RET基因甲基化在先天性巨結(jié)腸發(fā)生機(jī)制中的作用

張樹(shù)建，張輝，詹江華

RET基因甲基化在先天性巨結(jié)腸發(fā)生機(jī)制中的作用

張樹(shù)建，張輝，詹江華△

目的研究原癌基因RET的甲基化與先天性巨結(jié)腸（HD）之間的關(guān)系，了解其在腸壁神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生發(fā)展中的意義。方法選取天津市兒童醫(yī)院診治的HD手術(shù)切除病變組織標(biāo)本21例為試驗(yàn)組，均為擴(kuò)張段；同期非HD患兒正常結(jié)腸組織標(biāo)本5例，為對(duì)照組。應(yīng)用亞硫酸氫鹽測(cè)序法（BSP）直接檢測(cè)方法檢測(cè)RET的CpG島甲基化狀態(tài)，用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組中RET蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果試驗(yàn)組RET的CpG島有12例（57.14%）發(fā)現(xiàn)甲基化，對(duì)照組標(biāo)本均未發(fā)現(xiàn)甲基化。12例甲基化RET的蛋白表達(dá)的平均光密度為0.201±0.015，低于9例非甲基化RET的蛋白表達(dá)的平均光密度，為0.364±0.023，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論RET基因甲基化可能通過(guò)影響RET蛋白的表達(dá)水平，影響神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育，從而參與HD的發(fā)生。

Hirschsprung??；原癌基因蛋白質(zhì)c-ret；免疫組織化學(xué)；甲基化

先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung’s disease，HD）是一種常見(jiàn)的消化道發(fā)育畸形，發(fā)病率為1∶5 000。HD的發(fā)生機(jī)制主要與原癌基因RET、EDNRB突變，以及腸道神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的內(nèi)環(huán)境有關(guān)［1］。原癌基因RET是目前HD的最關(guān)鍵基因，參與神經(jīng)脊細(xì)胞的定向遷移［2］。表觀遺傳學(xué)（甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等不改變堿基序列的可逆性修飾）是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)［3］。本研究通過(guò)檢測(cè)HD患兒病變組織標(biāo)本原癌基因RET甲基化狀態(tài)及其擴(kuò)張段蛋白水平的表達(dá)差異，旨在探討原癌基因RET啟動(dòng)子上游CpG島與HD發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料選自天津市兒童醫(yī)院2010年1月—2012年3月診治的HD患兒21例為試驗(yàn)組，年齡2 d～11歲，其中男19例，女2例，均為散發(fā)，否認(rèn)家族史；均經(jīng)手術(shù)和病理診斷為HD。其中正常段所取部位經(jīng)病理證實(shí)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞正常，且擴(kuò)張段腸管為全層組織。對(duì)照組選取我院同期非HD患兒5例，年齡5個(gè)月～8歲，男3例，女2例，結(jié)腸重復(fù)畸形3例，結(jié)腸淋巴管瘤2例。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)儀器DK-8D型電熱恒溫水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海琪特分析儀器有限公司），YXJ-2離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司），H6-1微型電泳槽（上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（Gene Genius公司），U-3010紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（Hitachi公司），PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀、移液器（范圍100～1 000 μL，20～200 μL，0.5～10 μL）（加拿大BBI公司）；組織脫水機(jī)ASP200（Leica Microsystems GmbH），石蠟包埋機(jī)BMJ-1（天津天利航空機(jī)電有限公司），石蠟切片機(jī)M1210（Thermo Shandon Ltd），烤箱（SANYO Electric Co.Ltd），微波爐（格蘭仕集團(tuán)有限公司），烤片機(jī)（Leica），冰箱（三洋），光學(xué)顯微鏡（Olympus）和計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)（Leica Microsystems Wetz?lar GmbH 020-519.010LB30T，Germany）等。

1.2.2主要試劑NaHSO3（分析純）、NaOH、氫醌、TaqDNA聚合酶及dNTP、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒（SK1261）均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；粘片劑：0.1 g/L多聚賴(lài)氨酸溶液，購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗人RET免疫組化多克隆抗體（北京博奧森公司）；即用型非生物素廣譜二抗（上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司）。DAB顯色試劑盒：購(gòu)于上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司，包括A瓶（DAB底物緩沖液）、B瓶（DAB色原）。常規(guī)試劑：蘇木素染液、伊紅染液；0.01 mol/L PBS（pH7.2～7.4）；0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 7.6）等。

