突觸后致密物蛋白95與疼痛

陳海軍(綜述)，萬燕杰，徐　靜(審校)

(1.徐州醫(yī)學院 江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應用技術重點實驗室，江蘇 徐州 221002； 2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院疼痛科，上海 200135)

突觸后致密物蛋白95與疼痛

陳海軍1△(綜述)，萬燕杰1，2※，徐靜2(審校)

(1.徐州醫(yī)學院 江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應用技術重點實驗室，江蘇 徐州 221002； 2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院疼痛科，上海 200135)

摘要：突觸后致密物(PSD)是位于中樞神經系統(tǒng)突觸后膜的特殊結構，它是由一系列細胞骨架蛋白與受體、激酶等傳遞突觸信號相關分子結合形成，包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體、神經型一氧化氮合酶(nNOS)等。近年來研究發(fā)現，作為PSD中一種重要的結構蛋白——PSD蛋白95(PSD-95)通過與NMDA受體、nNOS的相互作用參與了疼痛信息的處理過程。特異性針對PSD-95的抑制劑可表現出顯著的鎮(zhèn)痛作用。

關鍵詞：疼痛；突觸后致密物蛋白95；N-甲基-D-天冬氨酸；NR2B；一氧化氮合酶

疼痛是一種與組織損傷或潛在損傷相關的不愉快的主觀感覺和情感體驗。據報道，在全球有15%～25%的成年人正遭受疼痛的困擾，其中以老年人居多[1]。隨著我國老齡化社會的到來，疼痛患者也將會越來越多。從目前醫(yī)療水平看，疼痛的治療手段還很有限，或效果不佳或不良反應太大。但大量研究已經證明，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體的激活在疼痛信息的處理過程中發(fā)揮了關鍵作用[2-3]。在中樞神經系統(tǒng)的突觸部位，突觸后致密物(postsynaptic density,PSD)蛋白95(PSD-95)作為一個結構蛋白，可以將NMDA受體與神經元內部信號分子連接在一起[4]。這表明，PSD-95可能通過NMDA受體的功能參與到疼痛信息的處理過程并成為疼痛治療的一個潛在靶點?，F就PSD-95的分布、結構、功能以及在疼痛方面的研究進行綜述。

1分布

PSD-95是興奮性突觸中分離純化出來的一種蛋白質，因其聚丙烯酰胺凝膠電泳相對分子質量在95 000附近，而命名為PSD-95。PSD-95是一種胞質內的蛋白質，在中樞神經系統(tǒng)分布廣泛，主要存在于神經元細胞中。在脊髓，PSD-95含量豐富，且選擇性地分布于脊髓背角的表面，與 NMDA 受體的分布一致；此外，PSD-95廣泛存在于皮質結構中，包括小腦、大腦皮質(扣帶回、額葉、頂葉和顳葉)和海馬等[5-6]。

2結構與功能

PSD-95由N端3個重復的PDZ結構域、中間的SH3結構域以及C端的GK結構域組成。PSD-95的功能發(fā)揮主要與PDZ結構域有關，PDZ結構域能夠介導蛋白質間的相互作用，并特異性地與離子通道和受體等靶蛋白的C端結合。PSD-95第2個PDZ結構域不僅可以和NMDA受體中NR2B亞基tSXV結構(S：絲氨酸，X：任何一種氨基酸，V：纈氨酸)的C端第7個氨基酸緊密相連，還可以和一氧化氮合酶(nerve monoxide synthase，nNOS)的PDZ結構域形成PDZ-PDZ二聚體[7]。SH3結構域可以與Ras相關效應器蛋白及肌動蛋白結合，是介導蛋白質之間相互作用的模體，由于尚未發(fā)現能夠和SH3結構域相結合的伴體，因而其具體功能尚不明確。GK結構域因與酵母的胍氨酸激酶同源而得名，但它并不具備胍氨酸激酶催化單磷酸鳥苷合成雙磷酸鳥苷的活性，目前對其分子功能尚缺乏深入了解[8]。PSD-95是一種結構蛋白，其本身沒有蛋白酶活性，但可通過不同結構域與NMDA受體、nNOS等信號分子相互作用形成信號復合物，在突觸水平對興奮性信號進行整合。此外，PSD-95可通過突觸后神經元黏附分子neuroligins與突觸前膜外伸蛋白neurexins相互作用，參與突觸結構連接和功能的維持。PSD-95 N端兩個半胱氨酸殘基的棕櫚?；瘜τ赑SD-95的突觸定位功能十分重要。PSD-95棕櫚?；街饕芡挥|活性調節(jié)，棕櫚?；囊种苿t與突觸中PSD-95缺失有關；另外，位于PDZ2和PDZ3之間的殘基絲氨酸-295可以雙向調節(jié)神經元間的突觸可塑性變化，絲氨酸-295的磷酸化促進PSD-95的聚集并增強突觸的長時程增強，而絲氨酸-295的去磷酸化則促進突觸的長時程抑制[9]。有研究證實，PSD-95 使相互作用的膜蛋白在突觸水平更加穩(wěn)定的同時，對這些膜蛋白的功能特性起到調節(jié)作用，表現在NMDA受體門控通道呈現出PSD-95劑量依賴式改變和PSD-95對鉀通道的內向整合作用[10]?？傊?，PSD-95在突觸部位發(fā)揮了多種功能,如NMDA受體錨定作用；串集信號分子，參與受體信號轉導；維持突觸結構連接狀態(tài)；調節(jié)突觸可塑性等。

