jié)果穩(wěn)定不變。(圖6)

由此可見，HRM實時熒光PCR方法比常規(guī)PCR敏感性提高了100倍。

2.4 重復(fù)性分析 重復(fù)性實驗結(jié)果顯示組內(nèi)和組

圖4 HRM實時熒光定量PCR檢測國內(nèi)分離的21株巴爾通體

Fig.4 Result of HRM real-time PCR assay for the detection of 21 isolated strainBartonellaspp. in China

圖5 HRM實時熒光定量PCR檢測漢賽巴爾通體質(zhì)粒敏感性分析的擴增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.5 Amplification curve and stendard curve curve based on the natural logarithm of plasmid concentrations &Ctvalues for HRM real-time PCR ofB.henselaeplasmid

Lane M: 100 bp ladder molecular weight marker; Lane 1-8: the concentration of reference plasmid ranging from 107to100; Lane 9 and 10: Blank control; Loading quantity: 5 μL.

圖6 利用ssrA引物常規(guī)PCR檢測漢賽巴爾通體不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒常規(guī)PCR電泳圖

Fig.6 Amplification for the different dilution of the reference plasmid ofB.henselaeplasmid using conventional PCR

間的CV值為0.30%～0.62%和0.29%～0.36%，在允許范圍內(nèi)。(表1)。

3 討 論

自從不飽和染料如Sybr Green I熒光染料出現(xiàn)，該染料廣泛應(yīng)用在實時定量PCR儀上監(jiān)測熔解曲線，主要用于區(qū)分片段大小和GC含量上差別較顯著的DNA序列。由于不飽和染料對PCR的抑制作用在實驗中使用濃度很低，遠低于將DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝飽和的濃度，加之染料本身的特性，在DNA雙鏈解鏈的過程中容易發(fā)生重排，造成結(jié)果失真，無法真實反映DNA熔解的情況，影響檢測的分辨率。近幾年來發(fā)明了一類新型的飽和染料如LC Green、LC Green Plus、SYTO 9和Eva Green等，有著更強的DNA結(jié)合能力和很低的抑制作用，在DNA解鏈過程中不會發(fā)生重排，有了更高的分辨率，加上儀器精密度的提高便出現(xiàn)了HRM。目前，該技術(shù)越來越多地應(yīng)用于物種檢測、突變掃描和基因分型等領(lǐng)域。根據(jù)不同病原體擴增產(chǎn)物長度、GC比值、熔解曲線和Tm值不同等來鑒定不同物種，已廣泛應(yīng)用于各種病毒及食源性致病菌如金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌的鑒定及分型等，具有快速、簡便、成本低、特異性高等優(yōu)點。鑒于巴爾通體可引起戰(zhàn)壕熱、CSD、桿菌性血管瘤、慢性淋巴結(jié)病、視神經(jīng)炎、心內(nèi)膜炎等一系列常見的疾病，嚴(yán)重影響到人類健康，造成衛(wèi)生經(jīng)濟負擔(dān)。因此有必要建立一種靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好快速檢測巴爾通體的方法，為巴爾通體所引起的一系列疾病的早期快速診斷、監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查等研究提供有效手段，進而方便對癥治療。

表1 HRM實時熒光定量PCR檢測漢賽巴爾通體組內(nèi)重復(fù)性Tab.1 Repeatabilities of intra- and inter-groups for HRM real-time PCR assay of B. henselas

本試驗基于HRM實時熒光PCR技術(shù)建立了一種根據(jù)特異性擴增曲線、Tm值和熔解曲線綜合指標(biāo)快速檢測巴爾通體的方法。首先選取巴爾通體屬特異引物ssrA，引物通過BLAST同源性比較分析以保證具有高度屬特異性，避免了利用熔解曲線分析檢測樣本出現(xiàn)非目標(biāo)菌株擴增曲線的問題，試驗數(shù)據(jù)表明該引物具有很好的特異性、擴增效率和線性關(guān)系。該方法靈敏度很高可檢測到39個拷貝，比常規(guī)PCR敏感性提高了100倍，重復(fù)性實驗組內(nèi)和組間的CV值分別為0.30%～0.62%和0.29%～0.36%，實驗穩(wěn)定性很好。結(jié)果檢測判斷依據(jù)為Ct值<40.0時，且熔解曲線的Tm值為81.05 ℃±0.31時，即為陽性，否則判定為陰性；檢測不到樣本Ct值時為陰性。本研究建立的HRM方法可在一次反應(yīng)中檢測出所有巴爾通體，在臨床中具有較高的應(yīng)用價值。

