雞致病性大腸桿菌油乳劑滅活苗的制備

衛(wèi)春曉劉俊玲.河南省濟(jì)源市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南濟(jì)源459000；.河南省洛陽(yáng)高新區(qū)畜牧獸醫(yī)防疫檢疫中心，河南洛陽(yáng)47000

雞致病性大腸桿菌油乳劑滅活苗的制備

衛(wèi)春曉1劉俊玲2
1.河南省濟(jì)源市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南濟(jì)源459000；
2.河南省洛陽(yáng)高新區(qū)畜牧獸醫(yī)防疫檢疫中心，河南洛陽(yáng)471000

摘要從一雞場(chǎng)患病雞體內(nèi)分離出1株雞致病性大腸桿菌，將分離的菌株擴(kuò)增、滅活，制備成油乳劑滅活苗。對(duì)滅活苗進(jìn)行物理性狀、安全性、保護(hù)力等檢驗(yàn)，確認(rèn)合格后，對(duì)雞場(chǎng)進(jìn)行免疫，效果良好。該油乳劑滅活苗對(duì)本場(chǎng)雞有較好的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞雞；大腸桿菌；致病性；滅活苗

衛(wèi)春曉，男，1987年生，助理獸醫(yī)師。

禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的急性或慢性傳染病。各種禽類均易感，各個(gè)品種、日齡的雞均可發(fā)病。隨著養(yǎng)殖場(chǎng)戶防疫意識(shí)的不斷提高，諸如新城疫等病毒性疫病基本得到有效控制。與此同時(shí)，細(xì)菌性疫病卻往往被忽略，特別是大腸桿菌病的發(fā)生和流行有越發(fā)嚴(yán)重的趨勢(shì)，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大損失，而大腸桿菌的血清型極多，我國(guó)已報(bào)道的雞致病性血清型已有50個(gè)，且各血清型之間沒(méi)有或很少有交叉保護(hù)，給疫苗免疫帶來(lái)一定困難，相比之下，利用本場(chǎng)病死禽制備滅活苗針對(duì)性強(qiáng)，能得到較滿意效果。

1　材料與方法

1.1致病菌株

某雞場(chǎng)病死禽，典型包心、包肝變化。無(wú)菌采取病雞肝臟，37℃麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)16 h后，挑取單個(gè)紫紅色菌落，再次接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)3次純化。

1.2菌種鑒定

1）形態(tài)特征。對(duì)分離到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

2）生化試驗(yàn)。對(duì)分離到的菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)，包括五糖（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖）發(fā)酵試驗(yàn)、M- R/V- P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)和三糖鐵試驗(yàn)。

3）致病性試驗(yàn)。將分離的菌株用普通肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)物接種于5只成年小白鼠（腹腔注射，0.5 mL/只）。同時(shí)，另取5只成年小白鼠注射無(wú)菌生理鹽水作對(duì)照，觀察菌株對(duì)小白鼠的致病性。

1.3大腸桿菌油乳劑滅活疫苗的制備

1）菌株的培養(yǎng)。將分離的菌株接種于普通肉湯，37℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)板菌落計(jì)數(shù)，菌液含菌量為1012個(gè)/mL，用滅菌生理鹽水菌液做10倍稀釋，使含菌量為百個(gè)每毫升。

2）水相制備。取上述菌液192 mL，逐級(jí)加入甲醛，使甲醛終濃度達(dá)到0.4%，37℃滅活48 h，經(jīng)無(wú)菌檢查合格后，加入吐溫- 80 8 mL，混勻即為水相。

3）油相制備。分別稱取10號(hào)白油376 mL、司班- 80 24 mL、硬脂酸鋁8 g。先取少量白油，將硬脂酸鋁加入其中，充分混勻并加熱溶解，再與剩余白油及全部司班- 80混合均勻。121.5 P l16℃高壓滅菌30 min，即得到油相。

4）菌苗配制。按照l(shuí)∶2的比例量取水相與油相，先將油相放入攪拌機(jī)，然后加入水相，10 000 r/min攪拌乳化5 min，即為油乳劑滅活苗。

1.4疫苗質(zhì)量檢測(cè)

1）無(wú)菌試驗(yàn)。取1 mL滅活苗用涂布棒均勻涂布于血清瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)48 h。觀察是否有菌落生長(zhǎng)。