3PSD-95在疼痛中的作用研究

3.1PSD-95與NMDA受體相互作用參與疼痛信息處理NMDA受體是介導PSD-95參與疼痛的重要物質，NMDA受體在多種生理病理過程中發(fā)揮了關鍵作用，其中包括中樞神經系統(tǒng)中疼痛信息的處理過程。NMDA受體是一種由NR1、NR2(A-D)和NR3(A、B)三種不同亞基組成的異聚體復合物。大多數NMDA受體是由2個功能亞基NR1和2個不同亞型的NR2調節(jié)亞基構成。突觸中，NR2B亞單位通過C端PDZ結構域與PSD-95直接結合，當PSD-95的PDZ結構域缺失時，不僅影響NR2B與PSD-95之間的結合作用，還會導致細胞膜上NR2B聚集量大量減少[11]。近年來研究發(fā)現，NR2B與PSD-95相互作用在NMDA受體介導的疼痛信息處理過程中發(fā)揮了關鍵作用，鞘內注射PSD-95反義寡脫氧核苷酸將脊髓部位的PSD-95沉默，可以延緩大鼠神經損傷性疼痛的形成并減輕疼痛維持過程中的機械痛敏、熱痛敏反應[12-13]。有關蛋白質間相互作用的研究從另外一個角度支持了上述觀點。慢性坐骨神經縮窄性損傷模型大鼠手術側脊髓NR2B與PSD-95的免疫共沉淀比對側脊髓明顯增加，即與非手術側比較，手術側的PSD-95更多地與NR2B結合[14]。Tao等[15]為了進一步研究介導NMDA受體/PSD-95相互作用的PDZ結構域在炎性痛中的作用，將PSD-95的PDZ結構域和人類免疫缺陷病毒1型Tat蛋白的蛋白轉導域融合在一起，形成有細胞穿透功能的Tat-PSD-95 PDZ2；腹腔注射Tat-PSD-95 PDZ2 后，Tat-PSD-95 PDZ2可以進入小鼠脊髓背角并呈劑量依賴性地阻斷NMDA受體NR2亞基和PSD-95第2個PDZ結構域之間的連接作用；在足底注射完全弗氏佐劑引起的炎性痛小鼠，無論是完全弗氏佐劑注射前2 h或注射后1.5 h給予腹腔注射TatPSD-95 PDZ2，均明顯增加小鼠的機械痛閾值。這說明脊髓背角中NMDA受體NR2亞基和PSD-95之間的相互作用在炎性疼痛的形成和維持過程中發(fā)揮了重要作用。

3.2PSD-95與nNOS相互作用參與疼痛信息的處理nNOS是介導PSD-95參與疼痛的另一重要物質。一氧化氮是神經元細胞內一種重要的神經遞質，在神經系統(tǒng)中nNOS是一氧化氮合成的關鍵酶。nNOS作為NMDA受體下游一個重要的信號分子在疼痛形成中發(fā)揮了重要作用。脊神經結扎后大鼠脊髓水平nNOS 表達明顯增加；鞘內注射nNOS抑制劑會減輕慢性坐骨神經縮窄性損傷模型大鼠的熱痛敏反應；而nNOS基因剔除的小鼠其神經損傷所致的機械痛敏反應明顯降低[16-18]。另外，Kolesnikov等[19]發(fā)現，在足底注射甲醛的炎性痛大鼠脊髓背角中NMDA受體的亞單位NR2B和nNOS均出現表達上調，同時證明了NR2B和nNOS在功能上可以相互活化。PSD-95作為PSD中的重要結構蛋白，一方面與NR2B亞基的C端緊密相連，同時也與nNOS蛋白連接，通過PSD-95形成的復合物是NR2B和nNOS功能上互相活化的結構基礎；神經元中PSD-95的表達被特異性抑制后，并沒有影響NMDA受體激活所致的胞質內鈣離子的升高，但nNOS合成一氧化氮的能力顯著下降[20-21]?？傊琍SD-95對與其相連的蛋白功能及這些蛋白之間的相互作用可能起到某些調節(jié)作用，并成為將位于細胞膜上的NMDA受體和位于細胞內的信號轉導系統(tǒng)聯(lián)系起來的重要結構，參與疼痛信息的處理過程[22]。

