弓形蟲ROP16I/IIIDNA疫苗不能誘導小鼠有效的保護性免疫

周芹芝,李 曼，陳 鶴，都 建，羅慶禮，沈繼龍

弓形蟲ROP16I/IIIDNA疫苗不能誘導小鼠有效的保護性免疫

周芹芝1,2,李 曼1，陳 鶴3，都 建1，羅慶禮1，沈繼龍1

目的 利用ROP16I/III基因真核表達重組質粒免疫BALB/c雌性小鼠，檢測小鼠體液免疫和細胞免疫，評估ROP16I/III作為潛在的分子疫苗的價值。方法 克隆Chinese 1型弓形蟲ROP16I/III, 將其插入真核表達載體pEGFP-C2中構建重組質粒pEGFP-ROP16I/III，脂質體法轉染T293細胞并觀察體外表達。Western blotting分析鑒定。將36只SPF級小鼠隨機均分為：①PBS組；②空質粒組；③pEGFP-ROP16I/III組。每2周肌注免疫1次(100 μg/只)，共3次；于免疫前及每次肌注前1 d和末次免疫后2周收集小鼠血清，間接ELISA法檢測血清抗弓形蟲IgG。于末次免疫2周后取小鼠脾臟，分離淋巴細胞培養(yǎng)測細胞因子。剩余小鼠腹腔注射Chinese 1型弓形蟲 Wh3株速殖子1 000個/只，觀察小鼠攻擊感染后的存活時間和存活率。結果 真核表達載體構建成功，體外見到重組質粒pEGFP-ROP16I/III在T293細胞的表達；pEGFP-ROP16I/III末次免疫后血清中IgG水平及脾淋巴細胞細胞因子均無明顯升高(P>0.05)；攻擊感染后，免疫組小鼠比對照組的存活時間無延長(P>0.05)；生物信息學分析發(fā)現(xiàn)ROP16I/III缺乏線性B細胞表位。結論 Chinese1 型弓形蟲的ROP16I/III由于其分泌的定位和結構特點，不能誘導小鼠產生有效的抗Wh3株攻擊感染的免疫保護。

弓形蟲；ROP16I/III；分子疫苗

弓形蟲病(toxoplasmosis)是一種人獸共患病，嚴重危害人類健康和畜牧業(yè)生產，目前尚無特效藥物用來預防和治療弓形蟲感染。唯一用于綿羊接種的弓形蟲疫苗為熱敏感無毒株疫苗S48(ts-4)[1]。但是由于弓形蟲生活史各階段抗原成分復雜,目前尚無用于其他動物和人體的有效分子疫苗。研制安全有效的重組疫苗長期以來是弓形蟲病防治的研究熱點之一。DNA疫苗接種是將編碼抗原的基因插入載體質粒中構成重組體，直接接種機體，在接種部位攝取表達疫苗抗原分子，從而誘導機體產生抗感染免疫的有效途徑。在DNA疫苗的接種途徑中，直接肌注法被認為是目前最簡單有效的途徑之一。目前用于弓形蟲疫苗研究的蟲源性蛋白包括表膜蛋白SAGs、棒狀體蛋白ROPs，致密顆粒蛋白GRAs，和微線體蛋白MICs等[2-5]。ROPs是蟲體分泌型細胞器棒狀體(rhoptry)的分泌蛋白，除了ROP2和ROP8外，多數(shù)具有絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶活性，也是蟲株重要的毒力因子[6-7]。ROP16是由弓形蟲棒狀體分泌的一組與細胞內增殖和調節(jié)有關的效應分子，參與納蟲泡的形成，以抵抗宿主細胞內的殺傷。有研究報告，ROP16用于小鼠的免疫可誘導抗感染的免疫力[8,9]。不同弓形蟲基因型具有ROP16的多態(tài)性。我國流行的優(yōu)勢弓形蟲基因型為Chinese 1[10-12]，其ROP16的多態(tài)性為ROPI/III。為了深入探討ROP16的潛在疫苗應用價值，本研究克隆了Chinese 1基因型Wh3 蟲株的ROP16I/III，并構建了真核表達質粒，對小鼠進行了重組ROP16I/III(rROP16I/III)的免疫保護性的研究?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 蟲株、菌種、質粒及細胞 弓形蟲Wh3 株(Chinese 1 型)，大腸桿菌DH5α，真核表達載體pEGFP-C2，HEK293T(人胚腎細胞株)細胞均由本實驗室保存。

