長期遞增負(fù)荷運(yùn)動對胸腺細(xì)胞凋亡及其細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的影響

張馨蕾，郝選明，阮 洋，覃 飛

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長期遞增負(fù)荷運(yùn)動對胸腺細(xì)胞凋亡及其細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的影響

張馨蕾1，郝選明2，阮 洋3，覃 飛2

目的：觀察6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中，大鼠胸腺結(jié)構(gòu)、胸腺細(xì)胞凋亡蛋白、胸腺細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的變化特征。方法：雄性SD大鼠80只隨機(jī)分為安靜組和運(yùn)動組，運(yùn)動組進(jìn)行6周遞增負(fù)荷跑臺運(yùn)動，分別于第0、2、4、6周運(yùn)動完成后通過HE染色觀察大鼠胸腺組織形態(tài)，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)測定胸腺細(xì)胞凋亡蛋白bax、bcl-2及細(xì)胞周期蛋白cyclinE、cyclinB1與細(xì)胞周期抑制蛋白p21的表達(dá)。結(jié)果：1)大鼠胸腺細(xì)胞密度下降，皮、髓質(zhì)融合，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞并出現(xiàn)脂肪細(xì)胞及血細(xì)胞；2)與0周組相比，2周組、6周組Bax/Bcl-2比值均顯著增加(P<0.01)；與2周組相比，4周組、6周組顯著減少(P<0.01)；6周組較4周組顯著增加(P<0.01)；3)細(xì)胞周期G1/S期調(diào)控蛋白cyclinE表達(dá)0～2周上升(P>0.05)，4周時較0、2周急劇下降(P<0.01)，6周較4周顯著提高(P<0.05)；細(xì)胞周期抑制蛋白p21表現(xiàn)出2周時顯著上升(P<0.01)，4周時下調(diào)(P>0.05)，6周略有回升(P>0.05)的變化趨勢，4、6周p21表達(dá)量較2周差異非常顯著(P<0.01)；G2/M期調(diào)控蛋白cyclinB1表達(dá)呈先上升后下降的變化趨勢，差異不具有顯著性(P>0.05)。結(jié)論：6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中，大鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)發(fā)生漸行性破壞；Bax/Bcl-2比值呈現(xiàn)上升、下降再上升的變化特征，大鼠胸腺細(xì)胞凋亡增加以Bcl-2的變化為主導(dǎo)；大鼠胸腺細(xì)胞周期G1/S期調(diào)控蛋白較G2/M期調(diào)控蛋白受遞增負(fù)荷運(yùn)動影響更顯著。長期遞增負(fù)荷運(yùn)動可能主要通過在G1/S期造成DNA復(fù)制障礙，阻滯胸腺細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)。細(xì)胞周期阻滯可能是胸腺細(xì)胞凋亡發(fā)生的原因之一。

遞增負(fù)荷運(yùn)動；胸腺；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期

適量的運(yùn)動可提高機(jī)體免疫功能，維持和促進(jìn)健康。然而，劇烈運(yùn)動會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)機(jī)能下降，發(fā)生運(yùn)動性免疫抑制。細(xì)胞免疫失衡是運(yùn)動性免疫抑制的主要機(jī)制。已有研究表明，大強(qiáng)度運(yùn)動可導(dǎo)致T細(xì)胞發(fā)育受阻[11,10]。細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)是細(xì)胞增殖與分化有序進(jìn)行的重要保證，細(xì)胞周期阻滯可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[3,7,14,16]。因此，T細(xì)胞發(fā)育水平的變化在運(yùn)動性免疫抑制的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。胸腺是T細(xì)胞分化發(fā)育的場所,目前關(guān)于運(yùn)動對胸腺細(xì)胞周期變化的研究還鮮有報道。既往研究發(fā)現(xiàn)，大強(qiáng)度運(yùn)動會刺激細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，使其活性發(fā)生改變，從而阻滯細(xì)胞周期于某一時期，影響周期正常運(yùn)轉(zhuǎn)。然而，大強(qiáng)度運(yùn)動如何影響胸腺細(xì)胞周期調(diào)控因子，進(jìn)而如何影響胸腺這一中樞免疫器官的機(jī)能，諸多問題還有待于進(jìn)一步研究。

