• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    蛋白性半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CPIs)及在魚類中的研究進(jìn)展

    2015-02-12 19:38:30李樹紅蔣然然馬璐陽
    關(guān)鍵詞:半胱氨酸蛋白酶抑制劑

    李樹紅,蔣然然,馬璐陽

    四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,雅安 625014

    半胱氨酸蛋白酶抑制因子(Cysteine proteinase inhibitors,CPIs),是一類專門抑制活性中心含有半胱氨酸(CySH)殘基的蛋白酶水解作用的抑制因子[1]。最近十幾年內(nèi),在蛋白性CPIs 領(lǐng)域的研究取得了顯著的進(jìn)展。雖然上世紀(jì)60年代以來發(fā)現(xiàn)的Cystatins 仍然是目前鑒定的最徹底的一個(gè)超家族,但是近些年來個(gè)別新的大家族或一些較小的家族也陸續(xù)得到鑒定。事實(shí)是,CPIs 廣泛分布在動(dòng)植物體內(nèi),且只要有蛋白酶參與的反應(yīng)中,都會(huì)有蛋白性的調(diào)節(jié)因子出現(xiàn)。因此,CPIs 在蛋白的分解代謝、生物防御、感染與免疫、癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡等各生理或病理過程中都發(fā)揮著重要作用。然而,目前對(duì)魚類CPIs 的鑒定工作尚不完善,其潛在的活性、功能也有待進(jìn)一步深入研究。因此,本文在介紹了動(dòng)植物源CPIs 的類群組成,結(jié)構(gòu)特征、抑制機(jī)制及其活性、功能的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步系統(tǒng)地綜述了魚類來源的各種CPIs 的純化、鑒定、潛在的活性及功能,并展望了其應(yīng)用前景。

    1 CPIs 的分類

    1.1 CPIs 第一類群

    根據(jù)結(jié)構(gòu)特征的不同,已將蛋白性CPIs 拓展為若干個(gè)群。第一群是嚴(yán)格意義上的CPIs 超家族(即Cystatins 超家族)。該群主要分為三個(gè)亞家族:

    (1)Stefins(家族Ⅰ),約10 kDa,是Cystatins 超家族的原型,無二硫鍵及糖基化側(cè)鏈,該抑制劑包括人Stefin A、B,PLCPI(豬白細(xì)胞CPI)以及鼠Stefins α 與β 五種形式[2]。

    (2)Cystatins(家族Ⅱ),約12~14 kDa,在原型基礎(chǔ)上,其C-端衍生出具有兩個(gè)特征性二硫鍵的肽段,N 端有一胞外定位的信號(hào)肽,且通常不具糖基化側(cè)鏈,該抑制劑有雞蛋白cystatin 及Cystatins C、D、E/M、F、G(CRES)、S、SN 和SA 幾種形式[2]。

    (3)Kininogens(家族Ⅲ),約50~120 kDa,其重鏈由三個(gè)重復(fù)的類Cystatin(家族Ⅱ)結(jié)構(gòu)域組成,其中后兩個(gè)域表現(xiàn)出抑制活性,而輕鏈(包括域5及域6)決定了其分子量的大小,重鏈和輕鏈之間由血管舒緩激肽(域4)相連接。除重鏈內(nèi)存在8 個(gè)二硫鍵外,重鏈和輕鏈間還有1 個(gè)鏈間二硫鍵。Kininogens 在生物體內(nèi)通常以糖基化的形式存在。目前已知HMW,LMW 和鼠類T-Kininogen 三種類型[3]。

    此外,植物源的Cystatins(Phytocystatins)與動(dòng)物來源的Stefins 和Cystatins(家族Ⅱ)的不同之處僅在于其具有特有的LARFADEHN 共識(shí)序列[4]。因此,Phytocystatins 也被劃分為Cystatins 超家族中一個(gè)獨(dú)特的亞家族。

    1.2 CPIs 第二類群

    第二群,與第一群的Cystatins 超家族結(jié)構(gòu)相似,但無抑制活性,如胎球蛋白(Fetuins)、富含組氨酸的糖蛋白以及其他Cystatin 相關(guān)蛋白及恒定鏈等[5]。有研究表明,除日本響尾蛇(Japanese Habu snake,Trimeresurus flavoviridis)Fetuin 含有13 個(gè)半胱氨酸殘基外[6],其他所有的Fetuins 都包含12 個(gè)半胱氨酸殘基。并且已經(jīng)從人類、小鼠、兔子、牛以及豬血漿中純化出富含組氨酸的糖蛋白[7]。

    1.3 CPIs 第三類群

    第三群為與Cystatins 超家族不具結(jié)構(gòu)同源性的CPIs,主要包括以下七類:

    1.3.1 Thyropins 家族

    Thyropins 家族,即甲狀腺球蛋白I 型域(Thyr-1 domain)抑制劑家族[8],是第三群CPIs 中最大的一類。甲狀腺球蛋白I 型域是富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)單元,以單一或重復(fù)序列在多種功能上并不相關(guān)的蛋白中存在。主要包括甲狀腺激素類前體、甲狀腺球蛋白、基膜蛋白、巢蛋白(內(nèi)功素)、睪丸蛋白多糖、睪丸蛋白聚糖、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBPs),胰腺癌的標(biāo)志蛋白(GA733),MHC II-結(jié)合的p41 恒定鏈片段[9]、???Sea anemone,Actinia equina)抑 制 劑Equistatin[10]、鮭(Chum salmon,Oncorhynchus keta)卵半胱氨酸蛋白酶抑制劑[11](ECI)和北美牛蛙(North American bullfrog,Rana catesbiana)血漿中的神經(jīng)毒素saxiphilin[12]等。其中,經(jīng)鑒定主要是最后4 種抑制劑對(duì)木瓜蛋白酶家族C1 具有可逆抑制活性。甲狀腺球蛋白及巢蛋白(內(nèi)功素)不具抑制活性,而其他蛋白的抑制活性不清楚或尚未測(cè)試。

    1.3.2 類/前體肽家族

    類木瓜蛋白酶通常以失活酶原的形式翻譯表達(dá)。其N 端前體肽的有效抑制導(dǎo)致酶原活性缺失。只有在靶位點(diǎn),前體肽發(fā)生限制性蛋白水解,酶才表現(xiàn)出自身的活性。前體肽是一種競(jìng)爭(zhēng)性慢結(jié)合抑制劑,與廣譜的Cystatins 不同,它對(duì)與其同源的酶具有高度的選擇性[2]。除了作為抑制劑外,前體肽還能幫助同源酶正確的折疊和定位,并穩(wěn)定同源酶。

    1.3.3 IAP 家族

    細(xì)胞凋亡抑制劑IAPs,是一類家族蛋白,其明顯特征是包含了一個(gè)或多個(gè)含有70 氨基酸殘基以上的鋅結(jié)合BIR 域,且每個(gè)BIR 包括3 個(gè)保守的半胱氨酸殘基和1 個(gè)保守的組氨酸殘基[13]。IAPs 被初步鑒定為細(xì)胞凋亡抑制因子,能夠直接抑制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性半胱氨酸蛋白酶caspases 的活性。

    與其他抑制劑蛋白不同,BIR 域并非是一個(gè)獨(dú)立的抑制單位。對(duì)于不同的caspases,IAPs 的抑制機(jī)制也不盡相同。因此,IAPs 的分類,是根據(jù)與BIR domain 的結(jié)構(gòu)相似性及其在凋亡路徑中的一般性功能,而并非根據(jù)其抑制機(jī)制。