2）物理性狀的檢測(cè)。

①穩(wěn)定性檢測(cè)。取滅活苗5 mL，3 000 r/min離心10 min，觀察有無(wú)分層或破乳；

②乳化度檢測(cè)。取1滴滅活苗滴于蒸餾水表面，觀察是否擴(kuò)散、消失。

3）安全性試驗(yàn)。隨機(jī)選取5只成年小白鼠，于背部皮下分別注射滅活苗0.5 mL；同時(shí)設(shè)滅菌生理鹽水對(duì)照組5只。觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1周內(nèi)的生長(zhǎng)狀況。

4）保護(hù)力試驗(yàn)。選15只成年小白鼠分為免疫組、生理鹽水對(duì)照組、感染對(duì)照組，每組5只。免疫組于第1天每只經(jīng)背部皮下免疫接種滅活苗（0.5 mL/只），感染對(duì)照組接種等量生理鹽水，接種后第14天，免疫組、感染組小白鼠用24 h培養(yǎng)物攻擊，生理鹽水對(duì)照組經(jīng)背部皮下每只注射0.5 mL滅菌生理鹽水，觀察1周內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生長(zhǎng)情況。

2　結(jié)果

2.1菌種

培養(yǎng)物經(jīng)3次純化傳代后，獲得1株菌株，革蘭氏染色呈陰性、中等大小桿菌；該菌株能夠分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但不能利用蔗糖。M- R試驗(yàn)和吲哚實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性，V- P試驗(yàn)陰性、不產(chǎn)生硫化氫。綜合判定，該菌株為大腸桿菌。

2.2致病性實(shí)驗(yàn)

3 h后實(shí)驗(yàn)組小白鼠精神開始萎靡，24 h內(nèi)全部死亡。對(duì)照組全部健康存活。對(duì)小白鼠進(jìn)行解剖，對(duì)比發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小白鼠肝臟、脾臟出現(xiàn)出血壞死，呈暗紅色，腸壁變薄，有出血點(diǎn)。取實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟做涂片，染色鏡檢，分離培養(yǎng)得到大腸桿菌。

2.3油乳劑滅活疫苗的質(zhì)量檢測(cè)

1）疫苗的無(wú)菌檢驗(yàn)。油乳苗種于血清平板后，37℃培養(yǎng)48 h未見細(xì)菌生長(zhǎng)。

2）疫苗的物理性狀。

①穩(wěn)定性檢測(cè)。疫苗經(jīng)3 000 r/min離心10 min后，為均質(zhì)乳白色液體。

②乳化度檢測(cè)。點(diǎn)1滴滅活苗于蒸餾水表面，不向四周擴(kuò)散，為油包水型。

3）疫苗的安全性。實(shí)驗(yàn)小白鼠注射疫苗后，短時(shí)間內(nèi)（6 h）表現(xiàn)精神沉郁，隨后觀察均無(wú)不良反應(yīng)，采食、飲水正常。剖檢其注射部位也無(wú)異常，說(shuō)明該劑量的油乳劑疫苗對(duì)試驗(yàn)小白鼠是安全的。實(shí)驗(yàn)小白鼠無(wú)異常反應(yīng)。

4）免疫效力試驗(yàn)。感染對(duì)照組小白鼠于24 h后全部死亡（死亡率為100%），免疫組于24 h后死亡1只，其余存活（死亡率為20%）。結(jié)果表明疫苗具有免疫保護(hù)作用。

2.4臨床應(yīng)用效果觀察

該雞場(chǎng)1 500只產(chǎn)蛋雞經(jīng)該疫苗免疫10日后，病雞死亡數(shù)量由每天10只以上，逐漸下降至零死亡，但產(chǎn)蛋率未恢復(fù)至發(fā)病前水平，考慮為病程久，對(duì)輸卵管損害較大的緣故。

3　討　論

致病性大腸桿菌是集約化養(yǎng)殖場(chǎng)的重要致病菌，且因其血清型多，型間交叉保護(hù)力差，使得疫苗免疫往往難以得到好的效果；采用抗生素預(yù)防與治療容易造成藥物殘留，并有產(chǎn)生耐藥菌株的情況。相比而言，該滅活苗有針對(duì)性強(qiáng)、保護(hù)力強(qiáng)、無(wú)殘留和低成本等優(yōu)勢(shì)。但也應(yīng)注意定期對(duì)雞場(chǎng)致病性大腸菌進(jìn)行病原血檢測(cè)，不斷調(diào)整滅活苗中菌株的血清型，才能使疫苗免疫發(fā)揮更好的效果。

收稿日期：2015- 04- 28