小RNA基因藥研發(fā)的現(xiàn)狀和展望

王姍姍， 易八賢， 殷勤偉

（1.北京軍區(qū)總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，北京 100700；2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 200040）

小RNA基因藥研發(fā)的現(xiàn)狀和展望

王姍姍1， 易八賢2， 殷勤偉1

（1.北京軍區(qū)總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，北京 100700；2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 200040）

RNA干擾技術(shù)的核心成份包括siRNA，miRNA，sh RNA和ds RNA，由于其在沉默疾病特異的靶基因方面的高度特異性和有效性，已成為一個人類研發(fā)未來新型基因藥的戰(zhàn)略平臺.然而十多年的小RNA基因藥研發(fā)顯示，此技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化路程充滿挑戰(zhàn).本綜述總結(jié)了小RNA基因藥研發(fā)的現(xiàn)狀、存在的問題和未來愿景.

小RNA；基因藥物；研發(fā)進(jìn)展

核酸是生命的基本物質(zhì)，它存在于單細(xì)胞微生物、多細(xì)胞植物及復(fù)雜的人體等所有生物細(xì)胞中，是生物遺傳密碼的載體和生物發(fā)育的藍(lán)圖，是指導(dǎo)生命活性成分合成的模板和指令，也是調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞生命活動的重要分子.隨著生命科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和生物工程的迅猛發(fā)展，相關(guān)的核酸高新技術(shù)，如基因治療和小RNAs（siRNA／miRNA）沉默技術(shù)等以其獨(dú)特的藥理作用形成了一個新興產(chǎn)業(yè)，正日益彰顯出其特有而重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會影響.本文主要綜述小RNA基因藥方面的最新研發(fā)進(jìn)展.

1998年，F(xiàn)ire等［1］發(fā)現(xiàn)一種小RNA可以作為基因表達(dá)的調(diào)節(jié)者，這個對細(xì)胞中基因信息流傳遞進(jìn)行精細(xì)調(diào)控的發(fā)現(xiàn)于2006年獲得了諾貝爾獎.它也為miRNA對翻譯的控制，s RNA對染色質(zhì)重塑的指導(dǎo)以及對非編碼RNA功能的重新認(rèn)識都產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響.可以說s RNAs是基因功能檢驗(yàn)的試金石，利用sRNA沉默技術(shù)可以縮短對人類基因功能的了解和認(rèn)識的時間，在不久的將來，有望將人類大部分基因的功能和作用全部弄清楚［2-4］；另一方面，有望利用該技術(shù)獲得使致病基因失活的新型基因藥物，而基因藥物一直是當(dāng)代生物技術(shù)界追捧的對象.然而，小RNA基因藥要進(jìn)入實(shí)際臨床應(yīng)用，目前迫切需要解決的主要問題是基因沉默藥物的靶向給藥方式［2］、小RNA的脫靶效應(yīng)［5］、自然免疫激活作用［6］、入胞后難釋放發(fā)揮作用［7］、可能的表觀遺傳修飾功能以及在血液中會被酶快速降解等問題［8］，故小RNA基因藥要通過臨床的嚴(yán)格試驗(yàn)成功地進(jìn)入藥品市場還有較長的路要走.

1 小RNA的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制

主要的小RNA有兩種：siRNA和miRNA，都是19～23對核苷酸堿基構(gòu)成的雙體.siRNAs（small or short interference RNAs）最初是在轉(zhuǎn)基因和病毒誘導(dǎo)的沉默子中發(fā)現(xiàn)的［1］.因此，可以說siRNA是一種天然的基因藥物，在低等生物和植物防御外來遺傳物質(zhì)的侵襲方面發(fā)揮著重要作用.本課題組通過計(jì)算機(jī)預(yù)測、Solexa測序和生物芯片分析在人體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了1 345條內(nèi)源性sh RNAs和siRNAs［9］.其他實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果也證實(shí)了在小鼠的胚胎干細(xì)胞中存在天然的內(nèi)源性siRNAs，它們可來自基因的內(nèi)含子、假基因起源的反義轉(zhuǎn)錄子或基因重復(fù)序列等［10］.miRNA分子大多數(shù)是一段小的非完全互補(bǔ)的雙鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后階段調(diào)控基因的表達(dá).目前為止，在生物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)了1 500多個miRNA序列，并存儲在miRBase（http：／／w ww. mirbase.org／index.shtml）中，可調(diào)節(jié)約60%的蛋白質(zhì)編碼基因［11］.內(nèi)源性的非編碼miRNAs或sh RNAs轉(zhuǎn)錄子首先由最初的非完全互補(bǔ)的雙鏈前體在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)RNase III酶（Drosha）初步作用成一個短發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在Exportin 5和Ran-GTP共因子的幫助下通過核孔進(jìn)入胞漿［12］，在Dicer酶的作用下產(chǎn)生約21個核苷酸（NT）的雙鏈RNA，具有典型的末端（5’磷酸和3’尾端）［13］.

siRNA沉默途徑的特征是siRNA雙體中的功能鏈與mRNA編碼區(qū)中的靶目標(biāo)鏈?zhǔn)峭耆パa(bǔ)的.在siRNA雙體與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合后，其中的引導(dǎo)鏈（或稱功能鏈）可引導(dǎo)RISC識別靶mRNA并與其結(jié)合，RISC中的核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)靶基因的裂解.mRNA的降解是由Ago2誘發(fā)的［14］，由此產(chǎn)生的基因片段為核酸外切酶酶解消化.進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，siRNA也可以作用于靶m RNA分子的其他區(qū)域，如非編碼區(qū).如果siRNAs與靶區(qū)中的核酸序列不完全匹配，它仍然可以抑制翻譯過程［15］.

