哺乳動物卵母細胞冷凍保存技術(shù)研究進展

王士勇，楊月春，2，李曉霞，刁云飛，梁永軍，許保增※

(1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟動物分子生物學(xué)重點實驗室，長春 130112；2．吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林 吉林 132012；3．吉林省四平市鐵西區(qū)畜牧管理服務(wù)中心，吉林 四平 136000)

哺乳動物卵母細胞冷凍保存研究一直備受人們關(guān)注，一方面，冷凍保存卵母細胞是動物遺傳資源保存的一種重要手段；另一方面，隨著哺乳動物胚胎工程技術(shù)的日益發(fā)展，對卵母細胞的數(shù)量和質(zhì)量要求越來越高；同時，人類輔助生殖研究需要卵母細胞冷凍保存作為技術(shù)支撐。到目前為止，人們對多種動物的體細胞冷凍保存技術(shù)已經(jīng)成熟，但是卵母細胞的冷凍保存效率還遠低于其他細胞，其原因可能是卵母細胞體積大、細胞膜的結(jié)構(gòu)和滲透性與其他細胞相異、冷凍過程中對冷凍保護劑造成的滲透壓變化較敏感等[1]。近年來，人們對卵母細胞冷凍保存研究做了細致的探索和研究，提出了很多新技術(shù)、新方法和新觀點。眾所周知，哺乳動物卵母細胞冷凍保存一般包括添加抗凍保護劑、冷凍保存、解凍復(fù)蘇和洗脫冷凍保護劑等幾個步驟，每一步操作都會由于滲透壓差造成卵母細胞的體積變化而導(dǎo)致其微結(jié)構(gòu)損傷甚至死亡[2]。本文就卵母細胞冷凍保存研究中所涉及的方法、載體、抗凍保護劑和新的研究觀點進行綜述，為進一步研究和改進卵母細胞冷凍保存技術(shù)提供參考。

1 冷凍方法

冷凍方法是影響卵母細胞冷凍效果的一個重要因素，常用的卵母細胞冷凍方法有慢速冷凍法和玻璃化冷凍法(快速冷凍法)2種。

1.1 慢速冷凍方法

卵母細胞進行慢速冷凍時需要采用程序降溫儀，其價格昂貴，操作步驟繁瑣，降溫時間較長，對卵母細胞解凍后的體外受精率、卵裂率及囊胚發(fā)育率影響較大，而且，在冷凍除人以外的動物未成熟卵母細胞時效果并不如意，雖然有移植后獲得了成活個體的報道[3，4]，但逐步被玻璃化冷凍方法所取代。Lim等[5]利用慢速冷凍法冷凍牛卵母細胞的研究表明，成熟與未成熟卵母細胞的抗凍性具有差異，凍融方法影響冷凍卵母細胞解凍后的存活率和發(fā)育能力。研究表明[6，7]，采用慢速冷凍方法冷凍卵母細胞時，成熟的卵母細胞冷凍后其受精能力、發(fā)育率和胚胎質(zhì)量要明顯優(yōu)于未成熟的。但是在實際生產(chǎn)應(yīng)用時，往往取得的卵母細胞恰恰是未成熟的，所以其應(yīng)用范圍非常受限。

1.2 玻璃化冷凍方法

玻璃化冷凍保存不需昂貴的程序冷凍儀器，但是其效果較慢速冷凍明顯行之有效，是目前普遍采用的卵母細胞冷凍方法。其優(yōu)點是操作簡單快捷、降溫迅速，能夠減少在冷凍過程中形成的冰晶，降溫過程中卵母細胞內(nèi)、外溶液呈玻璃樣，從而避免形成冰晶所帶來的機械性損傷。但是該方法也存在不可忽視的缺點，因為玻璃化冷凍時添加高濃度的冷凍保護劑容易引起化學(xué)中毒[8]，一旦操作過慢還可能會引起強烈地滲透損傷，從而破壞卵母細胞骨架結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致紡錘體和染色體結(jié)構(gòu)異常，凍融后卵母細胞的存活率、形態(tài)正常率、受精率和發(fā)育力等有所下降[9]。實現(xiàn)玻璃化冷凍通常有2條途徑，一條是極大地提高冷卻速率，另一條是增加保護劑的濃度[10]。因此，盡量選擇化學(xué)毒性小的冷凍保護劑及組合比例以及縮短冷凍液處理時間是玻璃化冷凍效果好壞的關(guān)鍵之一。

2 常用的冷凍載體

卵母細胞冷凍保存時，為了解凍后回收方便，一般需要將卵母細胞裝在載體中冷凍，常用的冷凍載體主要有冷凍細管、開放性拉長細管(Open Pulled Straw，OPS)和冷凍環(huán)(Cryoloop)等，也有人用玻璃微管(Glass micropipette vitrification，GMP)、封口式拉長細管(Closed Pulled Straw，CPS)、塑料微量吸頭(Plastic micropipette)和電鏡銅網(wǎng)(electron microscope grids，EMG)等載體[11]。選擇冷凍載體時盡量選擇容納冷凍液容積較小且熱導(dǎo)性較好的，這樣冷凍液降溫速度快。

2.1 冷凍細管

冷凍卵母細胞采用的細管載體通常為冷凍精液所用的麥管。在卵母細胞冷凍研究之初，由于細管冷凍較適宜程序冷凍儀、能夠進行批量冷凍而受到廣泛關(guān)注，并在胚胎冷凍上達到商用水平，但這種載體采用慢速冷凍時同樣操作時間較長，需要昂貴的儀器，因為細管溫度下降速率受其導(dǎo)熱性差所影響，降溫相對較慢，容易加大滲透性抗凍保護劑對卵母細胞的毒性損傷，隨著冷凍效果越來越被關(guān)注和拉長細管的開發(fā)使用而逐漸呈被淘汰趨勢。