3.3PSD-95相關抑制劑的應用進展機體受到致痛刺激后，神經沖動從外周傳入脊髓、大腦皮質等高位中樞，導致神經元突觸前膜釋放大量興奮性氨基酸——谷氨酸，谷氨酸與突觸后膜的NMDA受體結合引起鈣離子通道開放，致鈣離子內流，此時PSD-95作為PSD中的重要結構蛋白，不僅與NMDA 受體NR2B亞基緊密相連，同時也與nNOS連接，形成NMDA受體/PSD-95/nNOS信號復合物，這有利于鈣調蛋白與鈣離子結合活化nNOS，促進一氧化氮的生成。生成的一氧化氮一方面通過自由擴散方式作用于突觸前膜促進谷氨酸的釋放，另一方面激活下游信號通路參與疼痛的中樞敏化形成。隨著疼痛分子機制研究的不斷深入，治療疼痛的藥物也隨之發(fā)展。NMDA受體拮抗劑(如氯胺酮、右美沙芬和MK-801等)雖然臨床或基礎研究中仍然在用，但應考慮其在自主運動功能和學習記憶、認知等方面產生的不良反應。隨著分子生物學和基因學的發(fā)展，反義寡核苷酸技術得到應用，Tao等[11,15]應用此技術特異性抑制脊髓中PSD-95的表達，明顯改善了神經損傷性疼痛或炎性疼痛動物模型的痛覺過敏反應。Tat-NR2B9c可特異性地抑制NMDA受體的NR2B亞基與PSD-95第2個PDZ結構域連接作用，在神經損傷性疼痛模型大鼠鞘內注射Tat-NR2B9c可減弱大鼠的機械痛敏和熱痛敏反應，其自主活動能力沒有受到影響[14]。Andreasen等[23]比較了PSD-95二聚體拮抗劑UCCB01-125(特性阻斷PSD-95的PDZ1和PDZ2兩個結構域)和NMDA受體拮抗劑MK-801在炎性痛小鼠中的鎮(zhèn)痛作用以及對小鼠認知功能和自主活動能力的影響；結果顯示，UCCB01-125和MK-801均可以抑制完全弗氏佐劑所致的機械超敏反應，即均具有鎮(zhèn)痛作用；在使用鎮(zhèn)痛劑量的MK-801時，炎性痛模型小鼠出現了認知能力的減退和自主活動障礙，而UCCB01-125即使用到鎮(zhèn)痛劑量的30倍時，小鼠的認知功能和自主活動能力仍沒有受到明顯影響。

4小結

PSD-95作為PSD中一個重要的結構蛋白，雖然自身不具備生物活性，但可以與NMDA受體、nNOS等疼痛信號轉導蛋白在結構上緊密相連，通過對這些信號蛋白功能以及它們之間相互作用的調節(jié)發(fā)揮關鍵性作用。與NMDA受體拮抗劑相比，針對PSD-95的抑制劑不僅具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，而且在自主運動功能、認知等方面產生的不良反應較小。因此，PSD-95有可能成為疼痛治療的一個潛在治療靶點，針對PSD-95 的特異性拮抗劑的研發(fā)有著十分廣闊的前景。

參考文獻

[1]Dickerson DM.Acute pain management[J].Anesthesiol Clin,2014,32(2):495-504.

[2]Collins S,Sigtermans MJ,Dahan A，etal.NMDA receptor antagonists for the treatment of neuropathic pain[J].Pain Med,2010,11(11):1726-1742.

[3]Xu L,Pan Y,Zhu Q，etal.Arcuate Src activation-induced phosphorylation of NR2B NMDA subunit contributes to inflammatory pain in rats[J].J Neurophysiol,2012,108(11):3024-3033.

[4]Gottschalk M,Bach A,Hansen JL，etal.Detecting protein-protein interactions in living cells:development of a bioluminescence resonance energy transfer assay to evaluate the PSD-95/NMDA receptor interaction[J].Neurochem Res,2009,34(10):1729-1737.

[5]Tao YX,Huang YZ,Mei L，etal.Expression of PSD-95/SAP90 is critical for N-methyl-D-aspartate receptor-mediated thermal hyperalgesia in the spinal cord[J].Neuroscience,2000,98(2):201-206.

[6]林賢浩,鄭金熾.慢性強迫游泳對大鼠行為及其腦內突觸后致密蛋白95含量的影響[J].首都醫(yī)科大學學報,2011,32(6):820-824.

[7]Doucet MV,Harkin A,Dev KK.The PSD-95/nNOS complex:new drugs for depression?[J].Pharmacol Ther,2012,133(2):218-229.

