晚期糖基化終末產(chǎn)物受體在腹腔感染膿毒癥中的研究進展

廖延年綜述，黃 騫，黎介壽審校

0 引 言

嚴(yán)重腹腔感染所導(dǎo)致的膿毒癥病情兇險、進展迅速、預(yù)后險惡，進一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，給臨床救治工作帶來極大困難，始終是現(xiàn)代危重病醫(yī)學(xué)面臨的重大問題。盡管對膿毒癥概念及臨床特征的認(rèn)識有所進步，但嚴(yán)重膿毒癥、MODS 的臨床試驗性治療大部分仍只是對癥治療，且常常收效甚微［1-2］，其病死率仍居高不下(50%～80%)［3］。其原因與膿毒癥和MODS 的根本發(fā)病環(huán)節(jié)及作用機制尚未充分闡明相關(guān)。近年來，關(guān)于晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation endproducts，RAGE)的研究越來越多，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中關(guān)于RAGE 的作用也逐漸受到關(guān)注［4］。

1 RAGE 的結(jié)構(gòu)與功能

RAGE 的命名是由于最早被發(fā)現(xiàn)和描述能與晚期糖基化產(chǎn)物結(jié)合［5］。它是一種膜表面受體，屬于免疫球蛋白超家族一員。其結(jié)構(gòu)包括1 個憎水性的跨膜結(jié)構(gòu)域、1 個胞質(zhì)內(nèi)尾段以及1 個胞外段，其中胞外段由1 個N 端V 型結(jié)構(gòu)域、2 個C 型結(jié)構(gòu)域組成。研究普遍認(rèn)為V 結(jié)構(gòu)域是RAGE 和胞外配體結(jié)合的主要位點，而胞內(nèi)尾段則與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。而RAGE 的某種剪切異構(gòu)體，缺乏跨膜區(qū)與胞內(nèi)尾段，游離于血漿中，稱為可溶性RAGE(soluble RAGE，sRAGE)。由于其具有V 結(jié)構(gòu)域，可與配體結(jié)合，但不會引發(fā)下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可競爭性抑制RAGE-配體相互作用，對細(xì)胞和組織起到保護作用［6］。

RAGE 廣泛分布在單核-巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等細(xì)胞表面?？膳cβ 淀粉樣肽、高遷移率族蛋白1、鈣結(jié)合蛋白S100 家族等眾多配體結(jié)合［6-7］。RAGE 與配體相互作用常導(dǎo)致快速持續(xù)的細(xì)胞活化和下游基因轉(zhuǎn)錄，主要是絲裂原活化激酶蛋白家族信號通路的4 個亞型，即ERK5、JNK 酶類、p38、ERK 激酶在不同類型細(xì)胞中被激活，并通過核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)持久活化持續(xù)和擴大炎癥反應(yīng)［8］。

2 RAGE 與炎性反應(yīng)

眾所周知，膿毒癥的實質(zhì)就是感染及其導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)(several systemic inflammatory response，SIRS)［9］。RAGE 被認(rèn)為參與膿毒癥的病理生理過程主要是源于其在炎癥反應(yīng)的始動和持續(xù)作用中扮演重要角色，而在眾多關(guān)于急慢性炎癥的研究中也得到證實［10］。