研究動物和人體內(nèi)miRNA的翻譯抑制機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，miRNA分子與目標(biāo)基因相互作用的主要抑制途徑是通過“種子點(diǎn)”方式來實(shí)現(xiàn)的.miRNA的第2個到第7、8個堿基對與靶mRNA的非編碼區(qū)域內(nèi)序列進(jìn)行配對，而其部分與靶mRNA的互補(bǔ)是不完全的［16-17］.但植物細(xì)胞中miRNA的功能特點(diǎn)與siRNA分子作用模式一樣.最初認(rèn)為miRNA的下調(diào)只有通過與mRNA的非編碼區(qū)作用，進(jìn)而抑制基因的翻譯和保持靶mRNA的結(jié)構(gòu)完整不變.研究表明，miRNA也能與mRNA的編碼區(qū)相互作用，降低m RNA的表達(dá)水平［18］.故miRNA與siRNA的作用機(jī)制非常類似，它與靶目標(biāo)鏈的完全互補(bǔ)能導(dǎo)致mRNA的裂解.雖然miRNA依賴的翻譯抑制作用和（或）mRNA不穩(wěn)定的分子機(jī)制還未完全闡明，但miRNA-mRNA的互補(bǔ)程度仍是調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵因素.一個完全的配對允許Ago2催化mRNA的裂解，而匹配率低的不會引起mRNA的裂解，但能促進(jìn)m RNA的翻譯抑制［19］.研究數(shù)據(jù)表明，大多數(shù)靶基因在m RNA水平和翻譯水平均能被抑制.基因分析顯示細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上相關(guān)核糖體中mRNA的翻譯抑制比游離胞漿核糖體強(qiáng).此外，mRNA水平減少可只通過Ago催化裂解m RNA來實(shí)現(xiàn)，催化方式包括去頭端、去腺苷酸、核酸外切活性等.

有趣的是，一些研究表明miRNA不僅能抑制蛋白的表達(dá)，而且還能夠提高翻譯水平［20］.此時，miRNA的結(jié)合位點(diǎn)位于目標(biāo)RNA5’端的非編碼區(qū)，而不是3’區(qū).綜上所述，mRNA的沉默，無論是siRNA還是miRNA誘導(dǎo)，都須有21～23個堿基對參與，以及RISC的介導(dǎo).翻譯抑制是miRNA抑制基因表達(dá)最常見的機(jī)制，而m RNA的降解是si-RNA最常見的機(jī)制.其次，miRNA的完全配對可能參與基因的裂解，而siRNA的不完全配對也可能參與基因的抑制.再者，miRNA通過降低目標(biāo)m RNA的穩(wěn)定性來減少mRNA的表達(dá)，而后者與RISC介導(dǎo)的裂解作用無關(guān).

2 小RNA在細(xì)胞生長發(fā)育和疾病中的作用

由于小RNA干擾技術(shù)是研究特定基因功能的強(qiáng)有力工具，也是解析基因組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有效方法，有關(guān)小RNA調(diào)控機(jī)制的研究對人體組織器官的形成、生長發(fā)育以及疾病的發(fā)生發(fā)展、診斷和治療具有很大意義.不管是內(nèi)源性siRNAs還是miRNAs，都參與細(xì)胞的增殖、生長分化和代謝等過程，至今已有4 100種miRNA和疾病的相關(guān)性被報道.此外，miRNA分子也對生物體分化的不同組織類型和維持某一特定的分化狀態(tài)是必須的.未分化或低分化細(xì)胞對miRNAs依賴較少，例如缺乏Dicer酶的小鼠胚胎干細(xì)胞，不能生成成熟的miRNAs，是可發(fā)育的，但不能進(jìn)行正常的分化.有證據(jù)表明，一些mi-RNAs的表達(dá)對干細(xì)胞的自我更新是重要的，如miR-302，miR-367等［21］.研究顯示，在成體細(xì)胞中導(dǎo)入一組miRNA分子能將其重編程為干細(xì)胞樣的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（iPS）［22］.細(xì)胞的生長分化也須miRNA的參與，如小鼠和人類胚胎干細(xì)胞表達(dá)一組特定的miRNAs，當(dāng)這些干細(xì)胞分化成胚胎后，原有的miRNAs發(fā)生下調(diào)，而另一些miRNAs卻上調(diào).繼而發(fā)現(xiàn)，一些miRNAs在維持分化狀態(tài)上起重要作用；miR-181在B淋巴細(xì)胞中是優(yōu)先表達(dá)的，如在小鼠中異常地過度表達(dá)miR-181將導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞比例的增加，同時引起T淋巴細(xì)胞比例的減少［23］.在轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟中，過度表達(dá)的miR-1可導(dǎo)致心肌細(xì)胞有缺陷的增殖和心室心肌不能擴(kuò)張，其原因是miR-1可引起心肌細(xì)胞過早分化［24］.綜上所述，小RNA在控制細(xì)胞生長發(fā)育和分化中，可能是通過控制基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的開關(guān)發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用.由于這些調(diào)節(jié)作用在任何特定的細(xì)胞組織中都是至關(guān)重要的，因此，這些小RNA分子表達(dá)的失調(diào)可能會影響到生物體的生長和分化乃至引起疾病.

