尋找受體分子研究方法的進(jìn)展

張　勇，張　君，雒真龍，姜毅楠，楊　超，杜瀟瀟(綜述)，陳忠華，周鴻敏(審校)

(　1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所 教育部器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 衛(wèi)生部器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430030；

2.湖北省宜昌市夷陵醫(yī)院普通外科，湖北 宜昌 443100； 3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心胸外科，武漢 430030)

尋找受體分子研究方法的進(jìn)展

張勇1△，張君2，雒真龍3，姜毅楠1△，楊超1△，杜瀟瀟1△(綜述)，陳忠華1※，周鴻敏3(審校)

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所 教育部器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 衛(wèi)生部器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430030；

2.湖北省宜昌市夷陵醫(yī)院普通外科，湖北 宜昌 443100； 3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心胸外科，武漢 430030)

摘要：配體與受體間的識(shí)別及相互作用是分子發(fā)揮其功能的重要途徑，具有重要的生物學(xué)意義。但是，尋找某一分子的受體并不容易，往往成為研究的瓶頸所在。目前尋找及驗(yàn)證某一對(duì)配體/受體分子及其對(duì)應(yīng)關(guān)系的方法有很多，包括免疫共沉淀、噬菌體展示、酵母雙雜交、分子模擬、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶pull-down、串聯(lián)親和純化等。該文對(duì)這些方法的基本原理、簡(jiǎn)要步驟及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述，為相關(guān)研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：免疫共沉淀；噬菌體展示；酵母雙雜交；分子模擬；串聯(lián)親和純化

受體是一類存在于細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)的特異性化學(xué)分子，絕大多數(shù)是蛋白質(zhì)；其能特異性識(shí)別并結(jié)合胞外信號(hào)分子，進(jìn)而激活胞內(nèi)一系列生理生化反應(yīng)，使細(xì)胞對(duì)外界刺激產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)[1]。配體和相應(yīng)受體的結(jié)合已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)，一種配體可以通過作用于不同的受體蛋白產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)[2]。闡明與某種配體特異結(jié)合的各種受體蛋白的化學(xué)本質(zhì)、基本結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性就很有必要。受體作為生命活動(dòng)的直接參與者，了解其功能特性就成為揭開生命科學(xué)中諸多奧秘的重要步驟[3]?，F(xiàn)就免疫共沉淀、噬菌體展示、酵母雙雜交、分子模擬、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)pull-down、串聯(lián)親和純化(trandem affinity purification,TAP)等研究方法進(jìn)行綜述。