1.2 實驗動物 SPF級BALB/c雌性小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，經(jīng)安徽醫(yī)科大學試驗動物倫理委員會審批(No.2014012)。

1.3 主要試劑 質粒提取試劑盒GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit購自康為世紀公司(中國)；HRP標記的羊抗鼠IgG，IgG1和IgG2a購自Invitrogen公司；FBS(Gibco，美國)；SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒(碧云天，中國)；預染蛋白markers 和ECL底物發(fā)光檢測試劑盒(Fermentas，美國)；逆轉錄試劑盒(Thermo，美國)；DMEM高糖培養(yǎng)基，轉染試劑Lipofectamine 2000，Opti-MEM(Gibco公司，美國)；SYBR(Takara, 中國)；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒與AxyPrep質粒小量提取試劑盒(Axygen公司，中國)；細胞因子(IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ)ELISA試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.4 真核表達重組質粒pEGFP-ROP16I/III的構建與鑒定 根據(jù)GenBank中弓形蟲ROP16I/III的表達序列設計引物：上游引物 P1:5′-GAAGATCTAT GAAAGTGACC ACGAAAGA-3′,劃線序列為BgⅢ酶切位點；下游引物P2:5′-CGAGCTCCAT CCGATGTGAAGAAAG-3′, 劃線序列為SacI酶切位點。以提取的Wh3蟲株的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR產物電泳鑒定、回收和純化，并克隆至同樣經(jīng)Bgm和SacI雙酶切的真核表達載體pEGFP-C2上，得到的陽性重組克隆pEGFP-ROP16I/III進行酶切、測序和鑒定。

1.5 pEGFP-ROP16I/III轉染及鑒定 鑒定正確后提取質粒，轉染HEK293T細胞。24孔板培養(yǎng)HEK293T細胞，轉染前1 d換為無血清 DMEM 培養(yǎng)基， 在500 μL無抗生素的DMEM培養(yǎng)基中接種2×105細胞,待細胞生長至90%～95%密度時開始轉染,6 h后移去轉染液，加DMEM完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后,在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，分析重組質粒pEGFP-ROP16I/III在HEK293T細胞中的表達。

1.6 重組質粒在免疫小鼠體內表達 提取免疫局部的小鼠后腿肌肉組織RNA，逆轉錄成cDNA后PCR擴增ROP16I/III目的片段,鑒定其在體內的表達。

1.7 弓形蟲裂解抗原的制備 弓形蟲在HFF細胞中培養(yǎng)。待蟲體即將HFF細胞全部裂解時，離心收集速殖子。將速殖子懸液置-20 ℃反復凍融3次，置于冰上超聲破碎。經(jīng)BCA蛋白濃度測定試劑盒對速殖子裂解液進行蛋白質濃度測定，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 動物分組及免疫 36只SPF級BALB/c雌性小鼠隨機分成3組，每組12只。 第1組為實驗組(肌肉注射pEGFP-ROP16I/III)；第2組為空質粒對照組；第3組為PBS對照組。重組質粒提取純化后用PBS稀釋至100 μg/100 μL。實驗組小鼠經(jīng)肌肉注射100 μL/只, 空質粒對照組和空白對照組用同劑量免疫,每2周肌肉注射免疫1次，共免疫3次。

1.9 免疫小鼠抗體測定 免疫前及每次免疫前1 d和末次免疫后2周，小鼠尾靜脈采血收集血清，間接ELISA檢測血清抗弓形蟲IgG。用弓形蟲 RH 株速殖子裂解液抗原包被96孔酶標板4 ℃過夜， BSA 37 ℃封閉2 h。 鼠血清1∶50稀釋作為一抗, HRP標記的抗小鼠IgG作為二抗,1 h后底物顯色，終止反應后用酶標儀測定各孔吸光度值。免疫鼠血清 OD值/陰性對照 OD>2為陽性。