    首次對(duì)IAPs 的報(bào)道,是發(fā)現(xiàn)桿狀病毒中存在細(xì)胞凋亡抑制因子p35 蛋白[14]。目前已知從酵母菌到哺乳動(dòng)物的生物體中均存在IAPs。已經(jīng)鑒定得到8 個(gè)人類IAPs[15]:X 染色體連鎖的IAP(XIAP/ILP-1/MIHA),c-IAP1 (HIAP-2/MI-HB),c-IAP2(HIAP-1/MIHC),神經(jīng)元凋亡抑制蛋白(NAIP),生存素(Survivin/TIAP),Livin(ML-IAP/KIAP),ILP-2(Ts-IAP)和apollon(Bruce)。其中,前五種IPAs 的過量表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡。

    1.3.4 Calpastatin 家族

    Calpastatin 是鈣激活中性半胱氨酸蛋白酶calpains 的一類特異的內(nèi)源性抑制劑,并不抑制其他半胱氨酸蛋白酶,且Calpains 的活性也只受Calpastatin調(diào)節(jié)。然而,有學(xué)者研究表明Calpastatin 的磷酸化可以影響其對(duì)某些calpains 的抑制活性[16]。此外,Calpastatin 與其他已知蛋白無序列相似性[5]。且calpastains 的激活可能與某種細(xì)胞凋亡路徑有關(guān),合成的calpain 抑制劑及注射或過量表達(dá)calpastain時(shí),能夠使得一些細(xì)胞免于凋亡[17,18]。Calpastatin水平的持續(xù)降低則可以加快凋亡細(xì)胞的死亡速度[18]。

    1.3.5 Chagasins 家族

    Chagasin (Q966X9)最早是在克氏錐蟲(Trypanozoma cruzi)中發(fā)現(xiàn)的一種CPI,對(duì)來自錐形蟲的半胱氨酸蛋白酶cruzipain 和木瓜蛋白酶,均具有抑制活性。但是Chagasin 具有類免疫球蛋白的全β 折疊結(jié)構(gòu),因此與Cystatins 超家族及其他已知群都沒有同源性[19]。此后,Chagasin 的同系物在布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、利什曼蟲屬(Leishmania sp)、瘧原蟲屬(Plasmodium sp)以及細(xì)菌(Pseudomonas aeruginosa)的基因組中得到鑒定[20,21],進(jìn)而形成了Chagasins 家族。

    1.3.6 Mycocypins 家族

    Clitocypin(P82314)是一種從水粉杯傘(Clitocybe nebularis)子實(shí)體中提取的新型CPI,其氨基酸序列除與從白黃側(cè)耳(Pleurotus Cornucopiae)中分離的一種類凝集素蛋白相似外,與任何已知的CPIs 或其他蛋白都沒有明顯的相似性[22]。因此,提出一個(gè)新的CPI 家族稱為Mycocypins。該蛋白質(zhì)以非共價(jià)形成的二聚體形式和酶以1∶1 比率結(jié)合,從而抑制C1 家族蛋白酶:木瓜蛋白酶、組織蛋白酶L 和B 以及菠蘿蛋白酶。此后,從擔(dān)子菌高大環(huán)柄菇(Parasol mushroom,Macrolepiota procera)中分離出另一種Mycocypins 家族的抑制因子Macrocypins[23]。

    1.3.7 Staphostatins 家族

    對(duì)葡萄球菌屬微生物半胱氨酸蛋白酶staphospain 具有專一抑制活性的Staphostatins,構(gòu)成了一個(gè)新的抑制因子家族。已經(jīng)鑒定得到該家族的三個(gè)成員,分別是來自金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Staphostatin A 和B,表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的Staphostatin A,三者都具有非常嚴(yán)格的專一性[24]。

    2 CPIs 的結(jié)構(gòu)及抑制機(jī)制

    1988年Bode W 等[25]利用X 射線衍射法對(duì)雞蛋白Cystatin(家族II)和stefin B 進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)分析,表明兩類分子二級(jí)結(jié)構(gòu)相似,主要由5 個(gè)α-螺旋和5 股反平行的β-折疊片以及1 個(gè)附加不完全的α-螺旋所構(gòu)成,其中β-折疊片包覆、纏繞在α-螺旋的周遭[25]。β1 位于N 端,β2-5 位于C 端。在β 片層的末端,暴露出第1 個(gè)β 發(fā)卡環(huán)(保守序列Q-XV-X-G),其兩側(cè)分別為N 末端區(qū)域(含有一個(gè)保守的G)和第二個(gè)β 發(fā)卡環(huán)(保守序列P-W)。這3 個(gè)存在活性保守序列的結(jié)構(gòu)域形成1 個(gè)三邊楔形結(jié)構(gòu),占據(jù)了木瓜蛋白酶的與底物結(jié)合的位點(diǎn),從而起到了抑制木瓜蛋白酶的作用。

    3 CPIs 的生理活性、功能

    3.1 CPIs 與腫瘤的關(guān)系

    CPIs 能抑制細(xì)胞內(nèi)外的半胱氨酸蛋白酶,在腫瘤的生長(zhǎng)、血管新生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起重要調(diào)節(jié)作用,可作為腫瘤診斷和預(yù)后估計(jì)的標(biāo)志物。Strojan P 等[26]研究頭頸癌發(fā)現(xiàn),高濃度Stefin A 可防止手術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)。此外,Jin L 等[27]研究表明Cystatin E/M(CST6)可以抑制乳癌細(xì)胞增生,克隆形成,遷移以及侵入。Kininogen 的域5 及其組成肽具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增生及血管形成和腫瘤生長(zhǎng)的作用[28]。當(dāng)克隆的人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480-ADH 中缺乏內(nèi)源Cystatin D 時(shí),外源Cystatin D 的表達(dá)既可以抑制體外癌細(xì)胞增殖也可以抑制異種移植腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)。而且,CystatinD 可通過對(duì)抗Wnt/β-catenin 信號(hào)途徑,抑制c-MYC 及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換誘導(dǎo)因子SNAI1,SNAI2,ZEB1,ZEB2 的表達(dá),抑制癌細(xì)胞的分化增殖。相反地,Cystatin D 誘導(dǎo)了E-cadherin等其他粘附蛋白的表達(dá)從而增強(qiáng)細(xì)胞的粘附性。還能夠抑制癌細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng),因此Cystatin D 被認(rèn)為是一個(gè)抑制癌癥的候選基因[29]。

    3.2 CPIs 與細(xì)胞凋亡的關(guān)系

    此外,CPIs 與細(xì)胞凋亡有關(guān)。在不同的細(xì)胞環(huán)境下,Cystatin C 會(huì)參與多種信號(hào)路徑,從而調(diào)節(jié)(誘導(dǎo)或抑制)細(xì)胞的凋亡,Cystatin C 通過JNK(c-Jun氨基末端激酶抑制劑)-依賴路徑可誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[30]。同時(shí),Kininogen 的域5 可以誘導(dǎo)人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMECs)凋亡并干擾細(xì)胞周期[31],這種抑制也是與培養(yǎng)基質(zhì)成分有關(guān),而且依賴于細(xì)胞內(nèi)活性氧組分的產(chǎn)生,同時(shí)伴隨了谷胱甘肽和內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物的清除。此外,氧化性應(yīng)激促進(jìn)了培養(yǎng)神經(jīng)元中Cystatin C 的表達(dá),而Cystatin C 可能對(duì)氧化性應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡起到重要的調(diào)節(jié)作用[32]。而IAPs 則可在人類各種癌細(xì)胞中異常大量表達(dá),使得癌細(xì)胞逃避凋亡[33]。

    3.3 CPIs 與免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系

    CPIs 與免疫調(diào)節(jié),關(guān)系密切。Staun-Ram E等[34]研究表明,組織蛋白酶可能在免疫細(xì)胞遷移中起作用,因?yàn)镃ystatin C 可以降低單細(xì)胞和T 細(xì)胞的遷移能力。同時(shí),組織蛋白酶S 和B 的特異性抑制劑并不影響單細(xì)胞遷移,但可以顯著的抑制T 細(xì)胞遷移。