本研究通過建立大鼠遞增負(fù)荷訓(xùn)練模型，重點觀察胸腺細(xì)胞周期G1/S期和G2/M期這兩個關(guān)鍵調(diào)控點各調(diào)控蛋白的變化特征，并分析其相互關(guān)系，進(jìn)而明晰運(yùn)動性免疫抑制發(fā)生發(fā)展過程中胸腺組織結(jié)構(gòu)改變和胸腺細(xì)胞凋亡信號通路相關(guān)蛋白變化的可能聯(lián)系，探究大強(qiáng)度運(yùn)動影響細(xì)胞免疫功能的機(jī)制。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象與分組

SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(8周齡，體重223.23±16.56 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物批號：SCXK(粵)2008-0020)共計80只，每籠5只分籠飼養(yǎng)，喂食國家標(biāo)準(zhǔn)顆粒型固體大鼠飼料，飲用蒸餾水，自由飲食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為安靜對照組和運(yùn)動組，每組40只。安靜組用于判別大鼠生長發(fā)育對所測指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示各周之間無顯著差異，表明生長發(fā)育對所測指標(biāo)無明顯影響。運(yùn)動組進(jìn)行六周遞增負(fù)荷跑臺運(yùn)動。

1.2 運(yùn)動方案

采用6周遞增負(fù)荷運(yùn)動模型。大鼠進(jìn)行勻速跑臺運(yùn)動，坡度為0，30 min/次，1次/天，6天/周。適應(yīng)性運(yùn)動1周，跑臺速度為10 m/min，定為第0周。正式訓(xùn)練第1周運(yùn)動負(fù)荷為10 m/min，第2周起始負(fù)荷定為20 m/min，以后每周遞增負(fù)荷5 m/min，至第6周達(dá)到40 m/min，到達(dá)大鼠最大強(qiáng)度負(fù)荷。

1.3 主要試劑

一抗Bax、Bcl-2、cyclinB1、cylcinE、p21(北京博奧森)，羊抗兔二抗試劑盒、DAB顯色劑(武漢博士德)，蘇木素、伊紅、PBS、過氧化氫、二甲苯、各梯度乙醇、10%中性甲醛溶液、0.5%鹽酸酒精溶液、枸櫞酸鹽緩沖液、3%H2O2溶液、中性樹膠。

1.4 測試指標(biāo)及方法

1.4.1 HE染色觀察胸腺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)

分別于第0、2、4、6周最后一次運(yùn)動完成48 h后對大鼠無菌取材胸腺組織，置于10%中性甲醛溶液固定。梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋，4 μm厚度切片，水化，染色，透明，封片。在光學(xué)顯微鏡10×10、40×10倍視野下觀察HE染色胸腺皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)變化及有無炎癥滲出、出血等。

1.4.2 免疫組化檢測胸腺細(xì)胞凋亡蛋白及周期蛋白表達(dá)

采用SABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片。在光學(xué)顯微鏡10×10、40×10倍視野下觀察免疫組織化學(xué)染色胸腺組織中Bax、Bcl-2、cyclinE、p21和cyclinB1蛋白陽性表達(dá)程度。

1.4.3 免疫組化圖像處理

所采集圖像用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行陽性表達(dá)定量分析，得出積分光密度(IOD)、陽性表達(dá)面積(Area)，通過Density=IOD/Area得出平均光密度。每張圖片選取5個視野計算平均值。

1.5 數(shù)理統(tǒng)計

2 實驗結(jié)果

2.1 6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中大鼠胸腺結(jié)構(gòu)變化

HE染色鏡下觀察：0周組胸腺組織結(jié)構(gòu)完整，皮髓質(zhì)界限清晰，皮質(zhì)細(xì)胞密集；髓質(zhì)內(nèi)上皮細(xì)胞連接形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)清晰，未見脂肪細(xì)胞。2周組皮質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞密度降低，皮髓質(zhì)界限出現(xiàn)融合，髓質(zhì)上皮細(xì)胞增多，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可見，出現(xiàn)少量脂肪細(xì)胞。4周組髓質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂肪細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞破裂、融合現(xiàn)象，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不完整，并有少量血細(xì)胞出現(xiàn)。6周組胸腺細(xì)胞明顯減少，皮髓質(zhì)交叉、融合，并有明顯斷裂帶出現(xiàn)，組織結(jié)構(gòu)萎縮；上皮細(xì)胞散在，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失，血細(xì)胞較4周時增多。