1.2.3亞硫酸氫鹽測(cè)序法（bisulfite sequencing PCR，BSP）26例標(biāo)本全層結(jié)腸組織各30 μg行DNA的提取和純化；DNA亞硫酸氫鈉修飾：約2 μg DNA于1.5 μL EP管中使用DDW稀釋至50 μL，加5.5 μL新鮮配制的3 mol/L NaOH，42℃水浴30 min。加10 mmol/L對(duì)苯二酚（氫醌）30 μL至上述水浴后混合液中，溶液變成淡黃色，加520 μL 3.6 mol/L亞硫酸氫鈉至上述水浴后溶液中。EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液。加200 μL石蠟油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化，50℃避光水浴16 h；修飾后DNA純化回收。RET基因甲基化PCR擴(kuò)增引物，上游5′-TGGGGGAAA ATTGGATTTTTTTTTTTTTTT（CT）GT-3′，下游5′-ACTTA?CAATCCCTACCTTTTACCCTTTCC（AG）C-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為485 bp，且RET有26個(gè)CpG島。內(nèi)參為GAPDH，上游5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′，下游5′-CATGT?GGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。反應(yīng)體系為50 μL，其中DNA 3 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，dNTP 1 μL，Taq Buffer 10×PCR Buffer（with Mg2+）5 μL，Taq酶（5 U/μL）0.8 μL，水38.2 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃4min，94℃45s，66℃45s，72℃1min，每個(gè)循環(huán)退火溫度遞減0.5℃，20個(gè)循環(huán)。94℃45 s，56℃45 s，72℃1 min，20個(gè)循環(huán)，72℃8 min。PCR電泳與回收參照試劑盒SK1261。檢測(cè)結(jié)果得出各組甲基化樣本數(shù)。

1.2.4HE及免疫組織化學(xué)染色方法應(yīng)用HE染色證實(shí)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存在，免疫組化染色RET。免疫組化染色方法：常規(guī)切片厚5 μm，脫蠟至蒸餾水，再用0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，然后加入稀釋好的一抗，4℃過(guò)夜。二抗采用SP試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，最后脫水透明后封片。

1.3結(jié)果判定（1）定性判定：光鏡下發(fā)現(xiàn)棕黃色物質(zhì)為陽(yáng)性反應(yīng)，其密度與部位即為RET表達(dá)的多少與分布，本實(shí)驗(yàn)選擇肌間神經(jīng)叢，計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)攝取圖像，存盤(pán)。（2）定量判定：在相同放大倍數(shù)的顯微鏡下拍攝的圖片中，病理切片均隨機(jī)取腸壁肌間神經(jīng)叢3～7個(gè)高倍鏡視野，有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師進(jìn)行陽(yáng)性染色結(jié)果鑒定，計(jì)算機(jī)圖像分析軟件（Im?age-Pro-Plus）分別計(jì)算3～5個(gè)視野中的神經(jīng)叢中棕黃色染色的平均光密度，再取其平均數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)處理用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包，計(jì)量資料用表示，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；甲基化率的比較采用Fisher’s確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HE在腸神經(jīng)叢的染色情況試驗(yàn)組擴(kuò)張段與對(duì)照組中典型的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞容易辨認(rèn)，見(jiàn)圖1、2。

2.2免疫組化染色結(jié)果在HD擴(kuò)張段中，甲基化與非甲基化RET基因表達(dá)蛋白陽(yáng)性染色均在細(xì)胞漿彌漫出現(xiàn)，在細(xì)胞膜有陽(yáng)性染色。腸壁肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢內(nèi)均可見(jiàn)RET陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖3、4。

2.3BSP直接測(cè)序結(jié)果21例HD病變組織標(biāo)本有12例（57.14%）發(fā)生甲基化，5例陰性對(duì)照組標(biāo)本均未發(fā)現(xiàn)甲基化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.042）。

2.4免疫組化染色圖像分析RET蛋白在HD擴(kuò)張段的神經(jīng)叢中12例甲基化樣本的平均光密度為0.201±0.015，9例非甲基化樣本的平均光密度為0.364±0.023，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.269，P＜0.05）。

3 討論

RET作為一個(gè)跨膜酪氨酸激酶受體，并且還是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）家族的受體，被證明是引起HD的主要基因［2］。RET基因定位于10q11.2區(qū)，長(zhǎng)約80 kb，有20個(gè)外顯子，其編碼產(chǎn)物RET蛋白是一種酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）受體，其基本功能是將細(xì)胞外信息轉(zhuǎn)變?yōu)閭魅爰?xì)胞內(nèi)的化學(xué)信號(hào)，對(duì)腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起重要的作用。

