新型苯并噻唑衍生物YLT322誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡作用及機(jī)制研究

易曉紅，宋雪皎，賀玉萍，高添桃，雷倩，余洛汀

·藥理毒理·

新型苯并噻唑衍生物YLT322誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡作用及機(jī)制研究

易曉紅1,2，宋雪皎1，賀玉萍2，高添桃1，雷倩1，余洛汀1

目的：YLT-322是本實(shí)驗(yàn)室合成的一種新型的苯并噻唑衍生物,已有文獻(xiàn)證實(shí)其可以通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡,對(duì)多種癌細(xì)胞都有效果。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)一系列生物實(shí)驗(yàn)來(lái)考察YLT-322對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的作用。方法：作者對(duì)多種癌細(xì)胞進(jìn)行初篩,篩選出兩種效果較好的結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn),平板克隆形成,Hoechst等實(shí)驗(yàn),以證實(shí)YLT-322對(duì)結(jié)直腸癌有良好的抑制作用。結(jié)果：YLT-322實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的細(xì)胞凋亡明顯增多，且與劑量和作用時(shí)間成正比。說(shuō)明YLT-322的確對(duì)結(jié)直腸癌有抑制作用。結(jié)論：YLT-322對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡的作用，作為一個(gè)新型的小分子抑癌藥物,具有很大的開發(fā)價(jià)值。

苯并噻唑衍生物；YL-T322；結(jié)直腸癌；凋亡；細(xì)胞毒性試驗(yàn)；平板克?。籋oechst

目前,據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),結(jié)直腸癌已成為世界男性第三位、女性第二位高發(fā)的惡性腫瘤。近年來(lái)，中國(guó)的結(jié)直腸癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，增長(zhǎng)速度迅猛，中國(guó)已經(jīng)是絕對(duì)數(shù)和相對(duì)數(shù)都高發(fā)的結(jié)直腸癌大國(guó)。目前臨床上用于治療晚期癌癥的化療藥物常為傳統(tǒng)的細(xì)胞毒類化療藥物，總體上效果不佳，且毒副作用較大。因此，發(fā)現(xiàn)新型抗腫瘤藥物迫在眉睫。苯并噻吩及其衍生物是一類重要的有機(jī)合成中間體，尤其是衍生物具有多種生物活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域有很重要的作用。近年來(lái)，其抑癌作用得到越來(lái)越多的關(guān)注。YLT322是本實(shí)驗(yàn)室合成的一種新型的苯并噻唑衍生物，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其可以通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，對(duì)多種癌細(xì)胞都有效果。本研究選定兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行一系列藥理實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明YLT-322能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，具有很好的開發(fā)前景。

1 材料

1.1 儀器

純水儀（ EASYpure UF 07412,Millipore公司）；高效液相色譜儀（HPLC） （Waters Alliance HPLC,Waters公司）；全自動(dòng)洗片機(jī) （MXP 102, Kodak公司）；層流超凈工作站（ NUAIR，SANYO公司）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 （3111，Thermo公司）；熒光倒置顯微鏡 （IX50,Olympus

公司）；普通光學(xué)顯微鏡 （CHS, Olympus公司）；高速離心機(jī)（ Centrifuge 5415C, Eppendorf公司）；低速離心機(jī) （Megafuge 1.0, Heraeus公司）；-80℃冰箱 （SANYO公司）；恒溫培養(yǎng)箱（ CO2Incubator, SANYO公司）；高壓滅菌鍋（LaboAutoclave,SANYO公司）；pH計(jì)（ pH meter 345 Coring公司）；流式細(xì)胞儀（ ESP Elite, Beckman Coulter公司）；蛋白質(zhì)電泳及電轉(zhuǎn)移裝置（ Mini PROTEAN 2&3 Cell, BIO-RAD公司）；臺(tái)式酶標(biāo)儀（ SpectraMax M5, Molecular Devices公司）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（ Costa，Corning公司）；移液器（Thermo公司）。

1.2 藥品及主要試劑

YLT322（本實(shí)驗(yàn)室自主合成），YLT-322是由本實(shí)驗(yàn)室（生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）自主合成的一種苯并噻唑衍生物，其結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 YLT-322結(jié)構(gòu)式

RPMI-1640 （美國(guó)Gibico BRL公司）；DMEM（美國(guó)Gibico BRL公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)（美國(guó)Sigma公司）；二甲基亞砜(DMSO) （美國(guó)Sigma公司）；0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Gibico BRL公司）；Hoechst33342（碧云天公司）；胎牛血清（FBS） （美國(guó)Gibico BRL公司）；結(jié)晶紫染料（國(guó)Sigma公司）。

1.3 細(xì)胞株

1.3.1 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620：來(lái)自美國(guó)模式菌種收集中心（American Type Culture Collection, ATCC, Accession No.CCL-247），本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3.2 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480：來(lái)自美國(guó)模式菌種收集中心（American Type Culture Collection, ATCC, Accession No.CCL-247），本實(shí)驗(yàn)室保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 MTT法細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