1.10免疫小鼠細胞因子的測定 末次免疫2周后，每組取3只小鼠，分別制備脾細胞懸液，加入淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，調整濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，加入刺激物37 ℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24 h、72 h和96 h后收集細胞培養(yǎng)上清，置于-80 ℃保存，ELISA試劑盒檢測細胞因子。

1.11 攻擊感染實驗 末次免疫兩周后，每只小鼠經(jīng)腹腔接種Wh3速殖子103個，記錄一般狀況和存活時間。

1.12 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，用T-test、ONE-WAY ANOVA分析，以α=0.05為水準，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 pEGFP-ROP16I/III表達載體的構建與鑒定 以提取的重組質粒pEGFP-ROP16I/III為模板進行PCR擴增,電泳后顯示一條分子量約2 124 bp的條帶,說明重組表達質粒pEGFP-ROP16I/III初步構建成功(圖1)。

M: DNA分子量標準(bp)；1 轉染重組質粒pEGFP-ROP16I/III細胞組；2 轉染空質粒pEGFP-C2組；3 空白對照組

M: molecular weight (bp); 1: cells transfected with recombinant pEGFP-ROP16I/III; 2: cells transfected with control plasmids; 3: cells without plasmids transfection.

圖1 重組載體pEGFP-ROP16I/III經(jīng)PCR擴增的ROP16I/III片段

Fig.1 PCR amplification ofROP16I/IIIfrom template recombinant pEGFP-ROP16I/III.

2.2 pEGFP-ROP16I/III細胞內表達的檢測 質粒pEGFP-ROP16I/III體外轉染HEK293T細胞，培養(yǎng)24 h后,在熒光顯微鏡下見到綠色熒光,同時未轉染質粒的HEK293T細胞觀察不到綠色熒光。雖然pEGFP-ROP16I/III轉染效率不及空白質粒，但是與對照組相比，表明重組質粒在真核細胞內能有效表達(圖2)。

A:轉染重組質粒pEGFP-ROP16I/III；B:轉染空質粒pEGFP-C2；C，空白對照

A: cells transfected with recombinant pEGFP-ROP16I/III;B: cells transfected with control plasmids; C: cells without plasmids transfection.

圖2 重組質粒pEGFP-ROP16I/III轉染HEK293T后目的基因表達的檢測

Fig.2 Fluorescent detection of theROP16I/IIIgene expression in transfected HEK293T cells

2.3 重組質粒在免疫小鼠體內的表達 提取小鼠后腿肌肉組織總RNA，逆轉錄成cDNA后PCR擴增ROP16I/III目的片段。結果可見與目的片段大小(2 124 bp)位置一致的條帶(圖3)，證明體內有ROP16I/III的mRNA水平轉錄。

2.4ROP16I/III的生物信息學分析 Chinese 1 基因型蟲株的ROP16氨基酸序列不同于II型蟲株(ROP16II)而與I型/III型蟲株一致(ROP16I/III)。亦即，其ROP16I/III第503位氨基酸為亮氨酸(L)而非絲氨酸(S)，見圖4 A。ROP16I/III的編碼序列采用Bepipred Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/) 軟件進行B細胞表位分析，結果見到，ROP16I/III缺乏線性B細胞表位(見圖4 B)。ROP16I/III的三維空間結構模型見圖5。

M：DNA分子量標準(bp)；1：小鼠接種局部組織；2:遠離接種局部的組織

M: DNA molecular weight(bp); 1: local tissues of vaccinated mouse; 2: adjacent tissues of the location of vaccination.