miRNA具有基因調(diào)節(jié)作用，其本身的發(fā)生也受到極其嚴(yán)格的控制.因此，它們發(fā)生失調(diào)不僅影響著細(xì)胞的正常分化和功能，在腫瘤細(xì)胞的始發(fā)、生長和增殖中也起重要作用.研究顯示，腫瘤和正常組織miRNA的表達(dá)方式有顯著差別［25］.進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA分子可以致瘤、抑癌因子的方式發(fā)揮作用［26］，如miR-21在多種腫瘤細(xì)胞（乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和淋巴瘤）中高表達(dá).其他同時能始發(fā)腫瘤和引起腫瘤轉(zhuǎn)移的低表達(dá)miRNAs包括let-7 miRNA家簇（let-7a-1，7a-2，7a-3，7b，7c，7d，7e，f7-1，7f-2，7g，7i，mir-98和mir-202），這是由于癌基因的高表達(dá)所致.另外，50%的miRNA基因位于腫瘤基因和染色質(zhì)脆點(diǎn)區(qū)域，故癌基因高表達(dá)亦可引起miRNAs表達(dá)的失控［27］.根據(jù)上述研究，可以設(shè)想下調(diào)致癌的miRNA分子的表達(dá)，或上調(diào)抑癌的miRNAs也許都可以控制癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展.2014年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一種新型的傳送平臺，利用腫瘤微環(huán)境的獨(dú)特特性可以讓類似于miRNA鏡像的反義分子進(jìn)入到癌細(xì)胞中［28］.這些研究結(jié)果開發(fā)了以miRNA為基礎(chǔ)的抗癌藥物以及靶向性藥物傳遞的一種新模式.研究還顯示，不少miRNA可能影響腫瘤對化療的敏感性，有的miRNA可能增加腫瘤化療敏感性，而另一些則作用相反.可能增加腫瘤化療敏感性的miRNA，如miR-34a、miR-134、miR-379、miR-495和miR-21等，如將這些miRNA導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，可導(dǎo)致化療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡增加［29］.

近年，在小RNA研究方面的另一新進(jìn)展就是細(xì)胞外小RNA分子的發(fā)現(xiàn)［30］，盡管其須在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能，但該發(fā)現(xiàn)可用于細(xì)胞間的相互影響和調(diào)節(jié)的研究、疾病的診斷［31］、預(yù)后的評估以及疾病的預(yù)防和治療.大量研究結(jié)果顯示，不管是正常的還是腫瘤細(xì)胞都能產(chǎn)生細(xì)胞外囊泡［32-33］，一般有3種類型：40～100 n M的外胞體（Exosome），100～1 000 n M的微泡（Microvesicle）和800～5 000 n M的凋亡小體.這些囊泡中可含有較高濃度的多種miRNAs和其他成分，如Ago2等.在人體的這些囊泡中，已鑒定了700多種不同的miRNAs［34］.如MCF-7可產(chǎn)生這種囊泡，內(nèi)含2%細(xì)胞內(nèi)的mi-RNAs，尤其是miR-720、miR-451和miR-107等.這些含有miRNAs的囊泡可以在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)，從而影響遠(yuǎn)近細(xì)胞的生物學(xué)功能、形態(tài)的轉(zhuǎn)化以及內(nèi)在基因型的變化［30，33，35］.此外，這些生物體內(nèi)自然產(chǎn)生的囊泡，也給人們深刻的啟示，這也許是一種轉(zhuǎn)運(yùn)小RNA基因藥物的最佳方式.

3 小RNA非病毒傳遞系統(tǒng)的研制

即使艱難地通過了血液清除的考驗(yàn)，具有負(fù)極性特點(diǎn)和屬于大分子范疇的siRNA分子也很難穿過帶負(fù)電的細(xì)胞膜雙分子屏障進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，因此，如何將其安全高效地送達(dá)指定細(xì)胞部位是小RNA基因藥物給藥的一大難題.現(xiàn)已研制了多種分子遞送系統(tǒng)，包括直接將小RNA分子噴入氣管和肺泡、注入眼球和病變部位，或是以納米顆粒、陽離子多肽、膽固醇基團(tuán)或是含有特異性抗體的脂質(zhì)體為載體運(yùn)載小RNA通過血液去接近靶組織器官.雖然這些方法大都已經(jīng)在體外、動物或人體上進(jìn)行過多種實(shí)驗(yàn)，但可用于臨床試驗(yàn)，能真正起效者寥寥無幾，其中較為有效的有以下幾種：

（1）核酸脂顆粒（SNALP）方法是將修飾過的siRNA包裹進(jìn)一個陽離子或中性脂質(zhì)雙分子層顆粒中，顆粒上還結(jié)合了聚乙二醇（PEG）分子抗吞噬以減少血液的清除［36］.這種SNALP顆粒將siRNA遞送進(jìn)細(xì)胞后，載有siRNA的顆粒會被內(nèi)體系統(tǒng)降解，釋放出小RNA分子.使用這種脂質(zhì)顆粒遞送系統(tǒng)可將靶向針對APOB基因mRNA的siRNA分子遞送到靈長類動物的肝臟細(xì)胞內(nèi).一次靜脈注射后基因沉默的療效就可持續(xù)11天，沉默效率超過了90%，且不會發(fā)生毒性反應(yīng)，被認(rèn)為是目前最有希望的一種運(yùn)載系統(tǒng).

（2）MEA動態(tài)多聚顆粒（MEA-DPC）與SNALPS顆粒比較相似，但體積更小一些，且含有配體分子能幫助顆粒到達(dá)特定的靶細(xì)胞［37］.MEADPC顆粒分子上還加入了對p H值不穩(wěn)定的化學(xué)鍵，故更有利于內(nèi)體系統(tǒng)釋放siRNA分子.針對細(xì)胞周期蛋白D1基因的siRNA被結(jié)合到了穩(wěn)定的納米顆粒上，該納米顆粒表面結(jié)合了一種能夠特異性識別該粒細(xì)胞表面受體的抗體.在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用這種方法也能有效下調(diào)粒細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期蛋白D1基因的表達(dá)水平、抑制粒細(xì)胞的增殖，并逆轉(zhuǎn)人工誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎病程.