2.2 6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中大鼠胸腺細(xì)胞凋亡信號通路相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)變化

Bax蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒。6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中，大鼠胸腺Bax表達(dá)量的變化總體呈先顯著上升后略有下降，而后趨于平穩(wěn)的態(tài)勢。與0周組相比，2周、4周、6周組Bax表達(dá)量均具有顯著性增加(P<0.01)。4周組較2周組具有較顯著減少(P<0.05)；6周組較4周組則具有顯著性增加(P<0.05)。

圖1 本研究大鼠胸腺結(jié)構(gòu)形態(tài)變化示意圖(HE,×400)

圖2 本研究大鼠胸腺Bax陽性表達(dá)結(jié)果示意圖(SABC,×400)

Bcl-2蛋白陽性表達(dá)為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)及胞漿內(nèi)。大鼠胸腺Bcl-2的表達(dá)：0～2周呈下調(diào)趨勢(P<0.01)，4周較2周顯著增多(P<0.01)，6周時較4周明顯回落(P>0.05)。

圖3 本研究大鼠胸腺Bcl-2陽性表達(dá)結(jié)果示意圖(SABC,×400)

表1 本研究大鼠胸腺Bax、Bcl-2含量及Bax/Bcl-2的變化一覽表

Table 1 The Variations of Bax,Bcl-2 and Bax/Bcl-2 in Rat Thymus

注：1)與Week0比較：*P<0.05,**P<0.01；與Week2比較：#P<0.05,##P<0.01; 與Week4比較：△P<0.05,△△P<0.01。2) 根據(jù)大鼠存活情況，各組樣本量為Week0:n=10、Week2:n=10、Week4:n=9、Week6:n=8。下同。

大鼠胸腺Bax/Bcl-2在6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中的變化情況總體呈上升、下降后又上升的趨勢。2周組、6周組與0周組相比均具有顯著性差異(P<0.01)；與2周組相比，4周組、6周組具有顯著性差異(P<0.01)；6周組較4周組Bax/Bcl-2具有顯著性差異(P<0.01)。

2.3 6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中大鼠胸腺細(xì)胞周期調(diào)控蛋白變化

CyclinE陽性反應(yīng)為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞核。6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中，大鼠胸腺細(xì)胞cyclinE表達(dá)呈0～2周上升(P>0.05)；在第4周時表達(dá)量急劇下降，與0、2周比均具有非常顯著性差異(P<0.01)；而6周cyclinE陽性表達(dá)量與4周比較顯著提高(P<0.05)。

圖4 本研究大鼠胸腺組織CyclinE陽性表達(dá)示意圖(SABC,×400)

細(xì)胞周期抑制蛋白p21陽性表達(dá)主要分布于細(xì)胞核中，呈棕黃色顆粒。與0周相比，大鼠胸腺中的p21表現(xiàn)出2周時表達(dá)量顯著上升(P<0.01)，4周時下調(diào)至0周水平(P>0.05)，6周略有回升的變化趨勢(P>0.05)。4、6周較2周p21陽性表達(dá)量的差異非常顯著(P<0.01)。

圖5 本研究大鼠胸腺組織p21陽性表達(dá)示意圖(SABC,×400)

CyclinB1陽性表達(dá)主要分布于細(xì)胞核中，呈棕黃色顆粒。本實驗中，CyclinB1的表達(dá)隨著6周遞增負(fù)荷運(yùn)動的進(jìn)行，呈現(xiàn)出2周時升高，4周下降，6周再次回升的變化趨勢。但變化趨勢平穩(wěn)，各周cyclinB1陽性表達(dá)量間均無顯著性差異。