在炎癥反應(yīng)的過程中，中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞乃至樹突狀細(xì)胞細(xì)胞均扮演重要角色，研究發(fā)現(xiàn)，在這些細(xì)胞中均有RAGE 的表達［11-13］。而在這些細(xì)胞中RAGE 的高表達狀態(tài)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。而RAGE 也可進一步對各種炎癥細(xì)胞產(chǎn)生影響。以T 細(xì)胞為例，研究發(fā)現(xiàn)，RAGE 在T 細(xì)胞中的表達水平是與T 細(xì)胞的分化類型有關(guān)的，在抗原誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞增殖過程中，RAGE 配體激活的RAGE 可能參與了Th1+細(xì)胞分化的最終啟動階段。在RAGE 基因敲除的T細(xì)胞研究中，Th2 細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子類如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-4、IL-5 有所增加，而Th1 細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子如IL-2、γ 干擾素則有所減少，提示RAGE 的激活對平衡Th1 和Th2 細(xì)胞免疫有一定作用［13］。不僅如此，在內(nèi)皮細(xì)胞中，RAGE 亦有表達，能與白細(xì)胞β2-整聯(lián)蛋白-Mac-1 完全相互作用，RAGE-Mac-1 的交互作用使RAGE 具有白細(xì)胞黏附受體的作用［14-15］。體外實驗和動物實驗均顯示，RAGE 可作為白細(xì)胞整聯(lián)蛋白的反受體參與炎性細(xì)胞募集反應(yīng)。RAGE 作為內(nèi)皮細(xì)胞黏附受體并吸引白細(xì)胞的能力使其可直接調(diào)控白細(xì)胞的募集。與此同時，RAGE 介導(dǎo)的免疫細(xì)胞活化和促炎因子、黏附分子的上調(diào)也間接的促進了炎性細(xì)胞的募集［14，16］。

RAGE 信號通路始動于RAGE 與其眾多配體的結(jié)合，高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein，HMGB1)、晚期糖基化產(chǎn)物、S100B 等均被證實參與急慢性炎癥反應(yīng)［17-18］。這些配體從分類上屬于損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)，而RAGE 與病原體相關(guān)份子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的直接作用則少有研究。然而Yamamoto 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，RAGE 可以與脂多糖直接結(jié)合，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，提示RAGE 可能既結(jié)合DAMP，也能結(jié)合PAMP。作為重要的促炎因子，NF-κB及其下游靶向基因的轉(zhuǎn)錄在RAGE 的激活后得到啟動，而激活的NF-κB亦能調(diào)控RAGE 的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)在RAGE 基因的近端啟動子區(qū)域可以找到NF-κB 的功能性結(jié)合位點也證實了這一點［20］。在RAGE 和NF-κB 的相互作用下，形成惡性循環(huán)，炎性反應(yīng)持續(xù)存在。

3 RAGE 與腹腔感染膿毒癥

為探尋RAGE 在腹腔感染、膿毒癥中的具體影響，研究人員采用了眾多的方法來抑制RAGE 信號通路的活性，這些方法包括靶向RAGE 的抗體、RAGE 基因敲除、siRNA 沉默RAGE 基因、靶向RAGE 配體的抗體以及sRAGE 等。早期研究的對象主要集中在RAGE 的眾多配體，尤其是HMGB1。在細(xì)胞實驗中，膽堿能激動藥成功的抑制了巨噬細(xì)胞中HMGB1 的分泌，其抑制作用可能主要是在于HMGB1 的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運的阻斷，而與轉(zhuǎn)錄翻譯水平無關(guān)，使用膽堿能激動藥的實驗組的小鼠相對對照組的小鼠有著顯著的生存率的上升，同時循環(huán)中的HMGB1 的含量也減少了60%［21］。另一項類似研究中，使用抗HMGB1 抗體后，小鼠的生存率得到明顯改善，而循環(huán)中的促炎因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、IL-6 均 有 明 顯 下降［22］。Suda 等［23］在大鼠盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)模型上進行的膿毒癥大鼠中HMGB1 的研究同樣發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，注射抗HMGB1 抗體組的大鼠的生存率有明顯的改善，血清以及肺組織中HMGB1 陽性細(xì)胞的數(shù)量也有明顯減少。眾多實驗研究證實，以HMGB1 作為靶點進行干預(yù)，可以起到控制炎性反應(yīng)的作用。然而，HMGB1 不僅可以與RAGE 結(jié)合，它也是toll 樣受體(toll-like receptor，TLR)2、TLR4 的重要配體，僅針對HMGB1 的研究不能完全詮釋RAGE 的作用［24］。