（3）外胞體［38］是生物體內(nèi)細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生的一種微泡，大小為100 n M左右，用電穿孔的方式將人工合成的siRNA分子轉(zhuǎn)入其中，再偶聯(lián)上特異的靶向多肽，靜脈注射后，這些外胞體可將siRNA分子送到特定的腦組織而非其他部位，成功地下調(diào)靶基因.

（4）將膽固醇分子共價結(jié)合到被修飾siRNA分子上［39-40］，從而增強(qiáng)小RNA分子的親脂性和穩(wěn)定性.如將特異性靶向APOB載脂蛋白的siRNA與膽固醇基團(tuán)結(jié)合，能夠?qū)⑵溥f送進(jìn)肝內(nèi)和空腸細(xì)胞，抑制細(xì)胞內(nèi)APOB基因的表達(dá)，達(dá)到降低血脂的作用.

（5）多聚陽離子納米顆?？赏ㄟ^其表面與靶細(xì)胞上某個受體結(jié)合的配體［41-42］，如轉(zhuǎn)鐵蛋白等通過受體介導(dǎo)的胞飲作用將siRNA分子遞送進(jìn)特定靶細(xì)胞內(nèi).在小鼠試驗(yàn)中，使用轉(zhuǎn)鐵蛋白和環(huán)糊精多聚陽離子聚合物遞送靶向尤文氏肉瘤的Ews-Fli1融合mRNA的siRNA分子，從而有效地抑制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散.

（6）化學(xué)連接或在siRNA轉(zhuǎn)錄時加上RNA配體分子也可將siRNA分子遞送到特定的表達(dá)該配體受體分子的靶細(xì)胞內(nèi)［43］.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一種結(jié)合了前列腺特異性膜抗原PSMA（又稱FOLH1）的RNA配體分子與靶向PLK1基因的siRNA分子結(jié)合，就能高選擇性地將該siRNA分子遞送到前列腺癌細(xì)胞中發(fā)揮抑制作用.

（7）聚氨基葡萄糖具有黏膜黏著特性，也可被用于siRNA分子的載體，經(jīng)鼻腔吸入到細(xì)支氣管上皮細(xì)胞上.在小鼠和非人類的靈長類動物模型上已經(jīng)證實(shí)，這是一種非常有效的siRNA遞送方式，可以完全阻斷呼吸道合胞病毒對動物上呼吸道的感染［44-45］.

（8）使用魚精蛋白或其他陽離子物質(zhì)將特異性的抗體結(jié)合到siRNA分子上，也可以將siRNA分子遞送到特定的靶細(xì)胞［46-48］.將魚精蛋白和HIV-1包膜蛋白gp160（HIV-1 ENV gp160）抗體的Fab鏈結(jié)合.帶正電荷的魚精蛋白結(jié)合了帶負(fù)電荷的靶向HIV病毒gag基因的siRNA后，在抗體的制導(dǎo)下就能選擇性地將這些小RNA分子遞送到細(xì)胞表面表達(dá)有g(shù)p160蛋白的細(xì)胞中.從而下調(diào)HIV病毒gag基因的表達(dá).

（9）siRNA分子被遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)［49］，這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中使用的siRNA是針對日本腦炎病毒的小RNA分子，這些siRNA分子上連接了狂犬病毒糖蛋白短肽，從而可以與神經(jīng)元細(xì)胞上的乙酰膽堿受體結(jié)合.靜脈注射后，80%的實(shí)驗(yàn)小鼠在感染日本腦炎病毒后都能繼續(xù)存活，而未給藥對照組則全部死亡.

（10）本課題組將siRNA與靶向黑色素細(xì)胞表面分子連接的多肽進(jìn)行自組裝成納米顆粒［50］，這種納米顆粒能成功地將抗黑色素生成的siRNA分子遞送到黑色素細(xì)胞內(nèi)，從而抑制有關(guān)黑色素生成的轉(zhuǎn)錄因子及其下游的相關(guān)基因，大大地減少黑色素的形成，達(dá)到防治高色素病的目的，現(xiàn)已被用于祛斑美白的化妝品中.