    有研究表明Cystatin C 在抗原呈遞過程中對(duì)恒定鏈Ii 的降解和MHC(主要組織相容性抗原系統(tǒng)major histocompatibility system)的轉(zhuǎn)運(yùn)起了不可忽視的調(diào)控作用[35]。此外,Cystatins 超家族的3 個(gè)家族代表性成員(人Stefin B、雞Cystatin、鼠T-kininogen)均能上調(diào)IFN-γ 活化的MPMs(巨噬細(xì)胞)合成NO,而對(duì)未活化的MPMs 不起作用[36]。并且,CPIs 還能夠通過調(diào)節(jié)TNF-α、IL-10[37]、IL-6、IFN-γ[38]等免疫相關(guān)細(xì)胞因子的水平,進(jìn)而調(diào)節(jié)T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能,參與免疫調(diào)節(jié)[37-39]。

    3.4 CPIs 與骨改建調(diào)節(jié)的關(guān)系

    CPIs 參與骨改建的調(diào)節(jié),具有抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成的活性,這對(duì)預(yù)防骨質(zhì)疏松具有意義。然而CPIs 對(duì)骨生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)機(jī)制,尚不完全清楚。研究證實(shí)分泌型的Cystatin(家族II)[40,41]和胞內(nèi)型的人Stefin B(家族I)[42]均可通過抑制骨陷窩中組織蛋白酶Cathepsin K、L 等對(duì)骨基質(zhì)膠原蛋白的降解,起到保護(hù)骨有機(jī)成分免于過度溶解的作用。同時(shí),近年來發(fā)現(xiàn)人Cystatin C 和雞蛋白Cystatin 還能夠抑制破骨細(xì)胞的分化和生成,防止骨的過度吸收,但對(duì)成熟的破骨細(xì)胞無作用[43]。

    牛HMW-Kininogen(家族III)經(jīng)胃蛋白酶消化后釋放的片段1.2(即Domain5)對(duì)培養(yǎng)16 h[44]或24 h[45]的OB 有促增殖活性,且片段1.2 經(jīng)模擬胃液消化后得到的13 KDa 片段(Fr13)和8 KDa 片段(Fr8),活性仍然存在,能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的增殖,并減少成骨細(xì)胞的凋亡,利于骨形成[45]。也有學(xué)者推測(cè)人的Cystatin C 通過BMP2-Runx2-OCN 信號(hào)級(jí)聯(lián),促進(jìn)ALP 活性和鈣結(jié)節(jié)形成,增強(qiáng)骨質(zhì)礦化[46]。

    3.5 CPIs 的抑菌活性

    目前,相關(guān)研究表明,某些陸生動(dòng)物及植物來源的Cystatin(家族II)表現(xiàn)了抗菌活性。人類唾液Cystatin C[47]能夠抑制A 鏈球菌群(group Astreptococci)的生長(zhǎng),人[48]及小鼠[49]來源的Cystatin S 能夠抑制牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)的生長(zhǎng);從雞蛋白中提取的Cystatin 在低濃度即可對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)產(chǎn)生明顯抑制效果[50];長(zhǎng)春花中純化的phytocystatin 能夠抑制大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[51]。Nordahl EA[52]等報(bào)道了哺乳動(dòng)物高分子Kininogen 結(jié)構(gòu)域5 的富含組氨酸的小肽(由20 個(gè)氨基酸殘基組成),能夠有效殺死了革蘭氏陰性腸桿菌、假單胞菌以及革蘭氏陽性的腸球菌。此外Domain 5 中的肽段HKH20(His479-His498)還具有抗真菌活性,能抑制假絲酵母菌屬(Candida)和馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)[53]。

    Cystatin 主要作為一種分泌型抑制劑,其抑菌的機(jī)制,一方面可能其通過抑制細(xì)菌本身分泌的胞外半胱氨酸蛋白酶而發(fā)揮抑菌作用[50]。另一方面Cystatins N 端與半胱氨酸蛋白酶相互作用的保守序列,會(huì)與細(xì)菌微生物膜上的負(fù)電荷相結(jié)合[54],甚至穿透細(xì)菌細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部,抑制胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶[55],從而起到抗菌作用。Kininogen 的Domain 5 中的肽段HKH20 則能夠與真菌細(xì)胞膜結(jié)合[53]。

    4 魚類CPIs 的純化鑒定

    迄今為止,關(guān)于魚類半CPIs 的研究報(bào)道較少,許多鑒定工作尚未開展。僅從少數(shù)幾類魚中純化了CPIs,而在其分類和作用機(jī)制方面的研究尚不深入。

    4.1 Stefins

    從玻璃魚(Glassfish,Liparis tanakai)卵中純化的18 kDa 的CPI,因不具有活性必需的二硫鍵,因此被推測(cè)為Stefin 類(家族I)[56]。

    4.2 Cystatins

    繼在大麻哈魚(Chum salmon,Oncorhynchus keta)的多個(gè)組織(肝臟、卵巢、睪丸、心臟、紅色肌、白色肌、血清、腎、胃、鰓、皮、腸、盲腸管等)中發(fā)現(xiàn)CPIs 抑制活性[57]后,又從其腦下垂體中純化并鑒定出了分子量14 kDa 的Cystatin(家族II),由111 個(gè)氨基酸序列組成,在C 端66~75 和89~109 位存在兩個(gè)二硫鍵。其抑制活性位點(diǎn)與雞卵白蛋白Cystatin 一致即Gly(4),Gln-X-Val-X-Gly(48-52),Ile(Val)-Pro-Trp(96~98)[58]。

    從歐洲金鯽(Golden crucianCarassius auratus)卵中純化出了在還原條件下分子量為11.9 和14.4 kDa,而在非還原條件下分子量為13.5 和12.7kDa的cst-I 和cst-II。cst-I 片段與普通鯽魚Cystatin 氨基酸序列間有88.9%的同源性,而與其他水生動(dòng)物Cystatins 的N 端序列有44.4%~55.6%的同源性,因此推測(cè)其屬于家族II[59]。

    臺(tái)灣學(xué)者對(duì)普通鯉魚(Carp,Cyprinus carpio)卵CPI(具有家族II 的部分特征)進(jìn)行的純化、活性及結(jié)構(gòu)鑒定及克隆表達(dá),其與雞蛋白Cystatin(家族II)、鱘魚、鮭魚以及人的Cystatin C 的同源性較低[60,61]。且容易形成二聚體,可能與其蛋白序列中親水性Met 62 的位置有關(guān)[62]。

    此外,從鰱魚(Silver carp,Hypophthalmichthys molitrix)卵中分離純化的小分子CPIs 組分(10.5 kDa、16.5 kDa 和12 kDa、7kD 和10kd)均可顯著的抑制半胱氨酸組織蛋白酶引起的肌球蛋白的降解[63,64]。

    4.3 Kininogens

    Kim Y 及Li DK 等2006 及2008年[65,66]陸續(xù)報(bào)道了從大麻哈魚(Chum salmon,Oncorhynchus Keta)的卵及血漿中純化出了72.6 kDa 和70 kDa 的高分子CPIs,并推測(cè)為Kininogen(家族III)。其中,卵中純化的72.6 kDa 的CPI,是由2 條分子量分別為54和18.6 kDa 的多肽鏈組成的異源二聚體,對(duì)木瓜蛋白酶的抑制活性低于70 kDa 抑制劑蛋白。

    芬蘭學(xué)者從大西洋鮭魚(Atlantic salmon,Salmo salarL.)[67]、花狼鳚(Spotted wolfish,Anarhichas minor)及大西洋鱈魚(Atlantic cod,Gadus morhua)[68]皮膚中純化的52 kDa、51.0 kDa 和45.8 kDa 的CPI,因其序列中含有魚的bradykinin 結(jié)構(gòu)域,因此將其歸為Kininogens(家族III)。上述三種Kininogens(家族III)都具有脊椎動(dòng)物中常見的唾液酸化的二天線或三天線型的N-糖苷多糖和雙唾液酸化一型核的O-糖苷多糖。此外,不同的糖基化作用也導(dǎo)致CPIs 產(chǎn)生了不同的等電點(diǎn)[68]。