1免疫共沉淀

免疫共沉淀是一種較早用于研究蛋白質(zhì)之間相互作用的經(jīng)典方法，它是利用抗原抗體之間專一性結(jié)合為基礎(chǔ)，以確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法，具有特異性強(qiáng)的特點(diǎn)[4]。用非變性的方法裂解活的細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)存在的許多完整的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的結(jié)合體被保留了下來，如果用已知配體蛋白的抗體免疫沉淀該配體蛋白，那么與配體蛋白在體內(nèi)結(jié)合的相應(yīng)的受體蛋白也能一同被沉淀下來[5]。此法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)。上述的受體蛋白通過沉淀、洗脫，從而得到分離純化，純化后的蛋白質(zhì)樣品可以通過二維凝膠電泳進(jìn)一步分離；通常二維電泳的第一維電泳是等點(diǎn)聚焦，蛋白質(zhì)根據(jù)其不同的等電點(diǎn)從而在凝膠管中分離，而后將其從凝膠管中完整取出，用十二烷基磺酸鈉的緩沖液處理30 min，使十二烷基磺酸鈉和凝膠中的蛋白質(zhì)充分混合；將處理過的凝膠條放在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的瓊脂糖溶液使其固定并與濃縮膠連接；在第二維電泳過程中，結(jié)合十二烷基磺酸鈉的蛋白質(zhì)從等電聚焦凝膠中進(jìn)入十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，在濃縮膠中被濃縮，在分離膠中依據(jù)其相對(duì)分子質(zhì)量大小被分離；經(jīng)過二維電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品再經(jīng)過蛋白質(zhì)譜分析(如肽質(zhì)譜指紋)進(jìn)而得到受體蛋白的化學(xué)本質(zhì)[5]。免疫共沉淀是一種經(jīng)典的研究蛋白質(zhì)間相互作用的方法，不僅可用于受體配體間的研究，還可用于其他蛋白之間相互作用的研究(如腫瘤的異質(zhì)性、病毒的侵襲及兩種蛋白質(zhì)相互作用的驗(yàn)證等)[6]。免疫共沉淀有其特有的優(yōu)點(diǎn)：①相互作用的蛋白質(zhì)都是活細(xì)胞的天然表達(dá)產(chǎn)物；②相互作用的蛋白都是在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞壁等穩(wěn)定的環(huán)境下發(fā)生的反應(yīng)，可以避免因人為因素而導(dǎo)致對(duì)反應(yīng)條件的影響；③通過最后的沉淀反應(yīng)可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物，以便進(jìn)一步分離、純化和鑒定新的目標(biāo)蛋白[7]。但是，該方法也有其不足之處：①低親和力的以及瞬間相互作用的蛋白可能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件的限制(如無法捕捉微觀分子間每一瞬間動(dòng)態(tài)結(jié)合的變化)，從而檢測(cè)不到實(shí)際上已經(jīng)發(fā)生相互作用的蛋白；②由于分子間作用的網(wǎng)絡(luò)性、復(fù)雜性，兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；③不適合用于大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用的篩查，如用Western blot檢驗(yàn)，須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白，以選擇最后檢測(cè)的抗體，在人類10萬種蛋白質(zhì)中，這無異于大海撈針[7]。

2噬菌體展示

噬菌體展示是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來并得到廣泛應(yīng)用的新技術(shù)。1985年，有學(xué)者首次提出噬菌體展示技術(shù)，他將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ中，使外源基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面[8]。噬菌體展示是一種能快速淘選出與靶分子特異性結(jié)合配體的高通量選擇技術(shù)[9]。其基本原理是：以噬菌體為載體，將外源基因插入到噬菌體衣殼蛋白基因中，并組裝出具有擴(kuò)增能力的噬菌體，且在其表面無缺損表達(dá)這一外源性蛋白-衣殼蛋白融合體的選擇技術(shù)[10]。展示于噬菌體表面的外源蛋白或多肽有獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，通過篩選，得到表達(dá)有特異外源蛋白的重組噬菌體，然后進(jìn)行DNA測(cè)序，并可以將篩選出的噬菌體擴(kuò)增繁殖，進(jìn)而得到大量富集的所需融合蛋白[9]。建立噬菌體肽庫(kù)有兩種方法：①有機(jī)合成法，體外人工合成各種隨機(jī)序列的核苷酸鏈，然后插入到噬菌體的基因中，從而得到表達(dá)；②基因工程法，外源蛋白或者多肽表達(dá)于噬菌體表面后，可以通過固相包被后洗脫或者液相孵育后沉淀等方法篩選與配體結(jié)合的特異外源蛋白，經(jīng)過3~4次篩選后擴(kuò)增噬菌體，經(jīng)過DNA測(cè)序分析即可得到目的蛋白或者多肽[8]。展示在噬菌體表面的多肽不能太長(zhǎng)，一般為20~30個(gè)，因?yàn)樘L(zhǎng)會(huì)影響噬菌體的感染能力，所得到的目的多肽還只是最終可能受體蛋白的一小部分，可以通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析出可能的受體蛋白，然后可以通過一些其他方法來驗(yàn)證[11]。通過噬菌體展示的方法尋找受體蛋白有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：①能對(duì)較大的文庫(kù)進(jìn)行快速篩選，是一種高通量淘選技術(shù)，效率高；②被篩選出的噬菌體還可通過擴(kuò)增繁殖得到大量目的蛋白多肽，有效避免了檢測(cè)時(shí)的靈敏度問題；③可以進(jìn)行多次淘選得到高親和力的多肽序列，從而得到特異度高的受體蛋白；缺點(diǎn)有：①載體的容量較??；②展示的多肽片段小，不能直接得到相應(yīng)的受體蛋白[12]。