4 小RNA產(chǎn)業(yè)發(fā)展的歷史和現(xiàn)狀

至今，RNAi藥物的產(chǎn)業(yè)化可分為4個時期：2002～2005年可作為sRNA藥物的發(fā)現(xiàn)期，此期從發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象存在人的細(xì)胞中開始，漸被人們認(rèn)識到可作為一種疾病的治療手段.2002～2005年可作為RNAi藥物的發(fā)現(xiàn)期，一批以核酸干擾藥物開發(fā)為己任的制藥企業(yè)紛紛成立，加上一批由其他技術(shù)平臺轉(zhuǎn)入核酸干擾藥物開發(fā)的公司，整個核酸干擾藥物產(chǎn)業(yè)群在美歐已經(jīng)快速形成.主要由一些小公司，如Ribozyme Pharmaceuticals（aka Sirna Therapeutics），Atugen（aka Silence Therapeutics），Transderm，Quark，Calando Pharma，PTC Therapeutics和Protiva（aka Tekmira）介導(dǎo).Alnylam Pharmaceutical加入增加了知識產(chǎn)權(quán)的要素.2005～2008年可作為sRNA藥物的勃發(fā)期，各個生物技術(shù)公司在核酸干擾技術(shù)領(lǐng)域的競爭日趨激烈.美國的Alnylam公司和Sirna公司擁有使RNA分子保持穩(wěn)定的重要專利.Alnylam公司和德國的Ribopharma公司的合并使其在核酸干擾技術(shù)的專利上獨(dú)具優(yōu)勢.而美國的Intradigm等公司則主要在核酸干擾藥物導(dǎo)入領(lǐng)域進(jìn)行技術(shù)開拓.另外幾家公司，如Dharmacon、Qiagen以及Ambion則占據(jù)了核酸干擾實(shí)驗(yàn)試劑市場.繼而一些大的制藥公司進(jìn)入，高調(diào)開發(fā)核酸干擾藥物已經(jīng)使這一領(lǐng)域變得炙手可熱.此期已有7項(xiàng)核酸干擾藥物的項(xiàng)目在美國進(jìn)入臨床試驗(yàn)，包括：1項(xiàng)治療呼吸道感染的藥物，1項(xiàng)治療乙肝的藥物，1項(xiàng)治療艾滋病的藥物，1項(xiàng)治療皮膚病的藥物和3項(xiàng)治療老年型眼睛黃斑的藥物.其中，美國Opko公司治療老年性黃斑變性的藥物已經(jīng)推入到第III期臨床試驗(yàn).2008～2012年可作為sRNA藥物研發(fā)的調(diào)整期，由于全球性的金融風(fēng)暴，加之制藥公司巨頭認(rèn)識到RNAi制藥領(lǐng)域中siRNA分子的脫靶效應(yīng)、競爭效益不高、傳遞系統(tǒng)的限制和天然免疫的激活等風(fēng)險的存在，Pfizer、Merck、Abbott Labs和Roche公司紛紛緊縮投資.從2012年至今，可作為s RNA藥物的恢復(fù)期，一些新的siRNA／miRNA藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)，已有20余種siRNA藥物處于臨床試驗(yàn)的不同時期；系統(tǒng)給藥的傳遞技術(shù)得到進(jìn)一步改進(jìn)，如穩(wěn)定的核酸脂顆粒（SNALP）技術(shù)平臺的建立，已有7種臨床試驗(yàn)藥：ALN-VSP02、TKMApoB、ALN-TTR01、TKM-PLK1、ALNPCS02、TKM-EBOLA和ALN-TTR02采用了此傳遞技術(shù)；通過化學(xué)和結(jié)構(gòu)修飾，如甲氧和乙氧以及閉鎖核酸的替代，使siRNA分子的競爭效益獲得明顯提高；同時通過生物信息學(xué)技術(shù)和化學(xué)修飾等方法，使siRNA分子的脫靶效應(yīng)得到極大改善.這方面的生物公司有：輝瑞制藥有限公司（Pfizer，Inc，擁有針對超過20個靶點(diǎn)的先導(dǎo)化合物）、miRagen Therapeutics公司（心血管疾病）、Shire plc（罕見遺傳性疾?。⒏鹛m素史克公司（GlaxoSmith Kline，擁有4個病毒疾病候選藥物）、Quark（視神經(jīng)病變QP1-1007）和Enzon Pharmaceuticals公司（8個癌癥靶向藥物，其中3個已進(jìn)入I期臨床研究）等多達(dá)20個.

在microRNA（miRNA）研究和開發(fā)方面，由于此小RNA在診斷和治療方面的潛力巨大，近來增長迅速，從而帶動了全球miRNA工具和服務(wù)市場的發(fā)展.據(jù)Frost&Sullivan公司預(yù)計(jì)，到2017年，全球miRNA市場的規(guī)模有望突破3億～5億美元.丹麥制藥公司Santaris首先成功研制了閉鎖核酸（LNA）藥物，這是一種基于microRNA靶向性的、可應(yīng)用于臨床試驗(yàn)的RNA技術(shù)平臺.2010年9月，Santaris制藥A／S公司成功地將miravirsen（一種靶向miR-122的microRNA候選藥物）推入了II期臨床試驗(yàn)治療丙型肝炎病毒感染患者.目前，Santaris制藥A／S公司推動兩種m RNA靶向性藥物，即靶向PCSK9的SPC5001和靶向apoB的SPC4955在2011年上半年進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)治療高膽固醇患者.2012年8月，來自英國的公司Silence制藥因其獨(dú)特的miRNA藥物技術(shù)獲得一次合作的機(jī)會，澳大利亞的研發(fā)公司MiReven希望Silence的技術(shù)可以被應(yīng)用于抗癌藥物miR-7上，這一藥物被認(rèn)為能夠沉默誘發(fā)癌癥的罪魁禍?zhǔn)住砥どL因子受體.