    此外,宋川從鰱魚(Silver carp,Hypophthalmichthys molitrix)卵中純化出了89 kDa 大分子CPI-I,為糖蛋白,且可抑制鰱魚組織蛋白酶L,并具有顯著的熱穩(wěn)性[69]。

    4.4 Thyropins

    在大麻哈魚(Chum salmon,Oncorhynchus keta)卵中又純化了一種Thyropin 類的9 kDa CPI,其類thyroglobulin 的結(jié)構(gòu)域功能尚不清楚,抑制作用機(jī)制也有待研究[70]。

    4.5 類前體肽類

    Olonen A[71]等證明在大西洋鮭魚(Atlantic salmon,Salmo salarL)以及紅點(diǎn)鮭(Arctic charr,Salvelinus alpinus)中存在的salarin gene 編碼了一種類似前體肽的CPI,并從大西洋鮭(Atlantic salmon,Salmo salarL)魚皮中分離得到了分子量43 kDa,pI 5.1 的一種新型的類似前體肽的CP,即salarin,其可以抑制木瓜蛋白酶和無花果蛋白酶,但不抑制胰蛋白酶[67]。

    4.6 Calpastatin

    除了從虹鱒魚(Rainbow trout,Oncorhynchus mykiss)[72]中克隆表達(dá)出兩種Calpastatins 外,還有學(xué)者[73]從大西洋鮭(Atlantic salmon,Salmo salarL.)魚肉中純化出兩種Calpastatins,而在哺乳動(dòng)物只發(fā)現(xiàn)了一種Calpastatin,這些都暗示了魚肉Calpastatin 與哺乳動(dòng)物不同。與哺乳動(dòng)物Calpastatins相比,魚類Calpastatins 具有更少的重復(fù)抑制區(qū)域[72]Calpastatins 表達(dá)與抑制活性與魚肉片品質(zhì)之間存在潛在關(guān)聯(lián)[74]。

    4.7 其他新類別

    日本學(xué)者依次從日本鰻魚(Anguilla japonica)皮膚粘液中純化的Eel-CPI-1[75]以及Eel-CPI-2、Eel-CPI-3[76],僅能抑制木瓜蛋白酶對(duì)蛋白大分子底物的水解。該類CPI 可能與木瓜蛋白酶以非共價(jià)鍵方式結(jié)合,其氨基酸組成和分子量及N 端封閉的結(jié)構(gòu)特征都分別與日本鰻魚皮膚粘液中的凝集素AJL2以及AJL1 很相似,因此,推測(cè)可能是一類新蛋白酶抑制劑,但尚需要進(jìn)一步證實(shí)。

    總之,有關(guān)魚類CPIs 的分子結(jié)構(gòu)、種類組成、生理活性等有待進(jìn)一步研究。

    5 魚類CPIs 的活性及功能

    魚類由于其進(jìn)化地位和生活環(huán)境的特殊性,其CPIs 可能在結(jié)構(gòu)和功能方面,與哺乳動(dòng)物有所差異,甚至存在某種特殊的活性或作用機(jī)制。然而目前對(duì)魚類CPIs 功能了解甚微,相關(guān)報(bào)道也寥寥無幾。

    5.1 CPIs 在發(fā)育保護(hù)方面的作用

    鱸魚孵化后7 d 的卵中Cathepsin L 活性越高,孵化率越低[77]。Li F 等[78]研究表明在虹 鱒魚(Rainbow trout,Oncorhynchus mykiss)胚胎組織中Cystatin C(家族II)的mRNA 表達(dá)豐富,可能對(duì)發(fā)育中的胚胎有保護(hù)作用。另外,近年來有學(xué)者研究證明鯉魚卵Cystatin 能夠通過凝集精子防止鯉魚卵多精受精,并且其抑制能力受鹽濃度和pH 的影響很大[79]。

    5.2 CPIs 在免疫調(diào)節(jié)方面的作用

    Li S 等[80]研究發(fā)現(xiàn)克隆表達(dá)的大黃魚(Large yellow,CroakerLarimichthys crocea)Cystatin(家族II)類似物,注射后能夠刺激大黃魚脾和腎中免疫相關(guān)基因TNF-α 和IL-10 mRNA 水平的上調(diào)。另外,其研究還表明,在三聯(lián)滅活細(xì)菌疫苗或poly(I:C)作為刺激物進(jìn)行誘導(dǎo)后,Lycstefin 基因在大黃魚腎和脾中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有不同程度的上調(diào),在血液中則有不同程度的下調(diào),同時(shí)還表明Lycstefin 參與細(xì)菌或病毒引起的免疫應(yīng)答,對(duì)細(xì)菌引起的免疫反應(yīng)在較晚時(shí)間作出應(yīng)答[81]。此外,大菱鲆(Turbot,Scophthalmus maximus)的Stefin B(家族I)參與了抗細(xì)菌感染的免疫機(jī)制,其基因SmCytB 在頭腎巨噬細(xì)胞中瞬間過量表達(dá),提高了巨噬細(xì)胞的抗菌活性[82]。

    魚皮膚本身就是魚對(duì)病原體的一個(gè)防御屏障,而魚皮膚及其粘液中存在多種類型CPIs[75,76],尤其具有保護(hù)型多糖結(jié)構(gòu)的Kininogen[83],都可能說明它們通過某種尚不明確的途徑起到防御媒介的作用,參與魚類先天免疫。

    5.3 CPIs 在抑制腫瘤中的作用

    虹鱒 魚(Rainbow trout,Oncorhynchus mykiss)Cystatin C 的mRNA 在其黃曲霉毒素誘導(dǎo)的肝腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量明顯高于與正常肝細(xì)胞,說明Cystatin C 可能與魚類的腫瘤發(fā)生之間具有某種潛在調(diào)節(jié)關(guān)系。作者所在團(tuán)隊(duì)前期從鰱魚(Silver carp,Hypophthalmichthys molitrix)卵中分離的CPIs 在體外抑制了子宮內(nèi)膜癌(Ishikawa)細(xì)胞的增殖,使其遷移及粘附能力顯著下降[84]。

    5.4 CPIs 在調(diào)節(jié)骨生長(zhǎng)方面的作用

    目前,除本實(shí)驗(yàn)室對(duì)鰱魚Cystatin 在成骨細(xì)胞增殖分化方面進(jìn)行了探索研究外,尚未見魚源CPIs的相關(guān)報(bào)道。作者所在團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),鰱魚Cystatin 能夠促進(jìn)小鼠MC3T3-E1 成骨細(xì)胞的增殖和分化,促進(jìn)骨形成[85]。

    5.5 CPIs 在抑菌方面的作用

    目前,除本實(shí)驗(yàn)室對(duì)鰱魚Cystatin 的抑菌活性進(jìn)行了相關(guān)研究外,尚未見魚源CPIs 抑菌活性的研究報(bào)道。作者所在團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),鰱魚Cystatin對(duì)銅綠假單胞菌[86]及冷藏魚肉片中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌熒光假單胞菌[87],具有顯著的抑制效果,推測(cè)其可能在水產(chǎn)原料及其冷藏制品貯藏過程中,發(fā)揮良好的防腐保鮮作用。