3GST pull-down

GST pull-down是利用GST融合標(biāo)簽純化出GST融合蛋白[13]。GST pull-down是在1988年開始發(fā)展起來的，現(xiàn)已成為一種熱門的研究方法[14]。GST pull-down的基本原理是利用重組技術(shù)將配體蛋白的基因與GST的基因整合后重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)菌株并表達(dá)，產(chǎn)物為配體蛋白-GST復(fù)合物，將經(jīng)過純化后的融合蛋白固定在谷胱甘肽親和樹脂上，配體蛋白充當(dāng)“誘餌蛋白”，GST作為標(biāo)簽，將含有受體蛋白的樣品溶液過柱后形成GST-配體蛋白-受體蛋白復(fù)合物；再經(jīng)過洗脫得到的復(fù)合物通過二維電泳、肽質(zhì)譜指紋分析鑒定受體蛋白[15]。GST pull-down是能有效地驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外實(shí)驗(yàn)，此法靈敏度較高，并且簡(jiǎn)單易行，操作方便；但融合蛋白中的GST可能會(huì)影響配體蛋白的空間結(jié)構(gòu)[14]。

4TAP

TAP是德國(guó)學(xué)者于1999年開發(fā)出的一套研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，它是利用TAP標(biāo)簽，經(jīng)過兩步連續(xù)的親和純化得到更接近自然狀態(tài)的特定蛋白復(fù)合物，能在真實(shí)的生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)；TAP標(biāo)簽是由葡萄球菌A蛋白的2個(gè)免疫球蛋白(immune globulin，Ig)G結(jié)合結(jié)構(gòu)域(protein A，ProtA)及1個(gè)鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽(calmodulin bond peptide,CBP)組成，ProtA與CBP之間由1個(gè)煙草蝕紋病毒(tobacco etch virus,TEV)蛋白酶切割位點(diǎn)隔開[16]。TAP能在真實(shí)的生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)的相互作用，一定程度上打破了蛋白質(zhì)組學(xué)研究的瓶頸，運(yùn)用此項(xiàng)技術(shù)尋找新的受體蛋白成為一種重要途徑[17]。將配體蛋白的編碼基因與TAP標(biāo)簽基因融合于合適的表達(dá)質(zhì)粒，并將構(gòu)建好的質(zhì)粒導(dǎo)入相應(yīng)的細(xì)胞并正常表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白將形成穩(wěn)定的配體蛋白-TAP標(biāo)簽復(fù)合物；溫和裂解細(xì)胞，將裂解液在非變性的條件下與帶有標(biāo)簽的配體孵育，再將混合液經(jīng)過IgG瓊脂糖珠親和柱，與配體結(jié)合的受體蛋白可以通過ProtA標(biāo)簽與親和柱上的IgG瓊脂糖珠特異性結(jié)合，從混合液中分離出來，再用TEV蛋白酶切割標(biāo)簽，釋放仍帶有CBP標(biāo)簽的配體蛋白-CBP復(fù)合物，并可將其進(jìn)一步純化；在鈣離子存在的情況下，將純化后的產(chǎn)物與鈣調(diào)蛋白包被的親和珠一起孵育，復(fù)合物通過CBP標(biāo)簽又一次結(jié)合于鈣調(diào)蛋白的珠子上，洗劑棄雜后，與含有受體蛋白的樣品液孵育，再次洗劑，然后通過乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸洗脫即可得到高純度的天然構(gòu)象配體受體蛋白復(fù)合物[16]。最后可用二維電泳或質(zhì)譜分析鑒定受體蛋白。TAP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)有：①實(shí)驗(yàn)周期短；②是一種高效的在生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，更加真實(shí)地反映了細(xì)胞內(nèi)部的組分；③通過兩次親和純化，提高了目的蛋白的特異性。TAP技術(shù)存在的不足有：①TAP標(biāo)簽的引入可能會(huì)影響與靶蛋白的結(jié)合；②在用TEV酶處理的過程中，少數(shù)靶蛋白可能會(huì)被破壞；③細(xì)胞內(nèi)源的鈣調(diào)蛋白與CBP結(jié)合可能會(huì)影響第二次純化[16]。

