酶解-超聲法對豬苓多糖正交優(yōu)選提取及抗氧化活性的初步實(shí)驗(yàn)研究

張 元，馮 瓊，楊曉方，谷春秀，劉紅梅

北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023

自由基是生物體中生化反應(yīng)的普遍中間介質(zhì)，它們是正常的細(xì)胞新陳代謝過程中氧化磷酸化作用產(chǎn)生的副產(chǎn)物［1］。大量研究表明，一方面自由基參與了許多重要的生命過程，諸如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤的誘發(fā)與抑制、肌肉收縮、神經(jīng)傳導(dǎo)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)等調(diào)節(jié);另一方面，自由基產(chǎn)生過多或清除過慢又會(huì)影響各種細(xì)胞或器官，使自然抗氧化和促氧化之間產(chǎn)生不平衡，誘導(dǎo)產(chǎn)生各種有害影響，使得細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生［2-4］。因此自由基在有機(jī)體中扮演著重要的角色，研究表明眾多從天然產(chǎn)物中提取的多糖如:綠茶、海藻、香菇、云芝等多糖均被證明是有效地天然抗氧化劑和機(jī)體免疫劑［5］，且多糖沒有細(xì)胞毒性，作用于生物體副作用小，因此其在食品工業(yè)、制藥工業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但多糖因其種類多樣，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量大，且多數(shù)含量低，極性大，加之其常與蛋白質(zhì)、脂類等形成復(fù)雜的多糖復(fù)合物，這些給多糖的提取分離、構(gòu)效關(guān)系、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制等的研究應(yīng)用帶來了諸多的困難。

豬苓為多孔菌科真菌豬苓Polyporus umbellatus(Pers.)Fries 的菌核，屬藥食兩用真菌，在我國已有2 000 多年的食用和藥用歷史。豬苓性平味甘，歸腎、膀胱經(jīng)，具有利水滲濕、泄熱止瀉的功效;用于治小便不利，水腫、泄瀉，淋濁，帶下等［6］。豬苓多糖為豬苓的主要活性成分，其化學(xué)組成主要為主鏈由β-(1-3)葡萄糖苷鍵縮合而成的葡聚糖，在主鏈上每3～4 個(gè)殘基間出現(xiàn)一個(gè)與β-D-吡喃葡糖糖基團(tuán)作為側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)［7］，研究表明豬苓多糖具有抑制腫瘤生長、增強(qiáng)免疫力、抗誘變、抗炎、抗病毒、抗化療毒性、抗放射、抗衰老等的活性作用，在臨床上主要用于原發(fā)性肺癌、肝癌、食道癌、子宮頸癌、淋巴瘤、白血病等放化療的輔助治療，以提高了患者的抗病能力［8］。

近年來豬苓多糖的研究在結(jié)構(gòu)鑒定和活性上取得了諸多進(jìn)展，但還有許多問題尚待深入研究解決，如其在天然產(chǎn)物中的含量低，提取效率低，分離困難等問題制約了豬苓多糖的進(jìn)一步開發(fā)和利用。因此綜合考慮提取效率、成本等因素，選擇一種合適的提取分離方法對豬苓多糖的研究開發(fā)具有重要的意義。當(dāng)前，多糖的提取已逐漸由傳統(tǒng)的溶劑提取法向運(yùn)用酶法、超聲波等輔助強(qiáng)化提取技術(shù)轉(zhuǎn)變。酶法、微波提取法、半仿生法、動(dòng)態(tài)逆流等技術(shù)已經(jīng)逐漸由基礎(chǔ)研究加速向應(yīng)用生產(chǎn)環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)化和發(fā)展。因此本文酶法-超聲優(yōu)化提取豬苓多糖展開研究，并對提取的多糖進(jìn)行體外抗氧化活性的初步評價(jià)。擬為應(yīng)用酶解-微波法輔助技術(shù)生產(chǎn)提取豬苓多糖提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

豬苓，購于河北安國長安中藥材公司;果膠酶，纖維素酶(活力單位10000 u/g)，天津市利華酶制劑技術(shù)有限公司;D-無水葡萄糖，批號(hào):110833-200503，中國藥品生物制品檢定所;維生素C 注射劑，山東新華制藥股份有限公司。苯酚(分析純)，濃硫酸(分析純)等，北京化工廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

Mini 島津紫外分光光度計(jì)。THZ-82 恒溫水浴振蕩器，常州國華電器有限公司。KQ-250 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司等。電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取方法與優(yōu)選