    6 展望

    蛋白性CPIs 在動(dòng)植物界廣泛存在,且種類較多。目前對(duì)陸生動(dòng)物研究較透徹。而魚類CPIs 研究較少,但其很可能存在某些不同與陸生動(dòng)物的特殊的活性或作用機(jī)制。然而近年來對(duì)于魚類CPIs的探索性應(yīng)用研究,僅局限于抑制魚糜凝膠或魚肉質(zhì)軟化,如大馬哈魚卵cystatin 可以有效抑制狹鱈魚糜的凝膠軟化。添加純化的鰱魚卵小分子CPIs 均可顯著的提高鰱魚魚糜的凝膠強(qiáng)度,尚未將其作為一種生物活性成分進(jìn)行系統(tǒng)的研究、開發(fā)利用。同時(shí),已知蛋白性CPIs 具有癌癥抑制、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)骨生長(zhǎng)以及刺激細(xì)胞凋亡等多種生理活性功能及顯著的抑菌活性。因此,對(duì)魚類CPIs 進(jìn)行分離純化鑒定,并進(jìn)一步探究其各種活性及功能具有重要的意義。同時(shí),利用其抑菌、抑制腫瘤等功能作用,應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域,必定具有廣闊的前景。

    1 Turk V,et al.The cystatins:protein inhibitors of cysteine proteinases.FEBS Lett,1991,285:213-219.

    2 Dubin G.Proteinaceous cysteine protease inhibitors.Cell Mol Life Sci,2005,62:653-669.

    3 Otto HH,et al.Cysteine proteases and their inhibitors.Chem Rev,1997,97:133-171.

    4 Margis R,et al.Structural and phylogenetic relationships among plant and animal cystatins.Arch Biochem Biophys,1998,359:24-30.

    5 Brown WM,et al.Friends and relations of the cystatin superfamily-new members and their evolution.Protein Sci,1997,6:5-12.

    6 Yamakawa Y,et al.Primary structure of the antihemorrhagic factor in serum of the Japanese Hahu:A snake venom metalloproteinase inhibitor with a double-headed cystatin domain.Rom J Biochem,1992,112:583-589.

    7 Leung L.Histidine-rich glycoprotein:an abundant plasma protein in search of a function.J Lab Clin Med,1993,121:630-631.

    8 Lenarcic B,et al.Thyropins-new structurally related proteinase inhibitors.Biol Chem,1998,379:105-111.

    9 Ogrinc T,et al.Purification of the complex of cathepsin L and the MHC class II-associated invariant chain fragment from human kidney.FEBS Lett,1993,336:555-559.

    10 Lenarcic B,et al.Equistatin,a new inhibitor of cysteine proteinases fromActinia equina,is structurally related to thyroglobulin type-1 domain.J Biol Chem,1997,272:13899-13903.

    11 Yamashita M,et al.A novel cysteine protease inhibitor of the egg of chum salmon,containing a cysteine-rich thyroglobulinlike motif.J Biol Chem,1996,271:1282-1284.

    12 Lenarcic B,et al.Saxiphilin,a saxitonin-binding protein with two thyroglobulin type 1 domains,is an inhibitor of papainlike cysteine proteases.J Biol Chem,2000,275:15572-15577.

    13 Ma XS(馬雪松),et al.The inhibitor of apoptosis proteins family and nerve injury.Chin J Crit Care Med(中國(guó)急救醫(yī)學(xué)),2006,26:528-530.

    14 Crook NE,et al.An apoptosis-inhibiting baculovirus gene with a zinc finger-like motif.J Virol,1993,67:2168-2174.

    15 Jin CX(金翠香),et al.The research development of relationship between anti-apoptosis protein Livin and the tumors in digestive tract.Chin J Gerontol(中國(guó)老年學(xué)雜志),2007,27:1737-1740.

    16 Salamino F,et al.Modulation of rat brain calpastatin efficiency by post-translational modifications.FEBS Lett,1997,412:433-438.

    17 Goll DE,et al.The calpain system.Physiol Rev,2003,83:731-801.

    18 Squier MK,et al.Calpain and calpastatin regulate neutrophil apoptosis.J Cell Physiol,1999,178:311-319.

    19 Monteiro AC,et al.Identification,characterization and localization of chagasin,a tight-binding cysteine protease inhibitor inTrypanosoma cruzi.J Cell Sci,2001,114:3933-3942.

    20 Rigden DJ,et al.Sequence conservation in the chagasin family suggests a common trend in cysteine proteinase binding by unrelated protein inhibitors.Protein Sci,2002,11:1971-1977.

    21 Sanderson SJ,et al.Functional conservation of a natural cysteine peptidase inhibitor in protozoan and bacterial pathogens.FEBS Lett,2003,542:12-16.

    22 Brzin J,et al.Clitocypin,a new type of cysteine proteinase inhibitor from fruit bodies of mushroomClitocybe nebularis.J Biol Chem,2000,275:20104-20109.

    23 Sabotic J,et al.Macrocypins,a family of cysteine protease inhibitors from the basidiomyceteMacrolepiota procera.FEBS J,2009,276:4334-4345.

    24 Rzychon M,et al.Staphostatins:an expanding new group of proteinase inhibitors with a unique specificity for the regulation of staphopains,Staphylococcus spp.cysteine proteinases.Mol Microbiol,2003,49:1051-1066.

    25 Bode W,et al.The 2.0 A X-ray crystal structure of chicken egg white cystatin and its possible mode of interaction with cysteine proteinases.EMBO J,1988,7:2593-2599.

    26 Stojan P,et al.Stefin A and stefin B:markers for prognosis in operable aquamous cell carcinoma of the head and neck.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2007,68:1335-1341.

    27 Jin L,et al.Differential secretome analysis reveals CST6 as a suppressor of breast cancer bone metastasis.Cell Res,2012,22:1356-1373.

    28 Colman RW.Inhibition of angiogenesis by a monoclonal antibody to kininogen as well as by kininostatin which block proangiogenic high molecular weight kininogen.Int Immunopharmacol,2002,2:1887-1894.

    29 Alvarez-Díaz S,et al.Cystatin D is a candidate tumor suppressor gene induced by vitamin D in human colon cancer cells.J Clin Invest,2009,119:2343-2358.

    30 Liang X,et al.Cystatin C induces apoptosis and tyrosine hydroxylase gene expression through JNK-dependent pathway in neuronal cells.Neurosci Lett,2011,492:100-105.

    31 Sun D,et al.Endothelial-cell apoptosis induced by cleaved high-molecular-weight kininogen (HKa)is matrix dependent and requires the generation of reactive oxygen species.Blood,2006,107:4714-4720.

    32 Nishio C,et al.Involvement of cystatin C in oxidative stressinduced apoptosis of cultured rat CNS neurons.Brain Res,2000,873:252-262.

    33 Fulda S.Inhibitor of Apoptosis (IAP)proteins as therapeutic targets for radiosensitization of human cancers.Cancer Treatment Rev,2012,38:760-766.

    34 Staun-Ram E,et al.Cathepsins (S and B)and their inhibitor cystatin C in immune cells:modulation by interferon-β and role played in cell migration.J Neuroimmunol,2011,232:200-206.

    35 Riese RJ,et al.Cathepsins and compartmentalization in antigen presentation.Curr Opinimmunol,2000,12:107-113.

    36 Verdot L,et al.Chicken cystatin stimulates nitric oxide release from interferon-activated mouse peritoneal macrophages via cytokine synthesis.FEBS J,1999,266:1111-1117.

    37 Sch?nemeyer A,et al.Modulation of human T cell responses and macrophage functions by onchocystatin,a secreted protein of the filarial nematodeOnchocerca volvulus.J Immunol,2001,167:3207-3215.

    38 Kato T,et al.Cystatin SA,a cysteine proteinase inhibitor,induces interferon-γ expression in CD4-positive T cells.Biol Chem,2004,385:419-422.

    39 Hartmann S,et al.Modulation of host immune responses by nematode cystatins.Int J Parasitol,2003,33:1291-1302.

    40 Brage M,et al.Different cysteine proteinases involved in bone resorption and osteoclast formation.Calcif TissueInt,2005,76:439-447.