5分子模擬對(duì)接

隨著人們對(duì)生物分子相互作用的認(rèn)識(shí)不斷加深以及計(jì)算機(jī)科學(xué)的迅速發(fā)展，分子模擬對(duì)接技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。1995年，Accelrys公司開發(fā)的計(jì)算化學(xué)軟件Affinity第一個(gè)上市[18]；此后，各種分子對(duì)接軟件不斷涌現(xiàn)，相關(guān)的各種技術(shù)不斷完善。分子對(duì)接是基于分子之間空間匹配和能量匹配建立人工模擬分子間的識(shí)別和結(jié)合的[19]?？臻g識(shí)別和能量識(shí)別是分子對(duì)接的兩大課題；幾何空間匹配是分子間發(fā)生相互作用基礎(chǔ)，而能量匹配是分子間保持穩(wěn)定結(jié)合的基礎(chǔ)。從基于空間匹配的剛性模型逐漸發(fā)展成為基于空間匹配和能量匹配的柔性模型可以將分子對(duì)接分為剛性對(duì)接、半柔性對(duì)接和柔性對(duì)接3類[18]。如何才能找到最佳結(jié)合位置是對(duì)接的關(guān)鍵，這就要計(jì)算分子間力學(xué)和空間結(jié)構(gòu)，使之盡可能的最優(yōu)化。因?yàn)榈孜锓肿雍褪荏w分子都是可以自由轉(zhuǎn)動(dòng)的，同時(shí)分子在相互靠近的過程中也在發(fā)生自身構(gòu)象的變化，因此其可能的結(jié)合方式非常復(fù)雜[20-21]。目前一些主要的分子對(duì)接軟件有Hyperchem、molecular operating environment (MOE)、Accelrys InsightII和Discovery Studio[18]。分子對(duì)接可以提供理論的可能受體分子模型，但該理論分子模型是否為要找的受體蛋白分子還高度依賴進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。如何實(shí)現(xiàn)最優(yōu)化的柔性對(duì)接是必須要考慮的問題，如果理論分子模型較多，還需一個(gè)一個(gè)排查；受限于蛋白質(zhì)組學(xué)的瓶頸，也可能最終得不到結(jié)果。

6酵母雙雜交系統(tǒng)

