染色質(zhì)DNaseⅠ超敏感位點(diǎn)的定位及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的研究進(jìn)展

于文琪綜述，王雅梅審校

0 引 言

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是真核基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，近年研究發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)對(duì)DNaseⅠ的敏感性與基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)?；蚧罨瘯r(shí)其染色質(zhì)一般呈開放的疏松型構(gòu)象，更易被DNaseⅠ降解，形成DNaseⅠ超敏感位點(diǎn)(DNaseⅠhypersensitive sites，DHSs)。Gross等［1］發(fā)現(xiàn)DHSs 不僅與染色質(zhì)的開放度相關(guān)，還與啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、絕緣子和沉默子等元件相偶聯(lián);并且染色質(zhì)上具調(diào)控功能的DNA 序列、調(diào)控蛋白結(jié)合的區(qū)域也與DHSs 重疊。因此DHSs 的定位目前已經(jīng)成為準(zhǔn)確識(shí)別染色質(zhì)上基因調(diào)控元件、確定調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域的有效方法。DNA 元件百科全書(Encyclopedia of DNA Elements，ENCODE)計(jì)劃利用新一代高通量技術(shù)，首次大范圍繪制出人類DHSs圖譜，有助于全面理解人類基因組調(diào)控機(jī)制［2］。文中主要就DHSs 的定位及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的研究進(jìn)展作一綜述。

1 DHSs 的分布

DHSs 是一段跨度為數(shù)百堿基對(duì)，甲基化程度較低，對(duì)DNaseⅠ具有高度敏感性的染色質(zhì)區(qū)域，可富集轉(zhuǎn)錄因子和重要酶類，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。Natarajan等［2］研究發(fā)現(xiàn)，DHSs 區(qū)域約占全基因組的2%，表明多數(shù)具有調(diào)控功能的順式作用元件占基因組的比例較小。為系統(tǒng)尋找DNaseⅠ超敏位點(diǎn)，ENCODE 計(jì)劃利用大規(guī)模并行測(cè)序技術(shù)首次大范圍繪制出最詳盡的人類DHSs 圖譜［3-5］;描繪了全基因組共125 種人體細(xì)胞和組織類型的DHSs［2］。

DHSs 具有細(xì)胞特異性，不同DHSs 的細(xì)胞特異性高低不同。ENCODE 計(jì)劃通過分析所得數(shù)據(jù)，確定了2 890 742 個(gè)高可信度DHSs［2］，每個(gè)均在一種或多種細(xì)胞類型中活化。在所確定的DHSs 中，970 100 個(gè)是單種細(xì)胞類型所特有的，1 920 542 個(gè)在兩種或多種細(xì)胞類型中活化，3692 個(gè)在所有細(xì)胞中均能檢測(cè)到。Natarajan 等［2］根據(jù)DHSs 在基因組中的位置不同，將其分為3 類:①轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start sites，TSS)DHSs，與基因的TSS 重疊;②基因DHSs，與外顯子和內(nèi)含子重疊;③基因間DHSs，不與任何基因重疊。而這3 類DHSs 也具有明顯的細(xì)胞特異性。其中，基因間DHSs 細(xì)胞特異性最高，17%只在一種細(xì)胞中表現(xiàn)，而TSS DHSs 細(xì)胞特異性較小，僅＜1%為單種細(xì)胞所特有。DHSs的分布具有細(xì)胞種類和基因組位置的特異性，了解DHSs 的分布對(duì)于分析基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能有著重要的意義。

2 DHSs 的高通量測(cè)序技術(shù)

1978 年，研究者發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與DNA 結(jié)合后能夠保護(hù)結(jié)合部位不被DNaseⅠ降解，而通過確定脫氧核糖酸酶I 降解后留下的DNA 片段就能確定蛋白與DNA 結(jié)合的區(qū)域，這個(gè)方法稱為“脫氧核苷酸酶足跡法”。通過此種方法可精確鑒定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合區(qū)域，優(yōu)于傳統(tǒng)的僅用染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，CHIP)方法［6］。染色質(zhì)免疫共沉淀-測(cè)序(Chromatin immunoprecipitation-sequencing，Chip-Seq)技術(shù)，可精確鑒定調(diào)控蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。Chip-Seq 的不足之處在于如果被測(cè)序的片段在基因組多次重復(fù)，則無法對(duì)其是否為結(jié)合位點(diǎn)做出推斷［7］。