將豬苓進(jìn)行60 ℃恒溫干燥，粉碎后過100 目篩，稱取一定量的豬苓，進(jìn)行提取工藝的研究。首先對酶法提取與傳統(tǒng)水提醇沉法和單獨(dú)超聲提取實(shí)驗(yàn)做對比，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比對，擬采用復(fù)合酶法進(jìn)行提取，并對影響提取的單因素進(jìn)行優(yōu)選，影響條件主要有:酶用量、反應(yīng)時(shí)間、pH 值、溫度，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行酶法提取的正交試驗(yàn)，在最佳提取的工藝條件的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行超聲波的提取。

1.2.1.1 水提醇沉法:稱取干燥過篩的豬苓5 g，向其中加入100 mL 水，在40 ℃水浴中浸提1 h，收集上清液，殘?jiān)俅斡猛N方法提取30 min，合并兩次濾液，用95%的乙醇沉淀，靜置24 h，抽濾，得到提取的多糖。提取的多糖采用無水乙醇、丙酮洗滌各2 次的方式進(jìn)行除雜后，60 ℃低溫干燥，備用。按1.2.5 所述檢測多糖含量。

1.2.1.2 酶法提取:酶種類的篩選:豬苓粉碎后稱取5 g 三份，加200 mL 蒸餾水;1%纖維素酶;1%果膠酶;1%纖維素酶:果膠酶(1∶1)(質(zhì)量為豬苓粉末質(zhì)量的1%，下同)，于50 ℃，自然pH(6.36)條件下浸提1h 后減壓抽濾，多糖處理方法同上。

1.2.1.3 豬苓超聲提取試驗(yàn):稱取5 g 豬苓粉末，加入200 mL 水，在50 ℃下，超聲提取20、40、60、80、100 min，抽濾，方法同上。

計(jì)算公式:豬苓多糖收率=豬苓多糖質(zhì)量/豬苓質(zhì)量×100%。

1.2.2 酶法提取豬苓多糖

1.2.2.1 加酶比例對豬苓多糖提取率的影響

稱取5 份豬苓粉末各5 g，分別至于5 個(gè)錐形瓶中，標(biāo)號(hào)，加入纖維素酶與果膠酶(1%)比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1，各加入200 mL 蒸餾水，于室溫下攪拌浸泡30 min，使其充分接觸溶解。

然后至于水溫為50 ℃的恒溫水浴振蕩器中中速震蕩1 h，再將其置于90 ℃的水浴鍋中5 min 使酶失活，趁熱過濾，提取得到的多糖采用無水乙醇、丙酮洗滌各2 次的方式進(jìn)行除雜后，60 ℃低溫干燥，稱量，備用。按1.2.5 所述檢測多糖含量。

1.2.2.2 反應(yīng)溫度的影響

同上，在5 個(gè)瓶中分別加入纖維素酶與果膠酶比例為1∶1(質(zhì)量為1%)。各加入200 mL 蒸餾水，于室溫下攪拌浸泡30 min，使其充分接觸溶解。然后于水溫分別為35、40、45、50、55 ℃的恒溫水浴振蕩器中中速震蕩1 h。處理方法同1.2.2.1。

1.2.2.3 pH 的影響

同上，5 個(gè)瓶加酶加水后，于室溫下攪拌浸泡30 min，使其充分接觸溶解。并調(diào)節(jié)pH 值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。方法同上。

1.2.2.4 反應(yīng)時(shí)間的影響

同上，5 個(gè)瓶加酶加水后，于室溫下攪拌浸泡30 min，使其充分接觸溶解。然后至于水溫為50 ℃的恒溫水浴振蕩器中分別中速震蕩20、40、60、80、100 min。方法同上。

1.2.3 酶法提取的正交實(shí)驗(yàn)

由以上單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定以溫度(A)、pH 值(B)、加酶比例(C)、反應(yīng)時(shí)間(D)為考察因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4 酶-超聲提取

豬苓以最佳酶解條件反應(yīng)結(jié)束后，再進(jìn)行超聲輔助浸提，然后繪制提取率與超聲時(shí)間的變化曲線。多糖處理方法同1.2.2.1。

1.2.5 測定方法

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備根據(jù)文獻(xiàn)《酶法提取山藥多糖的工藝研究》［9］，即標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液于490 nm 處測定吸光度，以吸光度A 對質(zhì)量濃度C(mg/mL)進(jìn)行回歸，得方程:

1.2.5.2 樣品含量測定

精密吸取樣品儲(chǔ)備液1.0 mL 于10 mL 的容量瓶中，定容到刻度，搖勻，在490 nm 下測得吸光度值為0.64，代入回歸方程。并計(jì)算豬苓多糖百分含量，計(jì)算公式如下:a%=10/1.0 × (A-0.1165)/1.2152 ×100%。

1.2.6 羥基自由基(·OH)清除能力的測定

釆用Fenton 法進(jìn)行測定［10］，以羥自由基清除率作指標(biāo)。所用多糖為1.2.4 制備的多糖(下同)。具體方法為在比色管中依次加入7.5 mmol/L FeSO43 mL，然后再加入1% H2O23 mL，搖勻后加入6 mmol/L 水楊酸3 mL，搖勻后于37 ℃水浴加熱15 min 后取出，在510 nm 測定其吸光度為A0;然后分別加入不同質(zhì)量濃度的豬苓多糖溶液(1、2、3、4、5 mg/mL)3 mL，搖勻后繼續(xù)水浴加熱15 min，取出測其吸光度為AX。以相同質(zhì)量濃度的VC溶液為陽性對照。則待測液對輕自由基(·OH)的清除率為:

1.2.7 超氧陰離子自由基清除率測定

釆用鄰苯三酚自氧化法［11］，以超氧陰離子自由基清除率作指標(biāo)。鄰苯三酚在堿性條件下能迅速氧化，釋放出O-·2，此自由基能促進(jìn)鄰苯三酚的自氧化，形成有色中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物在320 nm 處有最大吸收，當(dāng)有抑制劑存在時(shí)，可以消除O-·2，從而降低中間產(chǎn)物的積累，使吸光度值降低，根據(jù)吸光度的變化評價(jià)抗氧化劑的清除能力［10］。以樣品相同質(zhì)量濃度的VC為陽性對照。具體方法為取不同質(zhì)量濃度的豬苓多糖溶液(1、2、3、4、5 mg/mL)的水解樣品溶液0.2 mL，加入Tris-HCl 緩沖液2.8 mL，蒸餾水0.4 mL，混勻，置于25 ℃保溫20 min，作為試劑A;取0.2 mL 3 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，置于25 ℃下保溫10 min，作為試劑B;以試劑A 與0.3 mL 10 mmol/L HCl 溶液的混合液作為空白調(diào)零后，將試劑A 與試劑B 迅速混合，在320 nm 處測定3 min 內(nèi)吸光度的變化，回歸求出吸光度變化斜率K1。

以蒸餾水代替水解樣品溶液作為對照樣品重復(fù)上述過程，得出吸光度變化的斜率為K0;

計(jì)算清除超氧陰離子的能力:

式中:K0為空白對照液的吸光度變化斜率;K1為加入水解液后的吸光度變化斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬苓多糖收率

從表5 的結(jié)果可以看出，單獨(dú)的纖維素酶和果膠酶均較傳統(tǒng)的水提溶劑法的收率有所提高，而復(fù)合酶法又較單獨(dú)的酶法的提取收率為高，因此實(shí)驗(yàn)采用復(fù)合酶法提取作為酶法提取的工藝首選。

豬苓超聲提取試驗(yàn)主要是想驗(yàn)證在單獨(dú)超聲條件下，不同提取時(shí)間對豬苓多糖提取的影響，結(jié)果表明，收率隨提取隨時(shí)間的增加而增加，但當(dāng)時(shí)間大于60 min 后增幅不明顯，當(dāng)大于80 min 時(shí)反而出現(xiàn)下降，下降原因有待進(jìn)一步分析。因此實(shí)驗(yàn)選擇超聲時(shí)間不超過60 min。

表2 豬苓多糖收率Table 2 Productivity of PUPS under different methods

2.2 纖維素酶果膠酶酶解條件的優(yōu)化

2.2.1 酶用量比的選擇

實(shí)驗(yàn)對復(fù)合酶的配比用量進(jìn)行優(yōu)選，擬選出最佳加酶用量比。從圖1 可以看出，不同酶的配比對結(jié)果的影響，當(dāng)纖維素酶不變，單獨(dú)增加果膠酶的用量，收率并沒有明顯提高。相反，保持果膠酶用量不變，增加纖維素酶的用量反而使多糖的收率下降，因此選擇復(fù)合酶最佳酶用量比為1∶1，添加量為1%。