圖6 本研究大鼠胸腺組織CyclinB1陽性表達(dá)示意圖(SABC,×400)

WeekcyclinEp21cyclinB100.077±0.010 0.031±0.017 0.061±0.00720.093±0.0350.171±0.034**0.086±0.03840.049±0.009**##0.035±0.019##0.062±0.00860.064±0.017##△0.046±0.014##0.080±0.012

3 分析與討論

3.1 6周遞增負(fù)荷運(yùn)動中胸腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化特征

胸腺是T細(xì)胞分化發(fā)育的場所，并能分泌胸腺素等多種細(xì)胞因子，具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能[2]。前期研究表明，隨著運(yùn)動負(fù)荷的增加，大鼠胸腺指數(shù)逐漸下降，胸腺萎縮加重[11]。本實驗中，對照組大鼠各周胸腺結(jié)構(gòu)未見明顯變化，運(yùn)動組大鼠在中低強(qiáng)度訓(xùn)練時(0～2周)，大鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)清晰，皮質(zhì)細(xì)胞密集，髓質(zhì)內(nèi)上皮細(xì)胞連結(jié)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)未遭到破壞。隨著運(yùn)動時間和強(qiáng)度的增加，2周末時胸腺小葉皮、髓質(zhì)界限不清，且有脂肪細(xì)胞出現(xiàn)。揭示大鼠作為不慣常運(yùn)動動物，其機(jī)體對運(yùn)動負(fù)荷不適應(yīng)而產(chǎn)生應(yīng)激性表現(xiàn)。至4周時，胸腺出現(xiàn)少量出血現(xiàn)象，但組織結(jié)構(gòu)較2周沒有明顯變化，反應(yīng)機(jī)體對運(yùn)動負(fù)荷逐步適應(yīng)，自身調(diào)控以維持自身免疫機(jī)能平衡。至6周時運(yùn)動負(fù)荷至大鼠最大承受強(qiáng)度，胸腺組織萎縮和受損程度明顯加重，提示長時間大強(qiáng)度運(yùn)動可造成機(jī)體已形成的免疫平衡再度被破壞，出現(xiàn)免疫抑制。

3.2 6周遞增負(fù)荷運(yùn)動中大鼠胸腺細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2的變化特征

有研究結(jié)果支持胸腺組織萎縮、胸腺細(xì)胞數(shù)量下降是由細(xì)胞凋亡導(dǎo)致[5,15]。細(xì)胞凋亡B細(xì)胞淋巴瘤基因(Bcl-2)和編碼Bcl-2相關(guān)蛋白X基因(Bax)是細(xì)胞凋亡過程中的重要調(diào)控物質(zhì)，分別在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起到抗凋亡和促凋亡的作用，即 Bcl-2 與 Bax 的比例與細(xì)胞凋亡成線性正相關(guān)[17,22]。針對6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中大鼠胸腺萎縮和正常結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞的現(xiàn)象，本實驗研究了細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2的變化。在6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中，大鼠胸腺細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白隨著運(yùn)動負(fù)荷的逐漸增加產(chǎn)生波動性變化。2周時胸腺Bax較0周增加近一倍，Bcl-2減少一半，Bax/Bcl-2比值由0周的0.95增至3.35(P<0.01)。由于Bax大幅度增加，大量Bax同源二聚體生成，因此可促使淋巴細(xì)胞凋亡率上升。4周時Bax下調(diào)，Bcl-2上調(diào)顯著，Bax/Bcl-2的比值達(dá)到1.04接近0周的水平。說明機(jī)體通過自我調(diào)控，對運(yùn)動負(fù)荷逐步適應(yīng)，免疫系統(tǒng)在一個更高的層面建立了新的平衡。提示機(jī)體主要是通過上調(diào)Bcl-2來對抗凋亡，在此過程中Bcl-2占主導(dǎo)地位。然而這種平衡只是暫時的和一過性的，隨著負(fù)荷的不斷增加，機(jī)體免疫平衡無法維持，再次遭到破壞，6周時Bcl-2顯著性減少，Bax升高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。提示6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中胸腺細(xì)胞凋亡增加，胸腺萎縮可能是由淋巴細(xì)胞凋亡引起的。