Crawford 等［8］建立了新的DNase 測(cè)序技術(shù)，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)人CD4+T 淋巴細(xì)胞的DNase文庫中的230000 個(gè)標(biāo)簽進(jìn)行了高通量測(cè)序，確定了14 190 個(gè)序列簇。將其與實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)相結(jié)合，以鑒定有效的DHSs 位點(diǎn)，從而獲得DHSs 圖譜。主要的技術(shù)路線:將DNaseⅠ切割得到的長(zhǎng)DNA 片段加Biotin 標(biāo)記的接頭，用超聲法或限制性核酸內(nèi)切酶打斷長(zhǎng)DNA 片段，利用Biotin 標(biāo)記純化DNA 片段，再經(jīng)PCR 大量擴(kuò)增構(gòu)建文庫，高通量測(cè)序檢測(cè)。該技術(shù)在染色質(zhì)高敏感位點(diǎn)區(qū)域的捕獲研究中發(fā)揮了重要的作用。

活性染色質(zhì)經(jīng)適量DNaseⅠ酶切反應(yīng)，可產(chǎn)生大量DNA 片段，長(zhǎng)度分布在10 bp-100 kb 范圍之間。高通量測(cè)序讀取的堿基長(zhǎng)度根據(jù)測(cè)序平臺(tái)不同從25-450 bp，染色質(zhì)DNaseⅠ產(chǎn)物中大量的長(zhǎng)片段DNA 不能直接用于高通量測(cè)序，還需要進(jìn)一步酶切或通過超聲打斷成短片段，再進(jìn)行相應(yīng)的PCR 擴(kuò)增構(gòu)建文庫，在此過程中會(huì)產(chǎn)生大量的背景噪聲。為能準(zhǔn)確捕獲更多的染色質(zhì)DHSs，并突破現(xiàn)有技術(shù)的限制，建立了一種新的染色質(zhì)高敏感位點(diǎn)區(qū)域的捕獲方法:對(duì)DNaseⅠ酶切產(chǎn)物中的短DNA 片段(100-300 bp)直接構(gòu)建文庫，從而大量減少了DNaseⅠ非特異性切割造成的背景噪聲，滿足了高通量測(cè)序?qū)Υ郎y(cè)DNA 樣品長(zhǎng)度的要求，簡(jiǎn)化了文庫構(gòu)建的程序，減少了文庫構(gòu)建過程中PCR 擴(kuò)增偏向性產(chǎn)物的生成，直接利用高通量全基因組深度測(cè)序技術(shù)捕捉染色質(zhì)高敏感位點(diǎn)區(qū)域，分析其分布特征［9］。利用實(shí)時(shí)PCR 技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該方法定位DHSs 相比于利用DNA 長(zhǎng)片段進(jìn)行高通量測(cè)序定位，測(cè)定的DHSs 數(shù)量更多，對(duì)DHSs的定位更精確。

目前DHSs 的高通量測(cè)序技術(shù)還在不斷優(yōu)化和完善［10-11］。在得到有效的DHSs 位點(diǎn)后，可通過熒光素酶檢測(cè)進(jìn)一步確定DHSs 位點(diǎn)與增強(qiáng)子、啟動(dòng)子等功能性元件的關(guān)系，從而獲得DHSs 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，為更好地理解不同細(xì)胞類型、發(fā)展階段、疾病和物種的基因表達(dá)調(diào)控提供了豐富的數(shù)據(jù)。