隨著研究的逐漸深入，研究者們的目光逐漸的轉(zhuǎn)向了靶向RAGE 本身的研究。Lutterloh 等［25］在CLP 小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，相較于野生小鼠組的較低7 d生存率，雜合子小鼠(RAGE+/-)組和純合子RAGE基因敲除小鼠(RAGE-/-)組的7 d 生存率都有顯著的提高。而在針對需氧革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的組織培養(yǎng)中，各手術(shù)組小鼠肝、脾以及腹膜灌洗液中的菌群數(shù)量除了比假手術(shù)組明顯多以外，各組小鼠間無明顯差距。進一步運用RAGE 單抗的實驗發(fā)現(xiàn)，無論是術(shù)前還是術(shù)后24 h 內(nèi)給予RAGE 單抗，小鼠的7 d 生存率均有顯著上升。在產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的半數(shù)致死量的研究中，RAGE 雜合子小鼠、RAGE 基因敲除小鼠以及RAGE 單抗處理過的小鼠均表現(xiàn)出極大的耐受力，甚至超過2 倍于野生小鼠［25］。另外一項CLP 小鼠模型研究中，RAGE 單抗處理過的小鼠，其炎癥反應(yīng)過程中的眾多基因包括Socs3，Tnfaip3，Il17rd，Calcrl 和Ramp3 等的表達均受到抑制。膿毒癥若伴隨器官功能障礙，其治療難度將大大增加，為證實谷氨酰胺在膿毒癥誘發(fā)急性腎損傷的治療改善作用，研究人員利用CLP 小鼠模型進行實驗，預(yù)防性運用谷氨酰胺后，小鼠的生存率得到改善，而HMGB1 和RAGE 的表達均下調(diào)，NF-κB信號通路受到抑制。在大鼠的CLP 模型中，谷氨酰胺在急性肺損傷中的作用研究也得到了類似的結(jié)果［26］。

除此以外，由于可溶性RAGE 結(jié)構(gòu)的特殊性，sRAGE 也被用來進行腹腔感染、膿毒癥的研究。Yamamoto 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在注射脂多糖誘導(dǎo)膿毒性休克小鼠模型中，sRAGE 預(yù)處理小鼠后，不論是野生型小鼠、還是RAGE 基因敲除小鼠，其炎性因子IL-6、TNF-α 均有明顯下降，生存率也有明顯改善，這種改善效果甚至超過了單純RAGE 基因敲除小鼠組。提示sRAGE 不僅可競爭性抑制RAGE，也可競爭性抑制脂多糖的其他受體包括TLR-2、TLR-4。在另一項小鼠CLP 模型的研究中，用sRAGE-Fc 融合蛋白處理后的小鼠獲得了更高的存活率，肺組織的炎癥評分及其IL-1β、TNF-α、IL-6 的表達水平均有明顯的下降［27］。而更有現(xiàn)實意義的是，有臨床試驗表明，膿毒癥患者的預(yù)后與患者體內(nèi)的sRAGE 水平可能有著一定的關(guān)系。Brodska 等［28］發(fā)現(xiàn)，在納入研究的54 名膿毒癥患者中，相對于在28d 內(nèi)死亡的16 名患者，幸存的38 名患者首日的sRAGE 處于明顯更低的水平。而在第3 天，死亡組患者的血液sRAGE 水平較第1 天有著明顯的上升，而存活組的患者血液sRAGE 水平仍然保持較低水平。同時，在所有患者中，sRAGE 的水平與常用的炎性指標(biāo)C 反應(yīng)蛋白以及降鈣素原有關(guān)。提示sRAGE 可作為早期提示膿毒癥患者預(yù)后的生物指標(biāo)。

眾多的腹腔感染、膿毒癥的實驗研究顯示，RAGE 參與腹腔感染、膿毒癥的發(fā)生發(fā)展，抑制RAGE 的活性對于腹腔感染、膿毒癥具有正面作用，炎癥反應(yīng)受到抑制，器官功能障礙得到改善，生存率顯著上升。這些研究結(jié)果顯示，RAGE 信號通路對于腹腔感染的預(yù)后有著消極的作用，然而這是否說明RAGE 信號通路完全無益?