    41 Yamaza T,et al.Comparison in localization between cystatin C and cathepsin K in osteoclasts and other cells in mouse tibia epiphysis by immunolight and immunoelectronmicroscopy.Bone,2001,29:42-53.

    42 Laitala-Leinonen T,et al.Cystatin B as an intracellular modulator of bone resorption.Matrix Biology,2006,25:149-157.

    43 Brand HS,et al.Family 2 cystatins inhibit osteoclast-mediated bone resorption in calvarial bone explants.Bone,2004,35:689-696.

    44 Yamamura J,et al.Bovine milk kininogen fragment 1.2 promotes the proliferation of osteoblastic MC3T3-E1 cells.Biochem Biophys Res Commun,2000,269:628-632.

    45 Yamamura J,et al.The fragments of bovine high molecular weight kininogen promote osteoblast proliferationin vitro.J Biochem,2006,140:825-830.

    46 Danjo A,et al.Cystatin C stimulates the differentiation of mouse osteoblastic cells and bone formation.Biochem Biophys Res Commun,2007,360:199-204.

    47 Bj?rck L.Proteinase inhibition,immunoglobulin-binding proteins and a novel antimicrobial principle.Mol Microbiol,1990,4:1439-1442.

    48 Blankenvoorde MF,et al.Inhibition of the growth and cysteine proteinase activity ofPorphyromonas gingivalisby human salivary cystatin S and chicken cystatin.Biol Chem,1996,377:847-850.

    49 Naito Y,et al.Bactericidal effect of rat cystatin S on an oral bacteriumPorphyromonas gingivalis.Comp Biochemphysiol Pt C,1995,110:71-75.

    50 Wesierska E,et al.Antimicrobial activity of chicken egg white cystatin.J Microbiol Biotechnol,2005,21:59-64.

    51 Sharma G,et al.Studies on antibacterial activity and biochemical/biophysical properties of phytocystatin purified from catharanthus roseus (Madagascar Periwinkle):an evergreen subshrub commonly found in district Bijnor (U.P.).Adv Biosc Biote,2011,2:391-396.

    52 Nordahl EA,et al.Domain 5 of high molecular weight kininogen is antibacterial.J Biol Chem,2005,280:34832-34839.

    53 Sonesson A,et al.Antifungal activities of peptides derived from domain 5 of high-molecular-weight kininogen.Int J Pept,2011,2011:761037.

    54 Bjork I,et al.Differential changes in the association and dissociation rate constants for binding of cystatins to target proteinases occurring on N-terminal truncation of the inhibitor indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes.Biochem J,1994,299:219-225.

    55 Wang L,et al.Antimicrobial activity and molecular mechanism of the CRES Protein.PLoS One,2012,7:e48368.

    56 Ustadi U,et al.Purification and identification of a protease inhibitor from Glassfish (Liparis tanakai)Eggs.J Agric Food Chem,2005,53:7667-7672.

    57 Yamashita M,et al.A comparison of cystatin activity in the various tissues of chum salmonOncorhynchus ketabetween feeding and spawning migrations.Comp Biochem Physiol,1991,100:749-751.

    58 Koide Y,et al.The complete amino acid sequence of pituitary cystatin from chum salmon.Biosci Biotechnol Biochem,1994,58:164-169.

    59 Tzeng SS,et al.Purification and characterization of cysteine proteinase inhibitors from crucian carpCarassius auratuseggs.Fishers Sci,2009,75:1453-1460.

    60 Su YC,et al.Homology model and molecular dynamics simulation of carp ovum cystatin.Biotechnol Progr,2005,21:1315-1320.

    61 Bai JJ (白俊杰),et al.Molecular cloning and sequence analysis of cystatin mature peptiede cDNAs from two species of sturgeons.Current Zool(動(dòng)物學(xué)報(bào)),2002,48:570-573.

    62 Tsai YJ,et al.Purification and molecular cloning of carp ovarian cystatin.Comp Biochem Physiol,1996,l13:573-580.

    63 Song C (宋川).Purification and characterization of cpis from silver carp egg and their application to prevent gel weakening.Yaan:Sichuan Agricultural University (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)),MSc.2011.

    64 Liu L (劉玲),et al.Purification and characterization of lowmolecular-weight cysteine proteinase inhibitors (CPIs)from silver carp eggs and their effects on improving gel strength of surimi.Food Sci(食品科學(xué)),2014,35(13):37-42.

    65 Kim Y,et al.Characteristics of the protease inhibitor purified from chum salmon (Oncorhynchus keta)eggs.Food Sci Biotechnol,2006,15:28-32.

    66 Li DK,et al.Purification and characterization of a cysteine protease inhibitor from chum salmon (Oncorhynchus keta)plasma.J Agric Food Chem,2008,56:106-111.

    67 Yl?nen A,et al.Atlantic salmon (Salmo salarL)skin contains a novel kininogen and another cysteine proteinase inhibitor.Eur J Biochem,1999,266:1066-1072.

    68 Yl?nen A,et al.Purification and characterization of novel kininogens from spotted wolffish and Atlantic cod.Eur J Biochem,2002,269:2639-2646.

    69 Song C (宋川),et al.Purification and characterization of high molecular weight caspase inhibitor cpi-i from silver carp eggs.Food Sci(食品科學(xué)),2012,33:100-103.

    70 Yamashita M,et al.A novel cysteine protease inhibitor of the egg of chum salmon,containing a cysteine-rich thyroglobulinlike motif.J Biol Chem,1996,271:1282-1284.

    71 Olonen A,et al.A new type of cysteine proteinase inhibitorthe salarin gene from Atlantic salmon (Salmo salarL)and Arctic charr (Salvelinus alpinus).Biochimie,2003,85:677-681.

    72 Salem M,et al.Characterization of calpastatin gene in fish:Its potential role in muscle growth and fillet quality.Comp Biochem Physiol,2005,141:488-497.

    73 Gaarder M,et al.Identification of calpastatin,μ-calpain and m-calpain in Atlantic salmon (Salmo salarL.)muscle.Food Chem,2011,125:1091-1096.

    74 Gaarder MO,et al.Relevance of calpain and calpastatin activity for texture in super-chilled and ice-stored Atlantic salmon (Salmo salarL.)fillets.Food Chem,2012,132:9-17.

    75 Saitoh E,et al.A novel cysteine protease inhibitor with lectin activity from the epidermis of the Japanese eelAnguilla japonica.Comp Biochem Physiol,2005,141:103-109.

    76 Okamoto E,et al.Purification and characterization of two novel cysteine protease inhibitors,Eel-CPI-2 and Eel-CPI-3,in the skin mucus of the Japanese eelAnguilla japonica.Fisheries Sci,2009,75:463-471.

    77 Kestmont P,et al.Cathepsin L in eggs and larvae of perchPerca fluviatilis:variations with developmental stage and spawning period.Fish Physiol Biochem,1999,21:59-64.

    78 Li F,et al.Molecular cloning,sequence analysis and expression distribution of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)cystatin C.Comp Biochem Physiol Pt B,1998,121:135-143.

    79 Wang SC,et al.Carp ovarian cystatin binds and agglutinates spermatozoa via electrostatic interaction.Biol Reprod,2002,66:1318-1327.

    80 Li S,et al.Molecular and functional characterization of a cystatin analogue in large yellow croaker (Pseudosciaena crocea).Mol Immunology,2009,46:1638-1646.

    81 Li SY (李淑英).Research of functions and molecular characters of two kind of cysteine proteiinases inhibitors in large yellow croaker (Pseudosciaena crocea).Xiamen:Xiamen University (廈門大學(xué)),MSc.2008.

    82 Xiao PP,et al.Scophthalmus maximuscystatin B enhances head kidney macrophage-mediated bacterial killing.Dev Comp Immunol,2010,34:1237-1241.