將本研究建立的HRM實時PCR與現(xiàn)有診斷方法比較可知HRM實時PCR方法無需電泳，無需合成昂貴的探針，且在監(jiān)測熒光強度的同時可以隨時對樣本進行結(jié)果判斷，檢測完后可直接進行后續(xù)實驗如測序等，實驗操作簡便，結(jié)果判讀更簡易，自動化程度高，整個過程均在封閉的環(huán)境中進行，避免了實驗室的污染，很少會出現(xiàn)假陽性假陰性的結(jié)果，但缺點與實時熒光探針法相比耗時，完成該擴增程序和熔解程序大約需要2 h。此外由于飽和染料剛上市不長久，成本比較貴。如果經(jīng)濟緊張時，也可以考慮用不飽和染料來代替飽和染料進行檢測。隨著科技的發(fā)展，有望飽和染料價格降低，將會在臨床檢測得到普及。與Morick D等[7-8]利用HRM方法分別擴增rpoB、gltA和ITS 3個基因，通過測序檢測巴爾通體的方法相比，本課題建立的方法在檢測巴爾通體屬層面上更方便，只根據(jù)Tm值即可確定是否為巴爾通體物種。

綜上所述，本研究建立的HRM 實時PCR法方法具有操作簡單、快速、特異性強、靈敏性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，為革蘭氏陰性細菌巴爾通體引起一系列疾病的早期快速診斷、監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查等研究提供一種更先進的檢測手段。

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[9]Fournier PE, Thuny F, Richet H, et al. Comprehensive diagnostic strategy for blood culture-negative endocarditis: a prospective study of 819 new cases[J]. Clin Infect Dis, 2010, 51(2): 131-140. DOI: 10.1086/653675

Establishment of a simple and rapid identification method forBartonellaspp. using high-resolution melting analysis

LIU Yun-yan1,2,SONG Xiu-ping1,LIU Qi-yong1,CHEN Zhong-ke2,LI Dong-mei1

(1.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasesPreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China;2.StateKeyLaboratoryofInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention/ChinaCDCKeyLaboratoryofSurveillanceandEarlyWarningonInfectiousDisease,CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases/WHOCollaboratingCenterforVectorSurveillanceandManagement,Beijing102206,China)

In this study, we aimed to develop a rapid, highly sensitive and specific assay, based on real-time PCR with high resolution melting (HRM) analysis, for identifying theBartonella. Without the need of any probe, the products were identified by HRM analysis after real-time PCR amplification using the specific primers ofssrA. The amplification products were cloned into pEASY-T5 Zero vector for preparation of theB.henselaestandard. The annealing temperature and the final concentration of primers were optimized. Specificity, sensitivity and reproducibility of the PCR system were assessed by 10 dilution series of theB.henselaereference plasmids. Results showed that the optimized annealing temperature was 60 ℃ and the primer concentration was 300 nmol/L. The HRM real-time fluorescence quantitative PCR assay showed a excellent specificity by detectingBartonellaspp. with theTmvalue of 81.05 ℃±0.31, and showed no cross reactivity with the non-Bartonellabacteria and the other animals. The sensitivity of detection of HRM real-time PCR was 3.82×101copies, per 20 μL PCR reaction, which was 100 times more sensitive than that of conventional PCR, and also reflected a good linearity and high efficiency, in which the correlation coefficientR2and E-value were 0.999 and 98.4%, respectively. The coefficients of variations (CV) from the intra- and inter-groups were in the range of 0.30%-0.62% and 0.29%-0.36%, respectively, which were acceptable. The established HRM real-time PCR assay has sufficient specificity, high sensitivity and good reproducibility for the detection ofBartonellaspp. in the clinical diagnosis, epidemiological survey and disease surveillance.

High Resolution Melting analysis;Bartonella; cat scratch disease(CSD); trench fever

s: Li Dong-mei, Email: lidongmei@icdc.cn; Chen Zhong-ke, Email:zhongkechen@sdu.edu.cn

國家科技重大項目(No.2012ZX10004219-002)資助

栗冬梅,Email:lidongmei@icdc.cn; 陳忠科,Email:zhongkechen@sdu.edu.cn

1.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室，北京 102206； 2.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所媒介生物控制室，傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室 / 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病監(jiān)測預(yù)警重點實驗室，感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心 / 世界衛(wèi)生組織媒介生物監(jiān)測與管理合作中心，北京 102206

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.008

R379

A

1002-2694(2015)11-1027-06

2014-12-26；

2015-04-15

Supported by the National Critical Project for Science and Technology of P. R. China (Grant No. 2012ZX10004219-002)