圖3 RT-PCR鑒定重組質粒在小鼠肌肉組織表達

Fig.3 Identification ofROP16I/IIIexpression in the muscles of mouse by RT-PCR

2.5 免疫小鼠血清特異性抗ROP16I/IIIIgG抗體的檢測 最后一次免疫小鼠后，ELISA檢測小鼠血清IgG，如圖6所示：與對照組相比，實驗組小鼠未能產生特異性抗體，在450nm處OD值未見明顯差異(P>0.05)。

檢測小鼠血清中IgG1和IgG2a的水平，如圖7所示，實驗組和對照組的IgG1和IgG2a含量亦無顯著變化(P>0.05)。

A：Chinese 1基因型弓形蟲ROP16多態(tài)性特征為ROP16I/III503L(第503位氨基酸為亮氨酸)；B：ROP166I/III線性B細胞表位預測(示缺乏B細胞表位)

A: polymorphicROP16I/III,showing leucine (L) at amino acid 503; B: B epitope prediction ofROP16I/III, showing lack of B epitope in ROPI/III.

圖4ROP16I/III的生物信息分析

Fig.4 Bioinformatic analyses ofROP16I/III

2.6 免疫小鼠細胞免疫的檢測 免疫小鼠在末次免疫后取小鼠脾細胞，制備脾細胞懸液，加入相對應的刺激物培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，經(jīng)ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)試驗組IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ與對照組之間無差異(表1)，P>0.05，無統(tǒng)計學意義。

2.7 攻擊感染免疫保護效果 3組小鼠經(jīng)腹腔接種感染103個Wh3速殖子，均未能耐受攻擊感染，于第3 d開始，所有小鼠出現(xiàn)活動減少、豎毛、弓背、飲食減少等表現(xiàn)；攻擊后第8 d時3組小鼠均開始死亡；第10 d全部死亡。重組質粒組未能延長小鼠壽命(P>0.05)(圖8)。說明ROP16I/III的DNA疫苗未能成功誘導機體產生抗攻擊感染的免疫保護作用。

圖5ROP16I/III的3D結構(綠色箭頭所指為503L位點)

Fig.5 Three dimensional structure ofROP16I/III, indicating leucine (L) at amino acid 503 (arrow)

圖6 pEGFP-ROP16I/III質粒免疫BALB/c小鼠血清抗ROP16I/III總IgG抗體

Fig.6 Total seral IgG antibodies againstROP16I/IIIin mice immunized with pEGFP-ROP16I/III

圖7 pEGFP-ROP16I/III質粒免疫小鼠，血清抗體IgG1和IgG2a的檢測

Fig.7 IgG1 and IgG2 antibodies againstROP16I/IIIin mice immunized with pEGFP-ROP16I/III

圖8ROP16I/IIIDNA免疫小鼠經(jīng)103個Wh3速殖子攻擊感染后的生存時間

Fig.8 Survival time of mice immunized with pEGFP-ROP16I/IIIfollowed by challenge with 103tachyzoites ofToxoplasmaWh3 virulent strain

表1 pEGFP-R0P16I/III質粒免疫小鼠脾細胞分泌的細胞因子檢測(P>0.05)Tab.1 Cytokines detection in the splenocytes of mice immunized with pEGFP-ROP16I/III and control (P>0.05)

3 討 論

目前，唯一在歐洲和新西蘭注冊用于綿羊接種的弓形蟲疫苗為減毒活疫苗S48(熱敏蟲株)[13]?；钕x疫苗雖不能在體內增殖，但是有轉變?yōu)榘业娘L險而不適用于人體。近年有關弓形蟲以及其他頂復原蟲(Apicomplexan)的表膜抗原和分泌抗原作為候選疫苗分子的研究較多。在蛋白質疫苗中，有報告認為[14]，只有弓形蟲的全蟲裂解抗原(而非是若干重組抗原的混合物)才能誘導小鼠產生免疫保護力，表現(xiàn)為脾細胞高表達IFN-γ，巨噬細胞分泌高水平的iNOS和NO，小鼠腦內包囊較少。