在我國，小核酸藥物產(chǎn)業(yè)主要是海外歸國創(chuàng)業(yè)人員為主體的企業(yè)（海歸創(chuàng)業(yè)企業(yè)）主導(dǎo)的，主要分布在長三角地區(qū)，其中，75%以上集中在江蘇省.具有一定規(guī)模和實(shí)力的企業(yè)包括：①吉康生物技術(shù)有限公司，已開發(fā)出全球第一款基于RNAi技術(shù)的商業(yè)化產(chǎn)品——泊爾亭娜，并獲得了國家食品藥品監(jiān)查局的特殊功效化妝品的批文，防治各類活性色斑的有效率高達(dá)90%［51-52］；2014年，又相繼完成了治療黃褐斑的siRNA藥物的臨床前試驗(yàn)，包括原料和制劑的生產(chǎn)工藝，原料和制劑的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)，原料和制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，原料和制劑的穩(wěn)定性，大小動物體內(nèi)藥效學(xué)和毒理學(xué)以及安全性（致畸變、治過敏和致腫瘤）等研究，正在申請一類新藥的臨床研究；②博奧邁科生物技術(shù)有限公司，主要從事治療AMD眼病的siRNA藥物的藥效學(xué)和治療乙肝和肝癌的siRNA藥物的藥效學(xué)研究和大規(guī)模的siRNA合成；③蘇州圣諾生物醫(yī)藥技術(shù)公司，致力于用于改善皮膚傷口愈合使傷口愈合后的疤痕最小化，用于呼吸道流感病毒感染的治療和用于治療HPV感染／宮頸癌的小RNA藥物的研究；④蘇州瑞博生物技術(shù)有限公司，從事小核酸設(shè)計(jì)、穩(wěn)定化、合成、代謝等研究，尤其在小核酸液相合成方面，抗脂肪肝小核酸藥物、抗視神經(jīng)病變小核酸藥物（QP1-1007）、抗EV71的小核酸藥物研發(fā)以及防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的小核酸藥物研究；⑤上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司和廣州銳博生物技術(shù)公司，主要提供化學(xué)合成siRNA產(chǎn)品，從事RNAi產(chǎn)品生產(chǎn)和研發(fā)服務(wù)；⑥上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，從事siRNA化學(xué)合成和RNA單體合成技術(shù)、普通和修飾的siRNA oligo合成技術(shù)、核酸熒光標(biāo)記技術(shù)、多種核苷酸化學(xué)修飾技術(shù)和shRNA質(zhì)粒載體構(gòu)建技術(shù)，慢病毒載體構(gòu)建以及包裝技術(shù)、micro RNA熒光定量PCR檢測試劑盒的研發(fā).在國家863、創(chuàng)新藥物重大專項(xiàng)、地方科技項(xiàng)目和一些大公司的資助下，我國的小核酸技術(shù)和藥物的研發(fā)已具備了一定基礎(chǔ)條件、設(shè)備儀器和技術(shù)平臺.在此基礎(chǔ)上，應(yīng)進(jìn)一步建立基于機(jī)理的理性siRNA藥物高通量篩選和設(shè)計(jì)技術(shù)平臺；建立安全有效的靶向小RNA分子的運(yùn)載系統(tǒng)，建立規(guī)模化合成高效穩(wěn)定的siRNA（如閉鎖核酸）藥物的生產(chǎn)工藝，建立小核酸藥物安全評價技術(shù)平臺、小核酸新藥臨床評價研究技術(shù)平臺、具有持續(xù)研發(fā)能力的siRNA藥物創(chuàng)新技術(shù)平臺以及小核酸原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等.這樣才能在小RNA藥物領(lǐng)域趕超世界先進(jìn)水平和保持我國的優(yōu)勢所在，在未來的歲月中，打造我國的sRNA藥物航空母艦，豎起引領(lǐng)國際小RNA藥物的標(biāo)桿，有可能在國際上研發(fā)出第一個和多個sRNA藥物.

5 問題和展望

隨著小RNA調(diào)控機(jī)制研究的不斷深入和RNA沉默技術(shù)應(yīng)用的逐漸展開，小RNA作為一種高效實(shí)用的基因功能研究方法和天然生物的活性成分，預(yù)示著一個嶄新的小RNA基因藥時代遲早會到來.這種造藥模式比現(xiàn)有的化藥制作更簡單實(shí)用，且其靶域更寬廣.如化藥的靶子往往是酶和受體，可用于5 000～10 000個蛋白活性中心的抑制，而人體實(shí)際上有30 000多個可引起疾病的蛋白.可見小RNA基因藥物與普通藥物相比，具有更好的應(yīng)用前景.再者，小RNA基因藥物非常高效，極少量的小RNA分子或其抑制劑就能使相關(guān)的靶分子沉默.近年來各種修飾技術(shù)的出現(xiàn)，如甲氧和乙氧等化學(xué)修飾使小RNA脫靶效應(yīng)明顯降低［7-8］，分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性大大提高，通過血液系統(tǒng)給藥成為可能.

研究表明，小RNA基因藥物在自然界已被多種生物用來抵抗病毒遺傳物質(zhì)的侵?jǐn)_，如植物細(xì)胞利用這種制藥模式來抵抗枯草病毒的繁殖，于是科學(xué)家們自然想到，這種小RNA基因藥物有望用于各種病毒引起的人類疾病的防治，如肝炎、艾滋病和腫瘤等，隨著技術(shù)的進(jìn)步和完善，小RNA基因藥物也可能用來治療人體的其他疾病，如心肌梗塞和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等.可以預(yù)見，在全球各大生物技術(shù)公司堅(jiān)持不懈的努力下，小RNA技術(shù)逐步完善，尤其是給藥系統(tǒng)的創(chuàng)新后，會再次推出利用小RNA藥物治療人類疾病的各種研發(fā)項(xiàng)目.如2014年，研究者在癌癥患者體內(nèi)直接導(dǎo)入特定miRNA，阻斷癌癥細(xì)胞發(fā)育，從而達(dá)到根治腫瘤的目的.具估計(jì)，該技術(shù)可能產(chǎn)生多種銷售額達(dá)數(shù)十億美元的新藥.

對小RNA基因藥物的研發(fā)熱情已促使這種藥

物以很快的速度進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但目前大部分小RNA基因藥物的研究仍然停留在早期開發(fā)階段——臨床前研究階段.雖然已解決了一些問題，如干擾素效應(yīng)、飽和效應(yīng)和脫靶效應(yīng)等［53-56］，但還有很多的難題和障礙需要解決.主要難題有兩個：其一是本文已提到的靶向型高效傳遞系統(tǒng)，這一問題解決之日，就是小RNA基因藥物蓬勃發(fā)展之時；其二是藥物效率，尤其是希望通過靶基因的抑制而達(dá)到摧毀或完全抑制宿主細(xì)胞的目的，如治療腫瘤.這預(yù)示著小RNA基因藥物批量進(jìn)入市場還有很長的路要走，有待各方面的共同努力，如政府和社會的政策和與資金的長期穩(wěn)定支持、研究人員的技術(shù)創(chuàng)新和不懈努力、相關(guān)高級人才的培養(yǎng)和使用以及制藥公司的膽識和長遠(yuǎn)規(guī)劃.可以預(yù)見，一個制造小RNA基因藥物的公司巨人總有一天會出現(xiàn).

