雞冠中透明質(zhì)酸提取工藝條件的研究

徐麗萍，王派麗，王 鑫

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076)

透明質(zhì)酸又名玻尿酸(HA)，是以β－D－N－乙酰氨基葡萄糖和β－D－葡萄糖醛酸為結(jié)構(gòu)單元、由β－1，3和β－1，4 糖苷鍵交替連接而成的一種直鏈線型聚陰離子黏多糖，呈白色、為無(wú)定形固體、無(wú)臭無(wú)味、具有強(qiáng)烈的吸濕性、溶于水、不溶于有機(jī)溶劑［1］.透明質(zhì)酸主要分布在動(dòng)物和人體結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)中，在眼玻璃體、房水、滑液、皮膚、臍帶中含量較高.它在溶液中的無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)和它的流體動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)賦予透明質(zhì)酸具有高度黏彈性、可塑性、滲透性、獨(dú)特的流變學(xué)特性以及良好的生物相容性，是一種生物可吸收材料［2］.透明質(zhì)酸像分子海綿一樣，可吸收和保持其自身重量上千倍的水分，是目前自然界中發(fā)現(xiàn)的保水性最好的天然物質(zhì)，也是國(guó)際公認(rèn)最好的保濕劑，有“天然保濕因子”(NMF)的美稱.由于保濕性強(qiáng)、生物相容性好，它還是重要的醫(yī)藥用原料，具有很高的醫(yī)用價(jià)值，使用效果特別顯著.它與其他天然的或合成的聚合物相比具有更強(qiáng)的保水能力［3－5］.透明質(zhì)酸不僅在眼科、骨科廣泛應(yīng)用，而且擴(kuò)展到外科、婦產(chǎn)科、耳科、手外科、神經(jīng)科等許多領(lǐng)域［6－7］.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雞冠，市售.

1.2 主要試劑與儀器

正丁醇(天津市福晨化工試劑廠);三氯甲烷(北京化工實(shí)劑廠);無(wú)水乙醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司);無(wú)水乙酸鈉(溫州市化工試劑廠);標(biāo)準(zhǔn)透明質(zhì)酸(上海源葉生物科技有限公司);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)TU－1900 型(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);微型植物粉碎機(jī)FZ102 機(jī)型(天津市泰斯特儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器R－205 型(上海申勝生物技術(shù)有限公司);電子分析天平ALC－1100.2 型(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);電子恒溫水浴箱DK－98－1 型(天津市泰斯特儀器有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 浸泡

稱取5 份新鮮公雞冠，每份20 g，用乙醇溶液浸泡24 h 至雞冠變硬為止，置于瓷盤中于干燥箱，干燥后粉碎.將粉狀物倒入燒杯中，加入6～7 倍蒸餾水，攪拌均勻，靜置浸泡過(guò)夜，使雞冠粉充分溶脹，收集濾液，濾渣再按同樣方法浸泡2 次，合并濾液.

1.3.2 除蛋白、脂肪

將濾液不斷攪拌加入10%的固體氯化鈉，完全溶解后，加入等體積的氯仿、正丁醇溶液(氯仿∶正丁醇為4∶1)，攪拌3 h 左右，采用分液漏斗分靜置分層取上層水相待用.平行3 次試驗(yàn)，以HA 得率為指標(biāo)選擇最佳預(yù)處理溶液.

1.3.3 乙醇提取透明質(zhì)酸單因素的選擇

以透明質(zhì)酸提取率為指標(biāo)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和相關(guān)文獻(xiàn)確定影響提取效果的因素，如乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間.為了確定實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)透明質(zhì)酸得率的影響，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).即改變某一條件，固定其他條件，測(cè)定透明質(zhì)酸的得率.

1)料液比單因素試驗(yàn)

量取5 份濾液，每份20 mL，以乙醇作為提取溶劑，分別按料液比為1∶1、1∶2 、1∶3、1∶4、1∶5 將二者混合，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%的條件下提取24 h 后，迅速置于水浴鍋中烘干.回收乙醇溶液，沉淀物干燥后即為HA 粗品.以透明質(zhì)酸得率為指標(biāo)，考察料液比對(duì)其影響.

2)提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)

量取5 份濾液，每份20 mL，以乙醇作為提取溶劑，按料液比1 ∶2 將二者混合，分別在時(shí)間為22、24、26、28、30 h，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%的條件下提取后，迅速置于水浴鍋中烘干.回收乙醇溶液，沉淀物干燥后即為HA 粗品.以HA 的得率為指標(biāo)，考察提取溫度對(duì)其影響.

3)乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素試驗(yàn)

量取5 份濾液，每份20 mL，以乙醇作為提取溶劑，按料液比1∶2 將二者混合，提取液值分別為75%、80%、85%、90%、95% 的條件下提取24 h后，迅速置于水浴鍋中烘干.回收乙醇溶液，沉淀物干燥后即為HA 粗品.以HA 得率為指標(biāo)，考察提取液pH值對(duì)其影響.