圖1 酶配比用量對豬苓多糖收率的影響Fig.1 Effects of ratio of enzyme on the yield of PUPS

2.2.2 反應(yīng)溫度的選擇

反應(yīng)溫度對多糖的收率是一個(gè)重要的因素，多糖的收率隨溫度升高，也呈現(xiàn)出升高的趨勢，一方面是因?yàn)闇囟壬?，反?yīng)速度加快會(huì)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部的多糖物質(zhì)向外擴(kuò)散。另一方面隨溫度的升高酶的活力不斷增強(qiáng)，在接近其最佳酶活力溫度50 ℃時(shí)，反應(yīng)效率最高。溫度對酶的影響是雙向的，在45～50℃區(qū)間酶活力最好，偏離越遠(yuǎn)酶活力則越小，因此當(dāng)溫度上升到55 ℃時(shí)，收率反而出現(xiàn)了下降。圖2 實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果最佳的酶解溫度為50 ℃。結(jié)果見圖2。

圖2 反應(yīng)溫度對豬苓多糖收率的影響Fig.2 Effects of reaction temperature on the yield of PUPS

2.2.3 pH 的選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨酶解pH 值的升高，豬苓多糖的收率呈現(xiàn)先升高而后下降的趨勢，最佳的pH 6.0～6.5 區(qū)間多糖收率最好，以pH 6.5 最佳。因此pH 對酶解效率有一定的影響，可能與酶在酸性環(huán)境中活性基團(tuán)解離使基團(tuán)的活性得到加強(qiáng)有關(guān)。結(jié)果見圖3。

圖3 酶解pH 值對豬苓多糖收率的影響ig.3 Effects of enzyme solution pH value on the yield of PUPS

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間的選擇

在60 min 內(nèi)，酶解時(shí)間與多糖提取率的關(guān)系隨時(shí)間的延長而增加，最佳提取時(shí)間為60 min。隨后隨反應(yīng)時(shí)間的延長，多糖已基本溶出，呈現(xiàn)平衡態(tài)，因此提取效率呈現(xiàn)平穩(wěn)和緩慢下降的趨勢。結(jié)果見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對豬苓多糖收率的影響Fig.4 Effects of enzymolysis time on the yield of PUPS

2.3 酶法提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)對正交試驗(yàn)結(jié)果的分析，各單因素對于提取結(jié)果影響的順序大小為:溫度＞pH 值＞酶用量＞提取時(shí)間。即加酶比例的影響最小，溫度的影響最大，最佳提取工藝為:A2B2C1D3，反應(yīng)溫度50 ℃，pH=6.5，纖維素酶與果膠酶加酶比例1∶1(1%)，酶解時(shí)間60 min。

2.4 酶解-超聲聯(lián)合提取

豬苓酶解后，進(jìn)行超聲提取，在10、20、30、40、50 min 時(shí)取樣，測定多糖含量。

表3 酶解正交直觀分析表Table 3 Results of orthogonal test

表4 酶解正交方差分析表(α=0.05)Table 4 Variance analysis table for enzymatic hydrolysis extraction

圖5 酶解-超聲聯(lián)合提取條件與豬苓多糖提取率關(guān)系Fig.5 Effects of enzymolysis and ultrasonic time on the yield of PUPS

由圖5 可得超聲處理30 min，多糖得率最高6.48%，較處理前4.31%提高了27.12%。聯(lián)合提取最佳方案:豬苓5 g，纖維素酶與果膠酶用量比例為1∶1(1%)，蒸餾水200 mL，50 ℃水浴振蕩60 min，超聲提取30 min。

2.5 羥基自由基(·OH)清除能力

豬苓多糖對羥基自由基(·OH)清除作用，并以相同濃度的VC進(jìn)行對比，結(jié)果見圖6 所示，豬苓多糖樣品液對羥基自由基(·OH)有一定的清除作用，且清除率與豬苓多糖的濃度成正比，當(dāng)多糖液加人量小于3 mg/mL 時(shí)，其清除率與VC大致相同相同，當(dāng)大于4 mg/mL 時(shí)，其清除率略高于VC，說明酶法超聲提取的豬苓多糖的抗氧化能力與VC大致相當(dāng)。