3 DHSs 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能

3.1 遠(yuǎn)端DHSs 啟動(dòng)子模型增強(qiáng)基因表達(dá) 染色質(zhì)上RNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)附近或遠(yuǎn)端的一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，可與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子協(xié)同作用決定基因轉(zhuǎn)錄的起始與轉(zhuǎn)錄效率。在DHSs 的分布中提到的ENCODE 計(jì)劃研究確定2 890 742 個(gè)高可信度DHSs中，約3%(75 575 個(gè))的DHSs 分布在TSS 區(qū)，5%(135 735 個(gè))位于TSS 區(qū)2.5 kb 內(nèi)，95%DHSs 距離TSS 區(qū)較遠(yuǎn)，稱其為遠(yuǎn)端DHSs［12］。ENCODE 計(jì)劃觀察:在各種細(xì)胞類型中，許多已知的增強(qiáng)子與目標(biāo)基因的啟動(dòng)子DHSs 同步活化［9］。為解釋這一現(xiàn)象，ENCODE 計(jì)劃分析了1 454 901 個(gè)遠(yuǎn)端DHSs 并聯(lián)系DHSs 上下游各500 kb 范圍內(nèi)的啟動(dòng)子。為驗(yàn)證遠(yuǎn)端DHSs 啟動(dòng)子之間的關(guān)系，研究人員利用5C技術(shù)評(píng)測(cè)染色質(zhì)的相互作用［13］。根據(jù)分析結(jié)果，ENCODE 計(jì)劃共確定了578 905 個(gè)遠(yuǎn)端DHSs 與至少一個(gè)的靶啟動(dòng)子高度相關(guān)，證實(shí)了不同細(xì)胞類型中遠(yuǎn)端DHSs 和特異啟動(dòng)子相結(jié)合的模型并繪制了遠(yuǎn)端DHSs 啟動(dòng)子模型圖譜［9］。證實(shí)了遠(yuǎn)端DHSs與特定啟動(dòng)子結(jié)合從而使遠(yuǎn)端DHSs 起到增強(qiáng)子功能，增強(qiáng)基因的表達(dá)。

在分析遠(yuǎn)端DHSs 啟動(dòng)子模型圖譜時(shí)，ENCODE計(jì)劃還發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端DHSs 啟動(dòng)子模型更易于調(diào)控因子的結(jié)合。在將人類所有基因按DHSs 與啟動(dòng)子組合的數(shù)量排列時(shí)，發(fā)現(xiàn)人類最復(fù)雜的調(diào)控基因顯著富集于免疫系統(tǒng)的功能性元件［10］。而多數(shù)啟動(dòng)子并非只與一個(gè)遠(yuǎn)端DHSs 相關(guān)，而是與多個(gè)遠(yuǎn)端DHSs 有關(guān)［8］。這說明對(duì)多數(shù)基因而言，存在組合性的遠(yuǎn)端調(diào)控輸入［14］。進(jìn)一步說明人類基因順式調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。ENCODE 計(jì)劃的研究人員猜測(cè)這種組合可能有助于加強(qiáng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄程序的穩(wěn)定性［12］。這種測(cè)定與特定的啟動(dòng)子相關(guān)遠(yuǎn)端DHSs 的思路，首次為定量測(cè)量基因整體調(diào)控復(fù)雜性提供了有效幫助。

3.2 DHSs 與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合控制基因轉(zhuǎn)錄活性轉(zhuǎn)錄因子通過與染色質(zhì)上的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合發(fā)揮作用，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件通常位于染色質(zhì)DHSs 的內(nèi)部或周圍。研究顯示TSS 附近DHSs 的GC 含量顯著高于基因區(qū)域［2］。因此轉(zhuǎn)錄因子通過與DHSs 結(jié)合控制基因轉(zhuǎn)錄活性。如β-珠蛋白基因遠(yuǎn)端的基因座控制區(qū)(locus control region，LCR)，位于珠蛋白基因上游，由一系列DHSs 組成［15］。LCR 含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，起到較強(qiáng)的增強(qiáng)子作用，從而提高珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平。

miRNA 作為基因表達(dá)調(diào)控分子，在抑制和沉默靶基因的表達(dá)中發(fā)揮了重要的作用［16］。Thurman等［12］分析了已被注釋的329 個(gè)非重復(fù)的miRNA TSS區(qū)，發(fā)現(xiàn)91%的miRNA TSS 區(qū) 與DHSs 重疊或距離較近。DHSs 作為DNA 調(diào)控元件的標(biāo)記，其富集的調(diào)控元件參與多種調(diào)控活動(dòng)和堿基修飾，如轉(zhuǎn)錄因子、啟動(dòng)子、DNA 甲基化等［17-19］。因此，定位和分析全基因組DHSs，可有效鑒定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合區(qū)域，有助于研究轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件協(xié)同作用的調(diào)節(jié)機(jī)制，也為功能基因組學(xué)的研究提供數(shù)據(jù)支持。

3.3 DHSs 與染色質(zhì)開放性 核小體能夠阻斷轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的結(jié)合，核小體缺乏意味著染色質(zhì)結(jié)構(gòu)處于開鏈或松散狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄因子能夠進(jìn)入并與順式作用元件結(jié)合，從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄［20］。為量化染色質(zhì)開放性與轉(zhuǎn)錄因子之間的關(guān)系，ENCODE項(xiàng)目組通過分析K562 細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子的CHIP-seq 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)CHIP-seq 信號(hào)與定量DNaseⅠ敏感性平行，說明少數(shù)調(diào)控因子所在的序列與染色質(zhì)開放區(qū)密切相關(guān)，證明了這部分序列是調(diào)控染色質(zhì)呈開放結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動(dòng)力［21］。作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的DHSs 通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，增強(qiáng)染色質(zhì)的開放性。