1.3.4 乙醇提取透明質(zhì)酸最佳條件的選擇

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇影響提取效果的三個(gè)主要因素:料液比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時(shí)間(C)，采用正交設(shè)計(jì)表L9(33)安排實(shí)驗(yàn).因素水平表見(jiàn)表1.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 定性定量分析實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 透明質(zhì)酸得率的測(cè)定

其中:W為HA 得率(%);m為HA 粗提物質(zhì)量(g);M為預(yù)處理后原料質(zhì)量(g).

1.3.5.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

量取20 mL 濾液，以乙醇作為提取溶劑，使用最佳工藝條件，做3 次平行實(shí)驗(yàn).

1.3.5.3 透明質(zhì)酸定性分析試驗(yàn)

采用紫外光譜法對(duì)HA 進(jìn)行定性分析，將HA標(biāo)準(zhǔn)品與提取樣品在OD 190～700 nm 范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)，比較透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品與樣品圖譜的出峰位置及峰形.

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇沉淀法提取透明質(zhì)酸單因素的結(jié)果與分析

選擇乙醇為預(yù)處理溶劑，選取影響透明質(zhì)酸的主要因素:料液比、沉淀、乙醇體積分?jǐn)?shù)，對(duì)三個(gè)因素分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以透明質(zhì)酸為指標(biāo)，確定三個(gè)因素下的透明質(zhì)酸的得率.

2.1.1 料液比單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，見(jiàn)圖1.隨著料液比為1∶1 到1∶2 時(shí)透明質(zhì)酸的得率顯著增加，當(dāng)料液比為1∶2時(shí)，得率達(dá)到最高點(diǎn)，繼續(xù)增加料液比透明質(zhì)酸得率呈下降趨勢(shì).因此，選定1∶2 的料液比為最佳比例.液料質(zhì)量比是提取過(guò)程中的一個(gè)重要因素，從傳質(zhì)速率的角度講，主要表現(xiàn)影響固相和液相主體之間的體積分?jǐn)?shù)差，即傳質(zhì)推動(dòng)力.液料質(zhì)量比小，提取過(guò)程中液相體積分?jǐn)?shù)增加快，兩項(xiàng)間的體積分?jǐn)?shù)差減少加快，從而使傳質(zhì)推動(dòng)力衰減加快.其次，液料質(zhì)量比的大小會(huì)影響兩相的混合情況，尤其在攪拌不充分的情況下，將改變傳質(zhì)系數(shù)，而影響傳質(zhì)速率.液料質(zhì)量比的提高必然會(huì)在較大程度上提高傳質(zhì)推動(dòng)力，但也提高了生產(chǎn)成本及后處理難度.

圖1 液料比對(duì)HA 提取率的影響

2.1.2 提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由圖2 可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)透明質(zhì)酸的得率顯著增加，在提取時(shí)間為24 h 時(shí)透明質(zhì)酸得率達(dá)到最高點(diǎn)，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，透明質(zhì)酸得率呈下降趨勢(shì).因此，為獲得較好的得率并考慮節(jié)約能源，確定提取時(shí)間為24 h.由此可以看出，提取時(shí)間對(duì)透明質(zhì)酸的得率有一定的影響.但需要指出的是提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也可能使透明質(zhì)酸成分生物活性受到破壞，有效成分不再被溶解，同時(shí)雜質(zhì)溶出量也隨之增多，因此提取時(shí)間要適宜.

圖2 提取時(shí)間對(duì)HA 提取率的影響

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，見(jiàn)圖3.隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高透明質(zhì)酸得率顯著增加，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，透明質(zhì)酸得率達(dá)到最高點(diǎn)，繼續(xù)升高體積分?jǐn)?shù)透明質(zhì)酸得率呈下降趨勢(shì).因此，選定90 %的乙醇為最佳體積分?jǐn)?shù).可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)是提取過(guò)程中的一個(gè)重要因素.利用乙醇的溶解性，將乙醇作為溶劑對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離提純，主要與其低碳直鏈醇的性質(zhì)有關(guān)，分子中的羥基可以形成氫鍵，因此乙醇黏度很大，也不及相近相對(duì)分子質(zhì)量的有機(jī)化合物極性大.

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)HA 提取率的影響

2.2 乙醇提取透明質(zhì)酸最佳條件結(jié)果與分析

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定最佳的提取方法，考察指標(biāo)為透明質(zhì)酸得率(%)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.正交試驗(yàn)結(jié)果得:A2B2C2為較優(yōu)條件組合.即采用提取時(shí)間為26 h，料液比1∶2，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%，為最優(yōu)條件.在上述最優(yōu)條件下，HA 提取率均為3.91% .