基因的表觀遺傳學(xué)對(duì)DNA的甲基化修飾研究較早，提出正常的甲基化對(duì)于維持細(xì)胞的生長(zhǎng)及代謝等是必需的，異常的DNA甲基化則會(huì)引發(fā)疾?。ㄈ缒[瘤），因?yàn)楫惓５募谆环矫婵赡苁挂职┗驘o(wú)法轉(zhuǎn)錄，另一方面也會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定［3-4］。DNA甲基化在基因表達(dá)上的調(diào)控作用是導(dǎo)致基因的失活，即基因沉默。這種調(diào)控作用從本質(zhì)上說(shuō)是一種DNA水平的調(diào)控，從效果上說(shuō)是直接影響基因的轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化也可以促進(jìn)基因突變，產(chǎn)生編碼蛋白數(shù)量的減少或蛋白質(zhì)功能異常，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生缺失或功能異常。既往研究表明RET缺失突變可引起RET受體蛋白水平或活性降低，從而影響RET配體GDNF的磷酸化活性和生物功能、組織神經(jīng)嵴源性細(xì)胞的正常發(fā)育，導(dǎo)致HD［5］。多數(shù)對(duì)RET原癌基因的研究是關(guān)于其突變誘導(dǎo)疾病產(chǎn)生，GDNF/RET信號(hào)傳導(dǎo)通路在腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演了非常重要的角色［6］。該通路主要是對(duì)腸神經(jīng)脊細(xì)胞的擴(kuò)增、分化及遷移有至關(guān)重要的作用。

本研究結(jié)果表明，21例標(biāo)本中12例發(fā)現(xiàn)甲基化，甲基化標(biāo)本RET的蛋白表達(dá)的平均光密度較非甲基化組低，由此可見(jiàn)RET甲基化致其蛋白的表達(dá)下降，進(jìn)而可能導(dǎo)致HD發(fā)生，這與Hindorff等［7］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Uesaka等［8］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠RET基因表達(dá)水平降為原來(lái)的50%時(shí)，會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似于HD樣無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段?；诖耍P者推測(cè)，甲基化修飾是一種不改變DNA堿基序列的可逆性基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程，其啟動(dòng)子上游富含CpG島區(qū)域可能主要干擾mRNA的合成，進(jìn)而影響rRNA，導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平下降。RET基因甲基化致其mRNA表達(dá)水平下降到一定程度后才有可能導(dǎo)致RET基因的表達(dá)沉默，進(jìn)而形成HD，但相關(guān)理論還有待進(jìn)一步證實(shí)。

總之，對(duì)RET基因甲基化研究的深入會(huì)對(duì)HD的發(fā)病機(jī)制有更進(jìn)一步了解。DNA甲基化是一種高于基因組序列水平的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，其在表觀基因組水平精確研究正常和疾病組織DNA甲基化模式的特征和差異，揭示如腫瘤、HD等疾病的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，并將DNA甲基化模式的改變與基因沉默、年齡相關(guān)變化和疾病特異性改變聯(lián)系在一起，將是一個(gè)有前景的研究領(lǐng)域。

（圖1～4見(jiàn)插頁(yè)）

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（2014-10-14收稿 2015-02-10修回）

（本文編輯 魏杰）

The role of RET proto-oncogene methylation in the pathogenesis of Hirschsprung's disease

ZHANG Shujian，ZHANG Hui，ZHAN Jianghua△
Department of Surgery，Tianjin Children’s Hospital，Tianjin 300074，China△

ObjectiveTo investigate the relationship between the methylation of RET（proto-oncogene，RET）and Hirschsprung disease（HD），and understand its significance in the development of intestinal wall ganglion cells.Methods Twenty-one surgical removal specimens，which were all dilation segment of HD in Tianjin Children’s Hospital，were used as experimental group，and 5 samples of non-HD normal colon tissues were used as control group.The bisulfite sequencing（BSP）-direct detecting method was used to detect RET CpG island methylation status.The expression of RET protein wasdetected by immunohistochemistry in experimental group and control group.ResultsIn the experimental group 12 cases（57.14%）were found methylation，but no methylation was found in control group.The average optical density of methylated RET protein was 0.201±0.015 in 12 cases.The average optical density of un-methylated RET protein was 0.364±0.023 in 9 cases（P＜0.05）.ConclusionRET CpG island methylation reduced protein expression levels of RET.The corollary RET gene methylation may influence the expression levels of RET protein，thereby affecting the ganglion cell development，and thus participating in the occurrence of HD.

Hirschsprung disease；proto-oncogene proteins c-ret；immunohistochemistry；methylation

R574.62

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.015

天津市兒童醫(yī)院外科（郵編300074）

張樹(shù)建（1983），男，碩士研究生，主要從事先天性巨結(jié)腸方面研究

△通訊作者E-mail:zhanjianghuatj@163.com