[8]劉輝,張萬琴.PSD-95對NMDA受體信號轉導的整合作用[J].生理科學進展,2001,32(4):343-346.

[9]Kim MJ,Futai K,Jo J，etal.Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95[J].Neuron,2007,56(3):488-502.

[10]Cheng D,Hoogenraad CC,Rush J，etal.Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum[J].Mol Cell Proteomics,2006,5(6):1158-1170.

[11]Tao F,Tao YX,Mao P，etal.Role of postsynaptic density protein-95 in the maintenance of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain in rats[J].Neuroscience,2003,117(3):731-739.

[12]Peng HY,Chen GD,Lai CY，etal.Spinal serum-inducible and glucocorticoid-inducible kinase 1 mediates neuropathic pain via kalirin and downstream PSD-95-dependent NR2B phosphorylation in rats[J].J Neurosci,2013,33(12):5227-5240.

[13]Peng HY,Chen GD,Lai CY，etal.Spinal SIRPa 1-SHP2 interaction regulates spinal nerve ligation-induced neuropathic pain via PSD-95-dependent NR2B activation in rats[J].Pain,2012,153(5):1042-1053.

[14]D′Mello R,Marchand F,Pezet S，etal.Perturbing PSD-95 interactions with NR2B-subtype receptors attenuates spinal nociceptive plasticity and neuropathic pain[J].Mol Ther,2011,19(10):1780-1792.

[15]Tao F,Su Q,Johns RA.Cell-permeable peptide Tat-PSD-95 PDZ2 inhibits chronic inflammatory pain behaviors in mice[J].Mol Ther,2008,16(11):1776-1782.

[16]楊勇,郭曲練,鄒望遠，等.鞘內注射氯胺酮對甲醛炎性疼痛大鼠脊髓背角nNOS表達的影響[J].中南大學學報,2006,31(5):747-751.

[17]Payne JE,Bonnefous C,Symons KT，etal.Discovery of dual inducible/neuronal nitric oxide synthase (iNOS/nNOS) inhibitor development candidate 4-(2-cyclobutyl-1H-imidazo[4,5-b]pyrazin-1-yl)methyl)-7,8-difluoroquinolin-2(1H)-one (KD7332) part 2:identification of a novel,potent,and selective series of benzimidazole-quinolinone iNOS/nNOS dimerization inhibitors that are orally active in pain models[J].J Med Chem,2010,53(21):7739-7755.

[18]Guan Y,Yaster M,Raja SN，etal.Genetic knockout and pharmacologic inhibition of neuronal nitric oxide synthase attenuate nerve injury-induced mechanical hypersensitivity in mice[J].Mol Pain,2007,3:29.

[19]Kolesnikov YA,Chereshnev I,Criesta M，etal.Opposing actions of neuronal nitric oxide synthase isoforms in formalin-induced pain in mice[J].Brain Res,2009,1289:14-21.

[20]Woolf CJ,Salter MW.Neuronal plasticity:increasing the gain in pain[J].Science，2000,288(5472):1765-1769.

[21]Fan J,Vasuta OC,Zhang LY，etal.N-methyl-D-aspartate receptor subunit-and neuronal-type dependence of excitotoxic signaling through post-synaptic density 95[J].J Neurochem,2010,115(4):1045-1056.

[22]Beique JC,Lin DT,Kang MG，etal.Synapse-specific regulation of AMPA receptor function by PSD-95[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(51):19535-19540.

[23]Andreasen JT,Bach A,Gynther M，etal.UCCB01-125,a dimeric inhibitor of PSD-95,reduces inflammatory pain without disrupting cognitive or motor performance:comparison with the NMDA receptor antagonist MK-801[J].Neuropharmacology,2013,67:193-200.

Postsynaptic Density Protein 95 and PainCHENHai-jun1,WANYan-jie1,2,XUJing2.(1.JiangsuProvinceKeyLaboratoryofAnesthesiaandAnalgesiaApplicationTechnology,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou221002，China；2.DepartmentofPainClinic,PudongNewAreaGongliHospital,Shanghai200135，China)

Abstract：Postsynaptic density (PSD) is a special structure of the postsynaptic membrane in the central nervous system,which is composed of a series of cytoskeletal proteins and synaptic transmission-related signaling molecules:N-methyl-D-aspartate(NMDA) receptor,nerve monoxide synthase(nNOS) etc.Recent studies have found that,as an important structural protein of the PSD,PSD-95 is involved in the information processing of pain by the interaction with the NMDA receptor and nNOS.Inhibitors which is specific for PSD-95 show significant analgesic effect.

Key words:Pain; Postsynaptic density-95; N-methyl-D-aspartate; NR2B; Nitric oxide synthase

收稿日期：2014-12-16修回日期：2015-03-09編輯：鄭雪

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.17.011

中圖分類號：R441.1

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)17-3100-03