3.3 6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中胸腺細(xì)胞周期G1/S期調(diào)控因子的變化特征

細(xì)胞周期進(jìn)程與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡均存在密切聯(lián)系[13]。宋其蔓等[9]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇抑制系膜細(xì)胞增殖的作用是通過將系膜細(xì)胞周期阻滯于S期實現(xiàn)的。苑召虎等[12]發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過阻斷人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程來抑制其增殖。有早期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡過程中，Bax、Bcl-2與CDK2激酶活性存在一定關(guān)系[19]。多項研究也均證實了細(xì)胞周期的阻滯是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素之一[3,7,14,16]。

一個完整的細(xì)胞周期進(jìn)程包括間期和分裂期(M期)兩個階段。其中間期由DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)三部分組成。細(xì)胞周期進(jìn)程中有兩個重要事件，即DNA的復(fù)制和DNA的分配。相應(yīng)地，有兩個重要的調(diào)控點，即G1/S和G2/M。細(xì)胞周期的有序運(yùn)轉(zhuǎn)是細(xì)胞正常發(fā)育的重要保障，其有序運(yùn)轉(zhuǎn)受到一系列調(diào)控因子的嚴(yán)密調(diào)控。[1,8,21]

CyclinE是細(xì)胞周期G1/S限制點的重要調(diào)控蛋白，在G1期晚期開始合成并一直持續(xù)到細(xì)胞進(jìn)入S期。CyclinE與CDK2在G1～S期結(jié)合成CyclinE-CDK2復(fù)合物，呈現(xiàn)CDK2激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S限制點，進(jìn)入S期。CyclinE的濃度對細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)具有重要影響[6,18]。p21蛋白是細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子，主要對G1期CDK以及Cyclin-CDK復(fù)合物起抑制作用，還可與DNA復(fù)制必需的PCNA結(jié)合，直接抑制DNA的復(fù)制，從而阻滯細(xì)胞周期于DNA復(fù)制的重要階段[4]。當(dāng)細(xì)胞受到非正常刺激時，p21的上調(diào)可能會在細(xì)胞周期的進(jìn)程中起到剎車的作用[20]。p21 能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CyclinE和p21是細(xì)胞周期調(diào)控過程中最為重要的控制點G1/S限制點的一對重要調(diào)控因子，決定了細(xì)胞核內(nèi)的DNA復(fù)制是否能夠完成，在生長條件不好或存在來自其他細(xì)胞的抑制信號的情況下，細(xì)胞有可能在G1期發(fā)生阻滯，甚至進(jìn)入G0期[1]。

本實驗中，cyclinE在2周時較0周變化不大，但p21增加幅度較大，由此可見，2周時胸腺細(xì)胞周期的變化以p21的上調(diào)為主要特征。由于p21的負(fù)性調(diào)控作用，胸腺細(xì)胞周期此時有可能發(fā)生G1/S期阻滯。而6周遞增負(fù)荷運(yùn)動中胸腺細(xì)胞凋亡蛋白變化的結(jié)果顯示，2周時胸腺細(xì)胞Bax/Bcl-2的比值顯著高于0周組，細(xì)胞凋亡增加。此時胸腺細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能由胸腺細(xì)胞周期阻滯引起。分析是由于大鼠作為不慣常運(yùn)動的動物，在受到運(yùn)動負(fù)荷的刺激時，機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的不適應(yīng)現(xiàn)象，出現(xiàn)運(yùn)動性免疫抑制。

遞增負(fù)荷運(yùn)動進(jìn)行到4周時，胸腺細(xì)胞cyclinE和p21均有明顯下調(diào)，但cyclinE的下降幅度較p21下降幅度小。說明cyclinE在受到運(yùn)動刺激后2周時仍能保持一定水平，但到4周時出現(xiàn)較大幅下降。伴隨cyclinE下降出現(xiàn)的p21大幅回落可能是機(jī)體為了維持其自身免疫平衡的保護(hù)性調(diào)節(jié)，從而使得胸腺細(xì)胞周期的破壞得到緩解。由第4周胸腺細(xì)胞凋亡的結(jié)果可見，Bax/Bcl-2比值也在4周出現(xiàn)了一過性的下降，凋亡程度減輕，與胸腺細(xì)胞周期調(diào)控因子的變化相一致，說明此時的運(yùn)動性免疫抑制變淺。