2.6 超氧陰離子自由基清除率

圖6 樣品對羥基自由基的清除作用Fig.6 ·OH scavenging effects of PUPS

圖7 樣品對氧自由基清除作用Fig.7 scavenging effects of PUPS

3 討論

我國野生豬苓分布廣泛、資源豐富，具有巨大的開發(fā)潛力。中藥提取技術(shù)不僅是中藥制藥過程的重要環(huán)節(jié)，也是中藥制藥工業(yè)技術(shù)轉(zhuǎn)型升級的關(guān)鍵。酶法水解提取多糖具有條件溫和、雜質(zhì)易除和效率高等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)合酶水解豬苓提取豬苓多糖，提取效率較傳統(tǒng)的溶劑提取法大幅提高了49.65%。酶法提取多糖的過程中溶劑的用量是影響多糖提取效率的首要因素，這也是生產(chǎn)過程中不可低估的重要經(jīng)濟(jì)指標(biāo)之一，一般以能浸沒原料的最低的水用量為基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多糖的浸出率隨溶劑量增加而增加，傳統(tǒng)提取當(dāng)料液比超過1∶20，并兩次提取后，多糖增加的幅度不大。通過實(shí)驗(yàn)酶法提取的料液比定為1∶40，料液比固定后，就不再將其作為主要的影響因子。復(fù)合酶法對中藥的提取效率的提高，原因主要是通過分解破壞中藥材細(xì)胞壁的纖維素、半纖維素，以及果膠，從而產(chǎn)生局部的坍塌、溶解，造成組織疏松，這樣就減少了溶劑提取過程中來自于細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)的阻力，加快有效組分的溶出速率［12］。實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)合酶的聯(lián)合作用較單一酶的單獨(dú)作用的效率要高，原因與復(fù)合酶解共同水解破壁效率較單酶效率高，另一方面還與纖維素、半纖維素、果膠酶的水解也會(huì)部分增加糖的含量有關(guān)。在考察超聲對多糖提取的影響時(shí)，超聲對多糖的收率的貢獻(xiàn)進(jìn)一步從4.31%提高到5.46%。原因與超聲波促進(jìn)了豬苓組織結(jié)構(gòu)的疏松程度，增大了溶劑提取的滲透性，超聲振動(dòng)強(qiáng)化了介質(zhì)的擴(kuò)散與傳質(zhì)，避免長時(shí)間和高溫對提取物質(zhì)的降解，同時(shí)通過機(jī)械作用、熱效應(yīng)等加速促進(jìn)豬苓多糖的溶出有關(guān)［13］。因此利用酶法-超聲優(yōu)化提取豬苓多糖，較傳統(tǒng)的溶劑提取豬苓多糖具有反應(yīng)條件溫和、高效節(jié)能、成本低廉、設(shè)備簡單、操作方便等優(yōu)勢，在生產(chǎn)上有很大的發(fā)展空間。

對超聲酶法提取的豬苓多糖進(jìn)行了體外抗氧化活性的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，表明它對羥基自由基和超氧陰離子自由基具有較好的清除作用，其清除能力與多糖的濃度成正比。豬苓多糖對Fenton 法羥自由基清除率在5 mg/mL 濃度條件下達(dá)到25.1%，對·OH的清除率達(dá)到15.2%，與Vc 的體外抗氧化能力相當(dāng)，甚至優(yōu)于Vc。其抗氧化的機(jī)理可能與多糖的羥基、羧基、氨基以及硫酸基等復(fù)雜的基團(tuán)結(jié)構(gòu)直接作用于多種活性氧有關(guān)，多糖直接參與減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈的長度，捕捉脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生的活性氧，從而阻斷或減緩脂質(zhì)過氧化的進(jìn)行［14］;其次對于生物體內(nèi)羥基自由基可快速攝取利用多糖碳鏈上的氫原子生成水;對于氧自由基，多糖的活性基團(tuán)可與之直接發(fā)生氧化反應(yīng)而清除;對于單線態(tài)氧可將激發(fā)能量傳遞給多糖使其處于激發(fā)態(tài)而本身回歸到基態(tài)(猝滅)［15］。再次多糖可通過激活體內(nèi)原有的抗氧化酶的活力如SODGSH-Px 等來清除機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，間接發(fā)揮抗氧化的作用［16］。

通過酶法-超聲提取豬苓多糖的實(shí)驗(yàn)，不僅提取收率大幅增加，而且提取物體外抗氧化活性的能力與Vc 相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過該方法能有效的提高豬苓多糖的提取效率，并保持了多糖的活性。這為豬苓多糖的中藥提取制造技術(shù)轉(zhuǎn)型升級和工業(yè)化提取應(yīng)用探索了一條新的路徑。

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