［1］ Fire A，Xu S，Montgomery M K，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391：806-811.

［2］ Davidson B L，McCray Jr P B.Current prospects for RNA interference-based therapies［J］.Nat Rev Genet，2011，12：329-340.

［3］ Yin J Q，Wan Y.RNA-mediated gene regulation system：Now and the future［J］.Int J Mol Med，2002，10（4）：355-365.

［4］ Chen F，Yin J Q.miRNA regulating expression of genes［J］.Science Bulletin，2005，50（13）：1289-1299.

［5］ Jackson A L，Bartz S R，Schelter J，et al.Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi［J］.Nat Biotechnol，2003，21：635-637.

［6］ Karpala A J，Doran T J，Bean A G.Immune responses to ds RNA：Implications for gene silencing technologies［J］.Immunol Cell Biol，2005，83：211-216.

［7］ Scaggiante B，Dapas B，F(xiàn)arra R.Improving siRNA bio-distribution and minimizing side effects［J］.Curr Drug Metab，2011，12（1）：11-23.

［8］ Singh S，Narang A S，Mahato R I.Subcellular fate and off-target effects of siRNA，sh RNA and miRNA［J］. Pharm Res，2011，28（12）：2996-3015.

［9］ Yin J Q，Zhao R C.Identifying expression of new small RNAs by microarrays［J］.Methods，2007，43（2）：123-130.

［10］ Watanabe T，Totoki Y，Toyoda A，et al.Endogenous siRNAs from naturally formed dsRNAs regulate transcripts in mouse oocytes［J］.Nature，2008，453：539-543.

［11］ Friedman R C，F(xiàn)arh K K，Burge C B，et al.Most mammalian m RNAs are conserved targets of micro-RNAs［J］.Genome Res，2009，19（1）：92-105.

［12］ Yi R，Qin Y，Macara I G，et al.Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs［J］.Genes Dev，2003，17（24）：3011-3016.

［13］ Lee Y S，Nakahara K，Pham J W，et al.Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA／miRNA silencing pathways［J］.Cell，2004，117（1）：69-81.

［14］ Meister G，Landthaler M，Patkaniowska A，et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs［J］.Mol Cell，2004，15（2）：185-197.

［15］ Bartel D P.MicroRNAs：Target recognition and regulatory functions［J］.Cell，2009，136（2）：215-233.

［16］ Doench J G，Sharp P A.Specificity of microRNA target selection in translational repression［J］.Genes Dev，2004，18（5）：504-511.

［17］ Denli A M，Tops B B，Plasterk R H，et al.Processing of primary micro RNAs by the microprocessor complex［J］.Nature，2004，432（7014）：231-235.

［18］ Guo H，Ingolia N T，Weissman J S，et al.Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target m RNA levels［J］.Nature，2010，466（7308）：835-840.

［19］ Nguyen T T，Brenu E W，Staines D R，et al.Micro-RNAs in the intracellular space，regulation of organelle specific pathways in health and disease［J］.Microrna，2015，3（2）：98-107.

［20］ Vasudevan S，Tong Y，Steitz J A.Switching from repression to activation：MicroRNAs can up-regulate translation［J］.Science，2007，318（5858）：1931-1934.

［21］ Li M A，He L.microRNAs as novel regulators of stem cell pluripotency and somatic cell reprogramming［J］.Bioessays，2012，34（8）：670-680.

［22］ Lipchina I，Studer L，Betel D.The expanding role of miR-302-367 in pluripotency and reprogramming［J］. Cell Cycle，2012，11（8）：1517-1523.

［23］ Spierings D C，McGoldrick D，Hamilton-Easton A M. et al.Ordered progression of stage-specific miRNA profiles in the mouse B2 B-cell lineage［J］.Blood，2011，117（20）：5340-5349.

［24］ Lu T Y，Lin B，Li Y，et al.Overexpression of micro-RNA-1 promotes cardiomyocyte commitment from human cardiovascular progenitors via suppressing WNT and FGF signaling pathways［J］.J Mol Cell Cardiol，2013，63：146-154.

［25］ Lu J，Getz G，Miska E A，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers［J］.Nature，2005，435（7043）：834-838.

［26］ Lin H，Michael T J，Hemann M T，et al.A microRNA polycistron as a potential human oncogene［J］. Nature，2005，435（7043）：828-833.

［27］ Esquela-Kerscher A，Slack F J.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer［J］.Nat Rev Cancer，2006，6（4）：259-269.

［28］ Cheng C J，Bahal R，Babar I A，et al.MicroRNA silencing for cancer therapy targeted to the tumour microenvironment［J］.Nature，2014，518：107-110.

［29］ Park E Y，Chang E，Lee E J，et al.Targeting of miR34a-NOTCH1 axis reduced breast cancer stemness and chemoresistance［J］.Cancer Res，2014，74（24）：7573-7582.

［30］ Srivastava A，F(xiàn)ilant J，Moxley K M，et al.Exosomes：A role for naturally occurring nanovesicles in cancer growth，diagnosis and treatment［J］.Curr Gene Ther，DOI：10.1007／s00018-014-1811-0，2014（published online）.

［31］ Clancy C，Joyce M R，Kerin M J.The use of circulating microRNAs as diagnostic biomarkers in colorectal cancer［J］.Cancer Biomark，DOI：10.3233／CBM-140456，2014（published online）.

［32］ Penfornis P，Vallabhaneni K，Whitt J，et al.Extracellular vesicles as carriers of microRNA，proteins and lipids in tumor microenvironment［J］.Int J Cancer，DOI：10.1002／ijc.29417，2015（published online）.