    83 Olonen A.High molecular weight cysteine proteinase inhibitors in Atlantic salmon and other fish species.Helsinki:University of Helsinki,PhD.2004.

    84 Liu L (劉玲).Purification and characterization of high molecular weight cpis from silver carp egg and its preliminary effect on Ishikawa cell.Ya’an:Sichuan Agricultural University (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)),MSc.2014.

    85 Li S (李松).Detecting of Cystatin in the offcuts of silver carp after processing and its effects on bone formationin vitro.Ya’an:Sichuan Agricultural University (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)),MSc.2014.

    86 Chen H (陳海),et al.Prokaryotic expression and identification of recombinant cystatin ofHypophthalmichthys molitrixand the antibacterial activity onPseudomonas aeruginosa.Food Sci(食品科學(xué)),2014,35:133-137.

    87 Ren YY(任陽陽).Characterization of like-cystatin from silver carp egg and its bactericidal action topseudomnasJ-4 from refrigeration silver carp sliced meat.Ya’an:Sichuan Agricultural University (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)),MSc.2013.

    猜你喜歡
    半胱氨酸蛋白酶抑制劑
    思鄉(xiāng)與蛋白酶
    文苑(2018年22期)2018-11-19 02:54:30
    凋亡抑制劑Z-VAD-FMK在豬卵母細(xì)胞冷凍保存中的應(yīng)用
    西安地區(qū)同型半胱氨酸參考區(qū)間的初步建立
    多胚蛋白酶 高效養(yǎng)畜禽
    IgA蛋白酶在IgA腎病治療中的潛在價(jià)值
    同型半胱氨酸與慢性心力衰竭合并腎功能不全的相關(guān)性分析
    組蛋白去乙?;敢种苿┑难芯窟M(jìn)展
    磷酸二酯酶及其抑制劑的研究進(jìn)展
    86例同型半胱氨酸與腦梗死相關(guān)性分析
    冷卻豬肉中產(chǎn)蛋白酶腐敗菌的分離鑒定
    亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美中文综合在线视频| 在线看三级毛片| 国产视频内射| 婷婷丁香在线五月| 99久久成人亚洲精品观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| e午夜精品久久久久久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| www国产在线视频色| www国产在线视频色| 国产在视频线在精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产色婷婷99| 麻豆国产av国片精品| 一a级毛片在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 无人区码免费观看不卡| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 久久午夜亚洲精品久久| 搡老妇女老女人老熟妇| 精品乱码久久久久久99久播| 成人av一区二区三区在线看| 精品久久久久久久久久免费视频| 两人在一起打扑克的视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲片人在线观看| 小说图片视频综合网站| 两个人看的免费小视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久亚洲真实| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美色视频一区免费| 51国产日韩欧美| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产精品永久免费网站| 国产成人a区在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| 在线观看66精品国产| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产av在哪里看| 精品国产三级普通话版| 国产av不卡久久| 制服丝袜大香蕉在线| 夜夜爽天天搞| 欧美色视频一区免费| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲人成网站在线播| 国产精品一区二区免费欧美| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲国产色片| 最近最新免费中文字幕在线| 色吧在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 淫妇啪啪啪对白视频| 国内精品久久久久久久电影| 丝袜美腿在线中文| 国产成人福利小说| 久久99热这里只有精品18| 无遮挡黄片免费观看| 国产午夜福利久久久久久| 国产视频一区二区在线看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产亚洲精品av在线| 最新美女视频免费是黄的| aaaaa片日本免费| 成人午夜高清在线视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 美女免费视频网站| 999久久久精品免费观看国产| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲真实伦在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 一进一出抽搐动态| 午夜日韩欧美国产| 小说图片视频综合网站| 成年女人看的毛片在线观看| 嫩草影视91久久| 成人国产一区最新在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产精品久久视频播放| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 少妇的逼水好多| 欧美国产日韩亚洲一区| 禁无遮挡网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| eeuss影院久久| 久久国产精品影院| 亚洲欧美日韩无卡精品| 老汉色av国产亚洲站长工具| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产精品久久电影中文字幕| 在线看三级毛片| 有码 亚洲区| 亚洲,欧美精品.| 日本 av在线| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 深爱激情五月婷婷| 久久香蕉国产精品| 国产精品一及| 日本黄大片高清| 亚洲美女黄片视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久久九九精品影院| 婷婷丁香在线五月| 午夜日韩欧美国产| 在线天堂最新版资源| 在线视频色国产色| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 免费在线观看亚洲国产| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产探花极品一区二区| 久久精品人妻少妇| 亚洲精品一区av在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 丝袜美腿在线中文| 女人被狂操c到高潮| 精品久久久久久久久久免费视频| 一个人看视频在线观看www免费 | 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产成人福利小说| 高清毛片免费观看视频网站| 2021天堂中文幕一二区在线观| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 亚洲无线在线观看| 毛片女人毛片| 91麻豆av在线| 国产伦一二天堂av在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 日本与韩国留学比较| 男女床上黄色一级片免费看| 俺也久久电影网| 国产成人av教育| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 欧美日韩精品网址| 国产真实伦视频高清在线观看 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 91九色精品人成在线观看| av在线蜜桃| 久久精品国产自在天天线| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产亚洲精品av在线| 999久久久精品免费观看国产| eeuss影院久久| 丰满乱子伦码专区| 日韩高清综合在线| 精品日产1卡2卡| 国产激情欧美一区二区| 免费无遮挡裸体视频| 久久久久久九九精品二区国产| 一a级毛片在线观看| 国产三级黄色录像| 久久香蕉国产精品| 老汉色av国产亚洲站长工具| 99久久精品热视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 岛国在线免费视频观看| 69人妻影院| 丰满乱子伦码专区| 亚洲,欧美精品.| 欧美黄色片欧美黄色片| 2021天堂中文幕一二区在线观| 日本黄大片高清| av福利片在线观看| 亚洲精品在线美女| 精品国产美女av久久久久小说| 制服丝袜大香蕉在线| 露出奶头的视频| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲片人在线观看| 欧美午夜高清在线| 久久亚洲精品不卡| av福利片在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲av成人av| 麻豆国产av国片精品| 国产精品久久久久久久久免 | 国产高潮美女av| 岛国视频午夜一区免费看| 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲第一电影网av| 女同久久另类99精品国产91| 精品乱码久久久久久99久播| 18禁美女被吸乳视频| 免费看日本二区| 免费观看精品视频网站| 国产极品精品免费视频能看的| 日韩欧美三级三区| 午夜老司机福利剧场| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产精品免费一区二区三区在线| 成人性生交大片免费视频hd| 看免费av毛片| 悠悠久久av| 亚洲av美国av| 亚洲黑人精品在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 黄色成人免费大全| 黄片小视频在线播放| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 午夜精品一区二区三区免费看| 网址你懂的国产日韩在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 中出人妻视频一区二区| 国内精品一区二区在线观看| eeuss影院久久| 99久久无色码亚洲精品果冻| 99riav亚洲国产免费| 成人性生交大片免费视频hd| 一级作爱视频免费观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 日韩欧美国产在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 午夜福利在线在线| 狂野欧美激情性xxxx| 狠狠狠狠99中文字幕| 看免费av毛片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲最大成人手机在线| www日本在线高清视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| www国产在线视频色| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产 一区 欧美 日韩| 色老头精品视频在线观看| 免费高清视频大片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 精品一区二区三区人妻视频| 久久久久久国产a免费观看| 成人亚洲精品av一区二区| ponron亚洲| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 校园春色视频在线观看| 好男人电影高清在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 精品熟女少妇八av免费久了| 国产亚洲精品一区二区www| 宅男免费午夜| 首页视频小说图片口味搜索| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲最大成人手机在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日本a在线网址| 啦啦啦韩国在线观看视频| 在线观看一区二区三区| 性欧美人与动物交配| 