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

由表2 的極差分析可知，各因素對(duì)HA 得率影響的大小順序?yàn)锳 ＞C ＞B，即HA 提取液與乙醇體積比＞提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù).料液比對(duì)HA 得率影響達(dá)到顯著，是提取HA 的主要影響因素.

2.3 直觀分析

為了探索更好的實(shí)驗(yàn)條件的取值方向，以各因素的水平為橫坐標(biāo)，均值K為縱坐標(biāo)繪制因素與水平直觀圖，結(jié)果見(jiàn)圖4.

圖4 直觀分析圖

通過(guò)比較正交試驗(yàn)表中各因素的極差值(R)，由圖4 可以看出，各因素對(duì)HA 提取率影響的大小順序?yàn)锳 ＞C ＞B，即料液比＞提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù).料液比為1∶2、提取時(shí)間為26 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%.

2.4 方差分析

對(duì)正交試驗(yàn)做方差分析，分析出對(duì)實(shí)驗(yàn)影響顯著的因素有哪幾項(xiàng)，其結(jié)果見(jiàn)表3.由表3 可知，其中的料液比影響效果顯著.

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由表3 的極差分析可知，各因素對(duì)HA 提取率影響的大小順序?yàn)锳 ＞C ＞B，即HA 提取液與乙醇體積比＞提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù).料液比對(duì)HA得率影響達(dá)到顯著，是提取HA 的主要影響因素.最佳因素組合為A2B2C2，料液比為1∶2、提取時(shí)間為26 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%.

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與分析

用正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳工藝參數(shù)A2B2C2做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，用同批次樣品在同等條件下做平行樣三組，HA 得率為指標(biāo)，結(jié)果如表4.

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)

從表4 可以看出，經(jīng)3 次測(cè)定，HA 提取率平均值為4.67%.

但是，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中組別4 的得率為4.84%，大于正交試驗(yàn)優(yōu)化的得率4.67%，因此需顯著性分析.經(jīng)t 檢驗(yàn)顯著性分析，組別4和正交試驗(yàn)法優(yōu)化的得率之間不顯著(P ＞0.05)，從經(jīng)濟(jì)條件考慮，選擇組別4，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%，料液比1∶2，提取時(shí)間為26 h為最優(yōu)條件.提取率為4.84%.

2.6 透明質(zhì)酸定性試驗(yàn)結(jié)果分析

經(jīng)紫外光譜掃描可知，標(biāo)準(zhǔn)品透明質(zhì)酸在吸收波長(zhǎng)198 nm 處有較穩(wěn)定的吸收峰.以此確定標(biāo)準(zhǔn)透明質(zhì)酸的最大吸收波長(zhǎng)為198 nm，樣品與標(biāo)品的出峰位置及峰形一致.可以確定本實(shí)驗(yàn)提取物質(zhì)為透明質(zhì)酸，如圖5.

3 結(jié)語(yǔ)

采用雞冠為原料，以透明質(zhì)酸得率為指標(biāo)，對(duì)乙醇浸提法提取雞冠中透明質(zhì)酸的方法進(jìn)行研究.采用正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝并通過(guò)紫外光譜法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，以乙醇為主要提取溶劑，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間為影響因素提取透明質(zhì)酸，以透明質(zhì)酸得率為指標(biāo)，得出透明質(zhì)酸最佳提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、料液比1∶2、提取時(shí)間26 h，提取率為4.84%.由方差分析證明，料液比對(duì)透明質(zhì)酸的得率影響效果顯著.通過(guò)紫外光譜法檢測(cè)，結(jié)果表明提取出物質(zhì)與透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品峰形位置一致，進(jìn)一步證明從雞冠提出的物質(zhì)是透明質(zhì)酸.

圖5 HA 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品紫外光譜掃描曲線

［1］LIGHFOOT E N.Bioseparations［J］.Biotechnol Bioeng，2004，87:259－273.

［2］旺達(dá)姆.生物高分子［M］.5 卷.北京:化學(xué)工業(yè)出版社.2004:404.

［3］馮文帥.透明質(zhì)酸及其發(fā)展應(yīng)用前景［J］.四川食品與發(fā)酵，2001(1):4－6.

［4］王大為，張艷榮，沙 坤.中國(guó)林蛙皮多糖類天然保濕因子的提取與鑒定［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，24(6):99－102.

［5］郭學(xué)平，凌沛學(xué)，王春喜，等.透明質(zhì)酸的生產(chǎn)［J］.藥物生物技術(shù)，2000，7(1):61－64.

［6］LAGO G.Isolation，purification and characterization of hyalumnan from humanumbilical cord residues［J］.Carbohydrate Polymers，2005，62(4):321－326.

［7］凌沛學(xué)，賀艷麗，張 青.透明質(zhì)酸對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療作用［J］.食品與藥品，2005，7 (1A):1－3.