遞增負(fù)荷運(yùn)動第6周時，cyclinE和p21均微有回升，cyclinE升高較多，而p21的增多并不顯著。由大鼠胸腺結(jié)構(gòu)觀察可知，第6周時胸腺較之前出現(xiàn)萎縮，盡管機(jī)體為維持自身平衡仍使得cyclinE在胸腺細(xì)胞周期調(diào)控中占主導(dǎo)，從而促進(jìn)細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)，但整體上胸腺細(xì)胞數(shù)量的下降仍有可能表現(xiàn)出免疫機(jī)能的下降。6周遞增負(fù)荷運(yùn)動中胸腺細(xì)胞凋亡的變化趨勢為此提供了佐證。

3.4 6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中胸腺細(xì)胞周期CyclinB1的變化特征

CyclinB也是細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)中正性調(diào)節(jié)因子之一，包括CyclinB1～6這6個亞型。其中，CyclinB1在人類的細(xì)胞周期中最早被發(fā)現(xiàn)。CyclinB是G2/M轉(zhuǎn)換期的重要調(diào)控因子，G2/M期則決定復(fù)制好的DNA能否順利分到兩個子細(xì)胞中，完成有絲分裂。CyclinB一般在G1期晚期開始合成，通過S期不斷上調(diào)，到達(dá)G2期含量達(dá)到一定程度，并與CDK1結(jié)合，繼而CDK1激酶活性開始出現(xiàn)。經(jīng)過磷酸化后，CyclinB1-CDK1復(fù)合物可促進(jìn)細(xì)胞周期從G2期到M期的過渡。在這一過程中，復(fù)制好的DNA將被分配到子細(xì)胞中去，從而完成細(xì)胞有絲分裂過程[4]。

細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)過程中最重要的調(diào)控點為G1/S期，大部分的細(xì)胞周期阻滯都發(fā)生在此時期，表現(xiàn)為DNA復(fù)制受到影響，而沒有足夠的DNA用于G2/M期進(jìn)行有絲分裂。因此，細(xì)胞周期中G1/S期的重要性大于G2/M期[1]。就目前所掌握的文獻(xiàn)，主要在G2/M期發(fā)揮作用的細(xì)胞周期抑制蛋白并不明確，因此本研究此部分只選擇了起正性調(diào)節(jié)作用的CyclinB1進(jìn)行大致分析。實驗結(jié)果顯示，0、2、4、6各周數(shù)據(jù)之間均無顯著差異，但可看出在運(yùn)動負(fù)荷逐漸遞增過程中，胸腺細(xì)胞CyclinB1的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢?？赡苁菣C(jī)體對運(yùn)動負(fù)荷應(yīng)激的適應(yīng)性和保護(hù)性調(diào)節(jié)。為更好的解釋胸腺細(xì)胞周期G2/M期的調(diào)控變化，還需進(jìn)一步對與CyclinB1相拮抗的負(fù)性調(diào)節(jié)因子在長期遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中的變化特征及其兩者的變化之間的相互關(guān)系進(jìn)行研究。

由于本實驗胸腺CyclinB1在各周的檢測結(jié)果變化不顯著，可以看出胸腺細(xì)胞CyclinB1對遞增負(fù)荷運(yùn)動的刺激不及CyclinE敏感，可見G1/S期受到長期遞增負(fù)荷運(yùn)動影響更為顯著。胸腺細(xì)胞在運(yùn)動性免疫抑制發(fā)生發(fā)展過程中的凋亡可能主要是大部分細(xì)胞未能順利通過G1/S檢驗點而進(jìn)入到S期進(jìn)行DNA的復(fù)制造成的。

4 結(jié)論

1.6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中，隨著運(yùn)動負(fù)荷的增加，大鼠胸腺結(jié)構(gòu)發(fā)生漸進(jìn)性破壞。