2.2 拉長細管

拉長細管主要分為2種，一種是開放的拉長細管，一種是封閉的拉長細管。OPS法是將細管加熱后拉長變細，管壁變薄，這樣細管容積變小，裝載微量冷凍液即可完成冷凍保存過程，極大提高了冷凍速度，其降溫速率能達到20 000℃/min以上[11]。OPS技術(shù)是為超快速玻璃化冷凍技術(shù)設(shè)計的專用工具，在卵母細胞和胚胎冷凍方面迅速得到推廣應(yīng)用，卵母細胞冷凍效率不僅得到較大提高，而且解凍后的卵母細胞質(zhì)量較常規(guī)細管法明顯增強[12]。OPS法由于具有虹吸作用，卵母細胞的裝載時間相對縮短，與常規(guī)細管法相比不僅提高了冷凍和解凍的速度，同時減少了透明帶的損傷和滲透損傷[13]。CPS法與OPS法相似，研究表明，二者冷凍效率也沒有較大差異[14，15]。GMP法是在OPS法的原理上衍生而來的，只不過是將塑料吸管換成玻璃毛細管，由于其內(nèi)徑較小，同樣長度的玻璃毛細管拉長后容積約為OPS管的1/19，因此，GMP法比OPS法具有更快的冷凍速率，且由于比重較大不會漂浮在液氮中[16]。

2.3 冷凍環(huán)

冷凍環(huán)是直徑0.5mm～0.7mm的尼龍環(huán)，冷凍卵母細胞之前，在冷凍環(huán)上用冷凍液制作一層薄膜，然后將卵母細胞小心移到冷凍液薄膜上，這個過程較為精細，要求盡量減少冷凍液的同時將卵母細胞放置在薄膜上，然后迅速投入液氮中[17]。由于沒有細管等的隔離，而且冷凍液量少，冷凍解凍過程中溫度變化速度既迅速又均勻，能夠有效減少細胞的機械和滲透損傷[18]。如果長期保存卵母細胞，可以將冷凍環(huán)插入帶有磁性的冷凍帽上，放入液氮預(yù)冷的配套冷凍管中，這個冷凍管開口端帶有鐵圈，能夠有力吸住磁性冷凍帽，而且冷凍管底部有透氣孔，利于液氮迅速進入冷凍管。冷凍環(huán)法較之OPS法所需冷凍液更少，因此冷凍速率更快，其冷凍效果更佳[19]。

3 抗凍保護劑

抗凍保護劑是在冷凍液中添加的主要為了防止細胞冷凍損傷的物質(zhì)，主要分為滲透性保護劑和非滲透性保護劑2種。滲透性保護劑主要有乙二醇、甘油、丙二醇、二甲基亞砜、丁二醇、乙酰胺等。這類抗凍保護劑能夠使細胞迅速脫水，同時能夠降低冷凍液的凝固點，從而減少細胞內(nèi)形成冰晶而造成對各種細胞器機械損傷[20]。非滲透性保護劑主要包括葡萄糖、果糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖等小分子量糖類，同時也包括大分子量的聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、聚乙二醇等物質(zhì)。這類抗凍保護劑能夠增加并穩(wěn)定細胞外冷凍液的滲透壓，從而在外部達到細胞脫水目的的同時降低滲透損傷，并且可以降低滲透性抗凍保護劑的濃度，減少毒性損傷[21]。

在眾多抗凍保護劑中，最常用的主要是甘油、二甲基亞砜、蔗糖、海藻糖等物質(zhì)。海藻糖是由2個葡萄糖分子以1，1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，在冷凍液中添加后由于其熱穩(wěn)定性好而使玻璃化效果溫域增長，同時對卵母細胞的滲透保護作用被人們廣泛接受，應(yīng)用較為廣泛[22]。

4 卵母細胞體積調(diào)控

在卵母細胞玻璃化凍融過程中，由于細胞內(nèi)、外滲透壓差的存在，會造成卵母細胞因快速脫水或充水體積急劇皺縮或膨脹，從而導(dǎo)致卵母細胞的透明帶斷裂、紡錘體失常、細胞骨架損傷、功能分子平衡破壞等[23]。卵母細胞在凍融過程中受滲透壓影響而體積變化后，滲透壓調(diào)節(jié)分子通道會被激活，通過提高細胞內(nèi)無機離子和有機滲透壓而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)部分子的濃度，使卵母細胞達到正常體積[24]。近年來，通過調(diào)控卵母細胞體積、減少凍融過程中的滲透損傷來提高其冷凍效率的研究日益受到關(guān)注。Moawad等[25]在解凍后的胚胎培養(yǎng)液中添加滲透壓調(diào)節(jié)分子L-膽堿，顯著提高了小鼠卵母細胞凍融后的體外受精率和胚胎體外發(fā)育率，說明滲透壓對卵母細胞的影響不僅存在于凍融過程中，其調(diào)節(jié)作用至少能夠持續(xù)到解凍后受精及其后的胚胎發(fā)育階段。

5 展望

近年來，卵母細胞冷凍保存技術(shù)研究雖然得到了很大的進展，但是仍然難以擺脫滲透性抗凍保護劑細胞毒性的困擾，在冷凍載體上難以達到量產(chǎn)推廣的程度，凍融后的卵母細胞發(fā)育潛力還有提高的空間。相信在不久的將來，細胞體積調(diào)控理論能夠得到豐富，更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠被開發(fā)應(yīng)用為抗凍保護劑，卵母細胞冷凍保存效率會得到進一步提高，從而為人類生殖醫(yī)學(xué)、胚胎生物工程和動物種質(zhì)資源保存提供有力支撐和巨大的推動作用。

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