弓形蟲棒狀體(rhoptry)位于蟲體頂端復合器，一般含8～12個。蟲體入侵宿主細胞后，棒狀體分泌一系列具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase)活性的棒狀體蛋白(ROPs)。ROPs家族成員眾多,目前已經(jīng)鑒定出30多個，其編碼基因位于弓形蟲第VIIa染色體上，在細胞入侵時蟲體分泌的ROPs與前端表膜融合，有助于蟲體入侵宿主細胞[15]。在宿主細胞內，ROPs主要定位于納蟲泡膜(parasitophorous vacuole membrane, PVM)[16]，是弓形蟲調控宿主細胞的重要效應分子，也是蟲體逃避巨噬細胞清除的重要機制。因此ROPs家族的鑒定和功能描述被認為是弓形蟲生物學研究的一個重大突破[17]。Garcia 等曾試用弓形蟲棒狀體復合粗抗原接種家豬，雖然見到抗原可誘導豬對III型蟲株VEG卵囊感染的部分免疫保護(腦內包囊減少)，但是對急性期感染無保護作用。其原因可能是皮下接種抗原不能提供腸粘膜的免疫保護[18]。用相同抗原接種貓，結果3只貓中的2只排卵囊數(shù)目減少。但是由于動物數(shù)量少同樣難以判斷疫苗的保護力[19]。棒狀體蛋白中的ROP2的DNA疫苗可在C3H小鼠提供部分免疫保護，但在C57BL/6 和BALB/c 小鼠則未見有任何作用[20]。同樣的結果見于Leyva 的報道[21]。作者采用ROP2的DNA疫苗在3個小鼠品系(CBA/J, C57BL/6, BALB/c),進行了測試。結果未見對于RH攻擊感染的任何保護力。

ROP16為ROPs家族的重要成員,被認為是弓形蟲重要的毒力相關因子。弓形蟲接觸細胞后10分鐘,在受染細胞的細胞核內便可以檢測到ROP16。弓形蟲在入侵宿主細胞時,會分泌并釋放ROP16到宿主細胞質中,然后ROP16被核定位信號(nuclear localization signals, NLS)運輸至細胞核內,完成細胞核內的定位并發(fā)揮功能,這在弓形蟲特異性蛋白中非常罕見[16-17]。

本研究克隆表達了流行我國的優(yōu)勢基因型 Chinese 1 弓形蟲Wh3株ROP16I/III編碼序列。以此構建pEGFP-ROP16I/III重組質粒，體外轉染HEK293T細胞見到目的蛋白的表達；質粒接種BALB/c后，檢測到ROP16I/III的mRNA在體內的轉錄。給與免疫小鼠經(jīng)腹腔攻擊感染W(wǎng)h3株速殖子103個。結果見到，雖然接種和表達成功，但是免疫小鼠未出現(xiàn)明顯的體液和細胞介導的免疫應答，且對攻擊感染缺乏有效的免疫保護。感染鼠的臨床表現(xiàn)與存活時間與免疫組相比未見顯著差異。

國內有報告，用pVAX-ROP16質粒免疫昆明小鼠，可以誘導出淋巴細胞的增殖、高滴度抗體、IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10水平升高，小鼠攻擊感染后存活時間延長，提示ROP16具有疫苗研究價值[8]；用ROP16和GRA7構建融合表達質粒肌注免疫昆明小鼠，可誘導高滴度的IgG抗體和IFN-γ， CD8+細胞比例升高，小鼠存活時間延長[9]。然而有趣的是，Jensen 等應用II型蟲株的ROP16轉基因弓形蟲(Strain II+ROP16I)免疫C57BL/6J小鼠，結果見到，只有內源性的GRA15II和插入的ROP16I共同表達的基礎上，才能誘導小鼠對于經(jīng)口感染的免疫保護力，表現(xiàn)為小鼠產生了對1 000個PRU包囊和100個ME49株包囊攻擊感染后的100%的保護力[22]。最近， Alvarez 等[17]發(fā)現(xiàn)，人體與動物感染(肉類)的弓形蟲的ROP16具有顯著的多態(tài)性差異。前者多為強毒的ROP16(ROP16I);而后者全部為弱毒的ROP16(ROP16II)。強毒的ROP16I因為缺乏線性B細胞表位而失去免疫原性，難以(僅10.5%)誘導小鼠產生特異性抗體。本研究與該作者結果相一致。