SW620,SW48兩種細(xì)胞鋪96孔板，10000/孔，5000/孔，3000/孔各一板。用YLT322(已用二甲基亞砜(DMSO)配成10 mmol．L-1的初始濃度)處理，DMEM培養(yǎng)基對(duì)半稀釋，最后配成濃度分別為10、 5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μmol．L-1，作用時(shí)間為24 h，48 h，72 h，留1組不加藥作為對(duì)照。加入10 μL MTT（5 mg．mL-1），37度孵育2 h，加入150 μLDMSO約15分鐘，待甲瓚全部溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，計(jì)算抑制率。結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 SW620細(xì)胞毒性試驗(yàn)

圖3 SW480細(xì)胞毒性試驗(yàn)

圖2和圖3可以看出，在加藥后24 h和48 h，隨著濃度的增加,YLT-322對(duì)細(xì)胞有明顯的抑制增殖作用,但加藥后72小時(shí)，隨著YLT-322濃度和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞的抑制率較低，由此可知YLT-322對(duì)SW620和SW480有濃度依賴性和時(shí)間依賴性，說(shuō)明YLT-322對(duì)SW620和SW480有促進(jìn)凋亡的作用，且在48h左右作用效果最好。另外，低濃度偶可會(huì)出現(xiàn)抑制率為負(fù)值的情況，原因可能是藥物本身的特點(diǎn)，和作用時(shí)間有關(guān)，或者是邊緣效應(yīng)。

2.2 平板克隆形成

SW620, SW480細(xì)胞鋪6孔板，每孔300個(gè)，第2天用YLT-322處理，濃度依次為4、2、1、0.5、0.25 μmol．L-1，留1孔不加藥作為對(duì)照。處理時(shí)間為14天左右，中間4天更換一次培養(yǎng)基。用PBS洗兩次，多聚甲醛固定十分鐘，結(jié)晶紫染色。結(jié)果見圖4和圖5。

圖4 SW480平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

圖5 SW620平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

從圖4和圖5可看出，隨著YLT-322濃度的降低，細(xì)胞克隆數(shù)量越來(lái)越多，說(shuō)明藥物對(duì)細(xì)胞有良好的抑制增殖的作用。

2.3 Hoechst

SW620, SW480細(xì)胞6孔板做細(xì)胞爬片，每孔1.0×105個(gè)，第二天用YLT-322處理，濃度依次為4、 2 、1 μmol．L-1（細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中， 0.5和0.25 μmol．L-1對(duì)細(xì)胞抑制率極低，沒必要再做實(shí)驗(yàn)）,留1孔不加藥作為對(duì)照。處理48小時(shí)，hoechst 33342染色，取出爬片 ，熒光倒置顯微鏡觀察。結(jié)果見圖6和圖7。

圖6 SW620Hoechst觀察

圖7 SW480Hoechst觀察

Hoechst是一種DNA染料，可使細(xì)胞核著色，是測(cè)凋亡的經(jīng)典方法。正常細(xì)胞的細(xì)胞核染色均勻，熒光強(qiáng)度低，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核固縮、碎裂，細(xì)胞膜內(nèi)陷，熒光強(qiáng)度較高。圖6和圖7可看出高濃度的組細(xì)胞核有碎裂，亮度較高，出現(xiàn)凋亡小體，證明YLT-322可促進(jìn)此兩種癌細(xì)胞凋亡。

3 討論

YLT-322是本實(shí)驗(yàn)室自主合成的抗癌新藥，已有前期實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)肝癌有很好的活性，并且已申請(qǐng)專利。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明此化合物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞作用也很好，但由于時(shí)間所限，并未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，相信在不久的將來(lái)，YLT-322將成為抗癌家族的重要一員，發(fā)揮其應(yīng)有的作用，為癌癥治療帶來(lái)新希望。

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（責(zé)任編輯：陳思敏）

Effect and mechanism of a novel Benzothiazole derivative YLT322 induce apoptosis in colorectal cancer cell

/YI Xiaohong1,2, SONG Xue-jiao1, HE Yu-ping1, GAO Tian-tao1, LEI Qian1, YU Luo-ting1// (1. State Key Laboratory of Biological Treatment of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan; 2. Basic Medical College of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:YLT-322 was a new benzothiazole derivatives synthesized in our laboratory. There were literature reported that it could induce apoptosis in HepG2 via mitochondrial pathway. And it had effects on a variety of cancer cells. This experiment meant to investigate the effect of YLT-322 on colorectal cancer cells by a series of biological experiments.Method:Many kinds of cancer cells were screened. Two colorectal cancer cells were selected to carry out toxicity test, plate clone formation, Hoechst experiment to confirm that YLT322 had good inhibition effect on colorectal cancer.Result:Experimental group treated with YLT-322 signifcantly increased apoptotic cells compared with control group. And the effect of YLT-322 was proportional to the dose and duration time which confrmed the inhibition of YLT-322 on colorectal cancer.Conclusion:YLT-322 induce apoptosis in colorectal cancer cells. It has great value of development as a novel small molecule anti cancer drug.

Benzothiazole derivative YLT322; colorectal cancer; apoptosis; cell toxicity test; plate clone formation; Hoechst

R 73-3

A

1674-926X(2015)02-020-03

1.四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川成都 611137

易曉紅，女，32歲，成都中醫(yī)藥大學(xué)講師，在讀碩士研究生

Tel:13540667372 Email:13540667372@163.com

余洛汀，男，四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，博士生導(dǎo)師 Email:luodyu@163.com

2015-01-26