基于DNA 甲基化使得轉(zhuǎn)錄沉默從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的經(jīng)典理論，Thurman 等［12］分析了19種細(xì)胞中位于34 376 個(gè)DHSs 內(nèi)的243 037 個(gè)CpG島的甲基化強(qiáng)弱與染色質(zhì)開放程度之間的關(guān)系，其中20%DHSs 位于染色質(zhì)開放程度降低的區(qū)域，甲基化程度增高，顯示了甲基化與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性［16］。

Jacob 等［22］用DNaseⅠ測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了70 個(gè)約魯巴人來源的淋巴細(xì)胞系細(xì)胞中的染色質(zhì)開放區(qū)，確定了8902 個(gè)區(qū)域中與DNA 序列讀取深度顯著相關(guān)的基因型與附近的一個(gè)單核苷酸多態(tài)性的插入/缺失有關(guān)，稱這種變異體為DNaseⅠ敏感性的數(shù)量性狀位點(diǎn)(DNaseⅠsensitivity quantitative trait loci，dsQTLs)。研究人員分析這些dsQTLs，發(fā)現(xiàn)等位基因?qū)NaseⅠ所具有的敏感性程度與其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合數(shù)量呈高度正相關(guān)性。這說明對(duì)DNaseⅠ具有高度敏感性的基因所結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量更多，進(jìn)一步說明DHSs 區(qū)域染色質(zhì)開放度更高。Zhang 等［23］也發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平越高DNaseⅠ越敏感。這也證實(shí)了在有轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合的區(qū)域，染色質(zhì)更容易被DNaseⅠ所降解，即DHSs 染色質(zhì)處于開鏈或松散狀態(tài)。

4 結(jié) 語

真核生物的DHSs 通常與調(diào)控元件相關(guān)聯(lián)，繪制DHSs 是識(shí)別基因調(diào)控元件的一個(gè)準(zhǔn)確方法。新一代測(cè)序技術(shù)等實(shí)驗(yàn)手段的發(fā)展和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷完善，不僅能對(duì)一個(gè)物種的深度測(cè)序、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)研究、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、小分子RNA 研究以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等組學(xué)研究變得簡(jiǎn)單易行，也為ENCODE 計(jì)劃提供了技術(shù)支持［1］。在新一代測(cè)序技術(shù)的支持下，ENCODE計(jì)劃繪制出的人類DHSs 圖譜為研究人類轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)、核小體、DHSs 與基因表達(dá)的內(nèi)在聯(lián)系提供了大量的數(shù)據(jù)［24-25］。DHSs 通過與啟動(dòng)子關(guān)聯(lián)起到增強(qiáng)子作用，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性以及增強(qiáng)染色質(zhì)的開放性等從而影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的研究，只是為研究真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能提供理論上的支持，但將DHSs 與SNP 聯(lián)系起來，則是人類基因組計(jì)劃走向應(yīng)用的一個(gè)重要步驟。近年來，通過全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多與糖尿病、多發(fā)性硬化癥等重要疾病相關(guān)的SNP 突變位點(diǎn)［26-27］。

在研究人類轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)、核小體、DHSs與基因表達(dá)的內(nèi)在聯(lián)系時(shí)，ENCODE 計(jì)劃無疑為其提供了大量的數(shù)據(jù)支持。目前，ENCODE 計(jì)劃已完成前兩個(gè)階段的研究和實(shí)驗(yàn)，其現(xiàn)有研究成果匯總成30 篇學(xué)術(shù)論文分別發(fā)表于Nature(6 篇)、Genome Research(18 篇)和Genome Biology(6 篇)等SCI 期刊供其他研究者參考。但是，真核生物的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制復(fù)雜多樣使得ENCODE 研究計(jì)劃在取得豐碩成果的同時(shí)也面臨著巨大的挑戰(zhàn)［28-32］。相信ENCODE 計(jì)劃下一階段的相關(guān)科研工作將對(duì)功能元件的分類和轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究會(huì)更加深入和細(xì)化，將為人類疾病的研究和治療提供更加豐富的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)資源［33］。

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