［33］ Valadi H，Ekstr?m K，Bossios A，et al.Exosomemediated transfer of m RNAs and microRNAs is a novel mechanismof genetic exchange between cells［J］. Nat Cell Biol，2007，9（6）：654-659.

［34］ Choi D S，Kim D K，Kim Y K，et al.Proteomics，transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes［J］.Proteomics，2013：13（10-11）：1554-1571.

［35］ Nishida-Aoki N，Ochiya T.Interactions between cancer cells and normal cells via miRNAs in extracellular vesicles［J］.Cell Mol Life Sci，DOI：10.1007／s00018-014-1811-0，2015（published online）.

［36］ Wolfrum C，Shi S，Jayaprakash K N，et al.Mechanisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs［J］.Nat Biotechnol，2007，25（10）：1149-1157.

［37］ Gosselin M A，Lee R J.Folate receptor-targeted liposomes as vectors for therapeutic agents［J］.Biotechnol Annu Rev，2002，8：103-131.

［38］ Alvarez-Erviti L，Seow Y，Yin H，et al.Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes［J］.Nat Biotechnol，2011，29（4）：341-345.

［39］ Soutschek J，Akinc A，Bramlage B，et al.Therapeuticsilencing of an endogenous gene by systemic administration of modified Chol-siRNAs［J］.Nature，2004，432（7014）：173-178.

［40］ Nishina K，Unno T，Uno Y，et al.Efficient in vivo delivery of siRNA to the liver by conjugation of alphatocopherol［J］.Mol Ther，2008，16（4）：734-740.

［41］ Schiffelers R M，Ansari A，Xu J，et al.Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle［J］.Nucleic Acids Res，2004，32（19）：e149.

［42］ Dickerson E B，Blackburn W H，Smith M H，et al. Chemosensitization of cancer cells by siRNA using targeted nanogel delivery［J］.BMC Cancer，2010，10：10.

［43］ Chu T C，Twu K Y，Ellington A D，et al.Aptamer mediated siRNA delivery［J］.Nucleic Acids Res，2006，34（10）：e73.

［44］ Shim M S，Kwon Y J.Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo［J］.FEBS J，2010，277（23）：4814-4827.

［45］ Jeong J H，Mok H，Oh Y K，et al.siRNA conjugate delivery systems［J］.Bioconjug Chem，2009，20（1）：5-14.

［46］ Ikeda Y，Taira K.Ligand-targeted delivery of therapeutic siRNA［J］.Pharm Res，2006，23（8）：1631-1640.

［47］ Cesarone G，Edupuganti O P，ChenC P，et al.Insulin receptor substrate 1 knockdown in human MCF7 ER+breast cancer cells by nuclease-resistant IRS1 siRNA conjugated to a disulfide-bridged D-peptide analogue of insulin-like growth factor 1［J］.Bioconjug Chem，2007，18（6）：1831-1840.

［48］ Kim S H，Mok H，Jeong J H，et al.Comparative evaluation of target-specific GFP gene silencing efficiencies for antisense ODN，synthetic siRNA，and siRNA plasmid complexed with PEI-PEG-FOL conjugate［J］.Bioconjug Chem，2006，17（1）：241-244.

［49］ Kumar P，Wu H，McBride J L，et al.Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system［J］.Nature，2007，448（7149）：39-43.

［50］ 張洪杰，殷勤偉.細(xì)胞穿透肽及其結(jié)構(gòu)改造在siRNA傳遞中的應(yīng)用［J］.Prog Biochem Biophys，2012，39（5）：402-409.

［51］ 張洪杰，殷勤偉.基于RNAi技術(shù)產(chǎn)品的商業(yè)化［J］.生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)，2011，4：201-208.

［52］ Yi X，Zhao G，Zhang H，et al.MITF-siRNA formulation is a safe and effective therapy for human melasma［J］.Mol Ther，2011，19（2）：362-371.

［53］ Anderson E M，Birmingham A，Baskerville S，et al. Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity［J］.RNA，2008，14（5）：853-861.

［54］ Khvorova A，Reynolds A，Jayasena S D.Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias［J］.Cell，2003，115（2）：209-216.

［55］ Chen P Y，Weinmann L，Gaidatzis D，et al.Strandspecific 5’-O-methylation of siRNA duplexes controls guide strand selection and targeting specificity［J］. RNA，2008，14（2）：263-274.

［56］ Chalk A M，Sonnhammer E L.siRNA specificity searching in-corporating mismatch tolerance data［J］. Bioinformatics，2008，24（10）：1316-1317.

（編輯 呂丹）

Status Quo and Perspective of Small RNA Gene Medicine Research and Development

WANG Shan-shan1， YI Ba-xian2， YIN Qin-wei1
（1.Translational Center，The General Military Hospital of Beijing，Beijing 100700，China；2.China State Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 200040，China）

The key components of RNAi technology include siRNA，miRNA，sh RNA and dsRNA.Owing to their high specificity and efficiency in the knockdown of target genes specific for diseases，RNAi technology has turned out to be a promising strategic platform for the development of new drugs in future. However，through more than one decade of research and development，it has become clear that the industrialization of this revolutionary technology is full of different challenges.The review has summarized present conditions，related problems and future trends.

small RNA；gene medicine；research development

R 394；Q 52

A

1671-7333（2015）01-0001-08

10.3969／j.issn.1671-7333.2015.01.001

2015-01-23

王姍姍（1981-），女，助理研究員，主要研究方向?yàn)樾NA誘導(dǎo)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化等.E-mail：Wangss_2007＠yahoo.com.cn

殷勤偉（1956-），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樯镄畔W(xué)、功能基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和小RNA組學(xué)等. E-mail：jamesyin2010＠126.com