12—13女人毛片做爰片一| 母亲3免费完整高清在线观看| 18+在线观看网站| 免费电影在线观看免费观看| 99热这里只有精品一区| 亚洲国产精品999在线| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 久久伊人香网站| 午夜影院日韩av| 亚洲国产色片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲av熟女| a级一级毛片免费在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 亚洲一区二区三区色噜噜| 91在线精品国自产拍蜜月 | 91在线精品国自产拍蜜月 | 色播亚洲综合网| 中文字幕高清在线视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| 在线观看午夜福利视频| 国产精品国产高清国产av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久国产精品人妻蜜桃| 丰满的人妻完整版| 日本三级黄在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 久久久久九九精品影院| h日本视频在线播放| 超碰av人人做人人爽久久 | 97超视频在线观看视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 天天躁日日操中文字幕| 欧美不卡视频在线免费观看| 两个人视频免费观看高清| 18+在线观看网站| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲第一电影网av| 婷婷六月久久综合丁香| av片东京热男人的天堂| 亚洲真实伦在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 12—13女人毛片做爰片一| a在线观看视频网站| www日本在线高清视频| 极品教师在线免费播放| 欧美日本视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲激情在线av| 亚洲人成网站在线播| 精品久久久久久,| bbb黄色大片| 亚洲电影在线观看av| 亚洲成人久久爱视频| 九九在线视频观看精品| 色播亚洲综合网| 搞女人的毛片| 我要搜黄色片| 日韩国内少妇激情av| 99国产综合亚洲精品| av专区在线播放| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲人成网站在线播| 搡老岳熟女国产| 国产69精品久久久久777片| 国产高清视频在线播放一区| tocl精华| 日本黄大片高清| 亚洲五月婷婷丁香| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 757午夜福利合集在线观看| 综合色av麻豆| 午夜日韩欧美国产| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 少妇的逼水好多| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 观看免费一级毛片| 宅男免费午夜| 久久久精品大字幕| 男女床上黄色一级片免费看| 99热这里只有是精品50| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 性欧美人与动物交配| 日本五十路高清| 一级作爱视频免费观看| 国产乱人视频| 国产真实乱freesex| 小说图片视频综合网站| 久久久久国内视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 日韩高清综合在线| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日本 欧美在线| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲av熟女| 亚洲国产精品合色在线| 欧美黑人巨大hd| 内射极品少妇av片p| 我要搜黄色片| 岛国在线观看网站| 嫩草影院入口| 又紧又爽又黄一区二区| 最后的刺客免费高清国语| 国产黄片美女视频| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲中文字幕日韩| 1024手机看黄色片| 大型黄色视频在线免费观看| 国产成人av教育| 国产三级中文精品| 国产日本99.免费观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产麻豆成人av免费视频| 国产高潮美女av| 18禁美女被吸乳视频| 国产av麻豆久久久久久久| 黄片小视频在线播放| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美色视频一区免费| 少妇高潮的动态图| 波多野结衣高清作品| 欧美大码av| 丰满人妻一区二区三区视频av | 午夜影院日韩av| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲国产精品999在线| 婷婷丁香在线五月| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲av美国av| 村上凉子中文字幕在线| 校园春色视频在线观看| 亚洲激情在线av| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲av免费在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 好男人在线观看高清免费视频| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲人成电影免费在线| 日韩精品青青久久久久久| 99久久精品国产亚洲精品| 男女午夜视频在线观看| 99久国产av精品| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 久久伊人香网站| 91麻豆精品激情在线观看国产| xxx96com| 床上黄色一级片| 看黄色毛片网站| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 夜夜爽天天搞| 全区人妻精品视频| 操出白浆在线播放| 无遮挡黄片免费观看| 午夜福利成人在线免费观看| www.色视频.com| 国产综合懂色| 天堂√8在线中文| 99久久精品一区二区三区| 成人特级av手机在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| av福利片在线观看| 1024手机看黄色片| 国产男靠女视频免费网站| 久久草成人影院| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 黄色丝袜av网址大全| 丰满人妻一区二区三区视频av | 18禁国产床啪视频网站| 国内精品久久久久精免费| 有码 亚洲区| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品国产高清国产av| 久久久久国内视频| 91久久精品电影网| 女人被狂操c到高潮| 国产主播在线观看一区二区| 高潮久久久久久久久久久不卡| www.999成人在线观看| 丁香六月欧美| 日本a在线网址| 一级黄色大片毛片| 日韩亚洲欧美综合| 国产三级在线视频| 精品久久久久久成人av| 天堂动漫精品| 18+在线观看网站| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品99久久99久久久不卡| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日日夜夜操网爽| 欧美黄色片欧美黄色片| xxx96com| 国产私拍福利视频在线观看| 成人18禁在线播放| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲第一电影网av| 美女黄网站色视频| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品一及| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 黄色女人牲交| 久久伊人香网站| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲在线自拍视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲在线自拍视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产精品野战在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 天堂网av新在线| 国产黄a三级三级三级人| 免费人成在线观看视频色| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 看黄色毛片网站| 综合色av麻豆| 午夜视频国产福利| 国产精品三级大全| 国产成人av激情在线播放| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 午夜福利在线观看吧| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美+日韩+精品| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 脱女人内裤的视频| 亚洲av美国av| 亚洲人成网站高清观看| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲人成网站高清观看| 久久久久久久久大av| 国产久久久一区二区三区| 国产真人三级小视频在线观看| 性欧美人与动物交配| 日韩免费av在线播放| 亚洲国产色片| 国产爱豆传媒在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产成人aa在线观看| 两个人的视频大全免费| tocl精华| 搡老岳熟女国产| 欧美一级a爱片免费观看看| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲av五月六月丁香网| 国产成人aa在线观看| 午夜a级毛片| 国产av麻豆久久久久久久| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲av不卡在线观看| 国产成年人精品一区二区| 特级一级黄色大片| 日本一二三区视频观看| 最好的美女福利视频网| 天堂影院成人在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 黄色日韩在线| 无人区码免费观看不卡| 国产精品久久久久久精品电影| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久亚洲真实| 久久精品人妻少妇| 国产精品永久免费网站| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产视频一区二区在线看| 亚洲成人久久爱视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产日本99.免费观看| 精品国产美女av久久久久小说| a级一级毛片免费在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 日韩精品青青久久久久久| 在线播放国产精品三级| 成年女人永久免费观看视频| 中文资源天堂在线| 久久6这里有精品| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久久久性生活片| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 18禁国产床啪视频网站| 欧美乱色亚洲激情| 欧美色视频一区免费| 少妇丰满av| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久亚洲真实| 国产av在哪里看| 亚洲人成网站高清观看| av视频在线观看入口| 精品电影一区二区在线| av黄色大香蕉| 观看美女的网站| 免费在线观看影片大全网站| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 90打野战视频偷拍视频| 日本成人三级电影网站| 女人被狂操c到高潮| 天堂√8在线中文| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲人与动物交配视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 91在线观看av| 男人和女人高潮做爰伦理| 五月伊人婷婷丁香| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩欧美精品免费久久 | 国产91精品成人一区二区三区| 欧美乱色亚洲激情| 麻豆成人午夜福利视频| 黄色女人牲交| 成人永久免费在线观看视频| 国产淫片久久久久久久久 | 麻豆国产97在线/欧美| 黄色日韩在线| 国产97色在线日韩免费| 深夜精品福利| 天天添夜夜摸| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 成熟少妇高潮喷水视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 99视频精品全部免费 在线| www国产在线视频色| 国产一区二区激情短视频| 亚洲专区国产一区二区| 久久久国产成人精品二区| 有码 亚洲区| 精品不卡国产一区二区三区| 最新在线观看一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 又黄又爽又免费观看的视频| 免费在线观看亚洲国产| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲一区二区三区不卡视频| 在线观看日韩欧美| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲国产精品合色在线| 国产日本99.免费观看|