2009 年Zoelen 等［29］首先給出了否定的答案，在大腸桿菌腹膜炎的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，RAGE 基因敲除小鼠在腹膜注射大腸桿菌的20 h 之后，腹膜腔內(nèi)菌群生長速度、感染播散速度比野生型小鼠有明顯提升，肝細(xì)胞損傷、系統(tǒng)性炎癥因子釋放以及凝血功能障礙也較后者加劇。而野生型小鼠使用抗RAGE IgG 處理后也得出相同的結(jié)果。這些結(jié)果證實RAGE 信號通路在大腸桿菌導(dǎo)致的腹膜炎中具有保護性作用，其原因可能與伴隨的炎癥和促凝血反應(yīng)受到抑制有關(guān)。而進一步的實驗中，運用sRAGE 和抗HMGB1 后，得到了和RAGE 基因敲除相同的結(jié)果［30］。在另外一項類似的研究中，與RAGE 基因敲除小鼠相比，野生小鼠中的中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出明顯更強的大腸埃希菌殺滅能力。而RAGE 的3 種主要配體AGE、S100B、HMGB1 表現(xiàn)出不同的作用，AGE、S100B 增強了中性粒細(xì)胞中還原型輔酶II(NADPH)氧合酶的作用，使其殺滅大腸桿菌的作用增強，而HMGB1 則與之相反［31］。不僅如此，HMGB1 還能與凋亡相關(guān)蛋白caspase-1 相作用，解除凋亡誘發(fā)的免疫耐受，使膿毒癥小鼠的二次感染的易感性大大降低，免其受到二次打擊，對機體產(chǎn)生保護作用［32］。

盡管如此，我們并不能絕對說明他們得出了完全矛盾的結(jié)果。感染引發(fā)的炎性反應(yīng)很多時候表現(xiàn)出來像一把雙刃劍，一方面保護機體，使其免受病原體的侵襲，另一方面，也能對細(xì)胞和組織產(chǎn)生損傷。前述實驗中CLP 模型與大腸桿菌誘導(dǎo)的腹膜炎模型也有著明顯的不同。一般而言，前者病情一般較重，死亡率較高，而后者病情較穩(wěn)定，死亡率相對較低，而且值得注意的是，CLP 一般研究的是晚期炎癥反應(yīng)，而腹膜炎模型關(guān)注于早期機體對感染的抵御作用。在腹腔感染疾病的早期，著重于控制感染是主要目標(biāo)，而在疾病發(fā)展加重至膿毒癥乃至膿毒性休克的階段時，由于抗生素的使用，菌群對疾病的影響相較嚴(yán)重的SIRS 而言重要性降低。此時針對SIRS 進行干預(yù)對預(yù)后意義更為重大。

4 結(jié) 語

基于各種實驗的研究，我們認(rèn)為抑制RAGE 活性對于嚴(yán)重腹腔感染、膿毒癥是有益處的。毫無疑問，RAGE 在治療學(xué)上可成為一個有效的靶點。然而，至少還有兩個關(guān)鍵的問題需要解決。一是必須明確靶向RAGE 的治療在臨床上的優(yōu)點以及缺點;二是需要了解RAGE 阻斷對臨床受試者的遠(yuǎn)期影響。因為RAGE 在抵御病原體侵襲方面有著不容忽視的作用，因此顯得極為重要。要解決這些問題，需要開展進一步深入的研究，才能將理想中的治療策略變成現(xiàn)實。

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