2.6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中，大鼠胸腺細(xì)胞凋亡增加以Bcl-2的變化為主導(dǎo)。

3.長期遞增負(fù)荷運(yùn)動可能主要是通過G1/S期的調(diào)控造成DNA復(fù)制障礙，阻滯胸腺細(xì)胞周期。細(xì)胞周期阻滯可能是胸腺細(xì)胞凋亡發(fā)生的原因之一。

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Effects of Long-term Incremental Exercise on Thymus Cell Apoptosis and Cell cycle Regulatory Proteins

ZHANG Xin-lei1,HAO Xuan-ming2,RUAN Yang3,QIN Fei2

Objective:To observe the variation characteristics of the thymus structure,the apoptosis proteins and the cell cycle regulatory proteins during long-term incremental exercise.Methods：80 male SD rats divided into control group and exercise group randomly.The exercise group participated in six weeks incremental treadmill training.The thymus structure were observed by HE staining,the expression of bax and bcl-2,cyclinE,p21 and cyclinB1 of thymus cell were detected by immunohistochemistry at 0 week,after 2 weeks exercise,4 weeks exercise and 6 weeks exercise.Results:1) The cells density of thymus decreased,the cortex and medulla of thymus lobule became fused,reticular formation in thymocytes were destructed,adipocytes and hemocytes occurred.2) Compared with WK0,bax/bcl-2 increased significantly in WK2 and WK6(P<0.01).Compared with WK2,it decreased with a significant difference in WK4 and WK6(P<0.01).While the ratio increased again in WK6 than in WK4(P<0.01).3) Compared with WK0,CyclinE increased slightly in WK2(P>0.05).While it reduced significantly in WK4 compared with WK0 and WK2(P<0.01).Compared with WK4,WK6 increased with a statistical difference(P<0.05).Making the p21 expression in WK0 as a reference,p21 extremely increased in WK2(P<0.01).Compared with WK2,WK4 reduced drastically(P<0.01).The expression slightly increased in WK6,but still less.The expression of CyclinB1 in rat thymocytes in WK2 was higher than WK0,and it reduced in WK4.Compared with WK4,the expression in WK6 increased slightly.The expression of CyclinB1 changed smoothly among every week and there was no significant difference(P>0.05).Conclusion:During six-week incremental exercise,the structure of rat thymus was destructed gradually.Bax/bcl-2 in thymus of rats shows a trend that increased firstly and then decreased,and finally increased again.The apoptosis of thymocytes increased and the changes of bcl-2 led this thymocyte apoptosis.The effect of the expression of thymus cell cycle regulatory proteins in G1/S by incremental exercise is more obviously than that in G2/M.The block of thymus cell cycle due to long-term incremental exercise mainly because of the DNA replication disorder which caused by the regulation of G1/S phase.Cell cycle arrest may be one of the mechanisms of thymocyte apoptosis.

incrementalexercise;thymus;cellapoptosis;cellcycle

2015-03-08；

2015-12-02

廣東省體育局科研項目(GDSS2014181)。

張馨蕾(1988-)，女，陜西西安人，講師，碩士，主要研究方向為運(yùn)動免疫與健康、體育教育與訓(xùn)練，Tel：(029)88409648，E-mail：spacezhangxinlei@126.com；郝選明(1954-)，男，陜西韓城人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向為運(yùn)動免疫與健康，E-mail：850888696@qq.com；阮洋(1989-)，女，江西九江人，碩士，主要研究方向為運(yùn)動免疫與健康，E-mail：ryamanda@163.com；覃飛(1987-)，女，甘肅蘭州人，在讀博士研究生，主要研究方向為運(yùn)動免疫與健康，E-mail：qf_8707@163.com。

1.西安體育學(xué)院，陜西 西安 710068；2.華南師范大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.中國電器科學(xué)研究院，廣東 廣州 510300 1.Xi’an Physical Education University,Xi’an 710068，China;2.South China Normal University,Guangzhou 510006,China;3.China Electric Institute，Guangzhou 510300,China.

1000-677X(2015)12-0052-06

10.16469/j.css.201512007

G804.7

A