本實驗采用我國Chinese 1 型弓形蟲的多態(tài)性ROP16I/III的DNA疫苗免疫小鼠，雖然在體內獲得了真核表達產物，但未見誘導小鼠的顯著性免疫保護力。其原因可能是：①ROP16主要是蟲體入侵后分泌在宿主細胞質內，構成納蟲泡膜的成分參與蟲體的免疫逃避和宿主的免疫調節(jié)，難以暴露并有效刺激宿主產生抗蟲免疫；②毒力因子ROP16I/III缺乏線性B細胞表位，這一結構特點難以誘導出高水平的特異性抗體；③相同疫苗在不同小鼠品系的結果差異較大，本實驗采用了對弓形蟲高度敏感的BALB/c小鼠，結果與Vercammen的報告一致。為了真實地反應出ROP16I/III的疫苗效果，本研究的質粒構建未采用細胞因子佐劑的融合表達，攻擊感染采用了毒力較強的Wh3株而非是II型成囊株。由于我國流行的這一優(yōu)勢基因型弓形蟲Wh3蟲株兼有II型和I型的主要效應分子多態(tài)性特點，深入探討其他效應分子的潛在疫苗價值仍然具有十分重要的意義。

4 結 論

我國流行的優(yōu)勢基因型Chinese 1的多態(tài)性ROP16I/III難以誘導實驗小鼠產生高滴度抗體和Th1應答，不能為BALB/c小鼠提供有效的免疫保護力。

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Recombinant eukaryotic plasmid ofROP16I/IIIfailed to provide efficient protection against toxoplasmosis in BALB/c mice

ZHOU Qin-zhi1,2,LI Man1,CHEN He3,DU Jian1,LUO Qing-li1,SHEN Ji-long1

(1.DepartmentofParasitology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory,theCentralHospitalofCTCEGROUP，Hefei230023,China；3.DepartmentofBiochemistry,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

To construct the recombinant eukaryotic expression plasmids ofToxoplasmaROP16I/III, and to assess the immune protection in BALB/c mice induced byROP16I/IIIDNA vaccine,T.gondiiROP16I/IIIcoding gene obtained by PCR amplification was inserted into the eukaryotic expression vector pEGFP-C2 to generate recombinant pEGFP-ROP16I/III. T293 cells were transfected by Liposome methodinvitroand the fusion protein expression was identified by Western blotting. Thirty-six mice were randomly divided into 3 groups with 12 in each: PBS control group; empty plasmid group; and pEGFP-ROP16I/IIIgroup, respectively. Immunization was completed in each mouse by intramuscular injection once 2 weeks for 3 times. Sera at each time point were collected for detection of antibodies againstToxoplasmaby indirect ELISA. After two weeks of the last immunization, mouse splenocytes were harvested and cultured for tests of cytokines in the supernatant. The remaining mice were injected with 1 000 Wh3 tachyzoites for each, followed by observation of survival time and mortality of the animals. The recombinant eukaryotic expression vector of pEGFP-ROP16I/IIIwas successfully generated and efficient expressions were noted both in the transfected T293 cells and in the muscles in which the plasmid vaccine was given. All vaccinated mice, however, did not present the increased IgG antibody titers and cytokine levels after pEGFP-ROP16I/IIIimmunization. Correspondingly, no difference was seen of either survival or mortality of the animals compared with the control. Our conclusion is thatToxoplasmaROP16I/IIIDNA vaccine failed to provide BALB/c mice with efficient immune protection against virulent tachyzoites challenge due to its inaccessibility to host immune components and its lack of linear B epitope.

Toxoplasmagondii;ROP16I/III; DNA vaccine

Shen Ji-long, Email: shenjilong53@126.com

國家自然科學基金(No.81471983)資助；國家“973”計劃項目(No. 2010CB530001)資助

沈繼龍，Email: shenjilong53@126.com

1.安徽醫(yī)科大學病原生物學教研室，安徽省人獸共患病重點實驗室，安徽病原生物學省級實驗室，合肥 230032; 2.中鐵四局集團中心醫(yī)院檢驗科，合肥 230000; 3.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，合肥 230032

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.005

R382

A

1002-2694(2015)11-1010-07

2015-06-17；

2015-08-12

Supported by the Funded by the National Natural Science Foundation of China ( No. 81471983); the National Basic Research Program of China (973 Project, No.2010CB530001)