酵母雙雜交系統(tǒng)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展的一種檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的遺傳方法，是利用轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4(酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4的基因)的特性而建立的;GAL4由2個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，一個(gè)是N端的DNA結(jié)合域(DBD)，一個(gè)是C端的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)，兩者可以從核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)上分開并獨(dú)立表達(dá)出有功能的結(jié)構(gòu)域；而當(dāng)兩者在物理空間上靠近時(shí)可重新獲得完整的轉(zhuǎn)錄因子活性[22]。GAL4經(jīng)過外源重組后的融合基因與自然表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4一樣，可結(jié)合其順式元件UASG，并激活信號(hào)途徑下游半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄[16]。當(dāng)用配體蛋白X的核酸序列同DBD的核酸序列融合可以表達(dá)DBD-X，用受體蛋白Y的核酸序列同AD的核酸序列融合可以表達(dá)AD-Y；如果X和Y相互作用，則使DBD和AD兩結(jié)構(gòu)域在物理空間上靠近，而重顯完整的轉(zhuǎn)錄激活因子功能，激活其下游基因表達(dá);因此，檢測(cè)GAL4調(diào)控的半乳糖苷酶的活性就可判斷X、Y是否相互作用[23]。酵母雙雜交技術(shù)用于研究細(xì)胞核內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，不需提純蛋白便可研究蛋白的相互作用，消除了提純過程引起的蛋白變性，因而研究的是有生物活性的蛋白與蛋白之間的相互作用，反映了體內(nèi)的真實(shí)作用情況；再者，因?yàn)椴溉閯?dòng)物源性蛋白不易和酵母的內(nèi)源性蛋白結(jié)合，所以這在很大程度上避免了因酵母內(nèi)源蛋白與插入的外源蛋白結(jié)合而引起的干擾；另外，由于基因表達(dá)產(chǎn)物的可檢測(cè)性及表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性，因而蛋白質(zhì)之間微弱的或暫時(shí)的相互作用也可以通過檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物而得到驗(yàn)證[24]。酵母雙雜交技術(shù)也存在一些固有的局限性：①完整的蛋白質(zhì)生物學(xué)活性還有賴于翻譯后的加工修飾(如糖基化、二硫鍵的形成、甲基化等)，而蛋白質(zhì)的這些翻譯后加工修飾是在位于細(xì)胞質(zhì)中的一些細(xì)胞器的參與下完成的；而在雙雜交系統(tǒng)分析中，蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，這些蛋白質(zhì)還是未經(jīng)過加工修飾的，可能還不具備某些生物學(xué)功能和活性，并且有些蛋白的正確折疊和完整功能的形成有賴于同源或同種系的細(xì)胞器的加工修飾而非酵母細(xì)胞，也限制了細(xì)胞外蛋白和膜受體蛋白等的研究；②由于基因表達(dá)調(diào)控的模式并非一成不變的，過程非常復(fù)雜；某些蛋白本身就具有激活轉(zhuǎn)錄功能，不一定由兩種外源蛋白的結(jié)合而觸發(fā)轉(zhuǎn)錄激活作用；另外，有的蛋白表面的一些基團(tuán)可以與多種蛋白質(zhì)產(chǎn)生低親和力(如某些極性基團(tuán)、氫鍵、范德華力等等的作用)，可能啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致產(chǎn)物的表達(dá)，這些都能產(chǎn)生“假陽性”結(jié)果；③不太適用于尋找某種配體的未知受體蛋白，更適合于驗(yàn)證某種受體蛋白是否能與相應(yīng)的某種配體結(jié)合[24]。

7小結(jié)

人類對(duì)生命活動(dòng)的研究早已進(jìn)入分子領(lǐng)域，新的受體的出現(xiàn)可能會(huì)對(duì)某些生命活動(dòng)過程的認(rèn)識(shí)有重要意義，如在一些重大疾病的預(yù)防或者診治以及基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的應(yīng)用中有重要價(jià)值，而且還可能會(huì)對(duì)不斷發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)作出貢獻(xiàn)。以上的各種研究方法都有其各自的優(yōu)劣點(diǎn)，研究者可以根據(jù)自己的課題特點(diǎn)選擇合適的研究方法。隨著研究技術(shù)和條件的不斷發(fā)展和完善，相信將來一定會(huì)有更趨完美的方法來揭開生命更多的奧秘。

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Progress of Ways to Find Receptor Molecules

ZHANGYong1,ZHANGJun2,NUOZhen-long3,JIANGYi-nan1,YANGChao1,DUXiao-xiao1,CHENZhong-hua1,ZHOUHong-min3. (1.InstituteofOrganTransplantation,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,KeyLaboratoryofOrganTransplantation,MinistryofEducationandMinistryofHealth,Wuhan430030，China; 2.DepartmentofGeneralSurgery,YilingHospital,Yichang443100,China; 3.DepartmentofCardiothoracicSurgery,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030，China)

Abstract：Recognization and interaction between receptor and ligand is an important way for molecules to perform their functions,and has great biological significance.Researches on receptor and ligand have an essential role in biological science.The progress of numerous researches,however,are frequently prevented by the undiscovered receptors of some specified molecular.The methods to find receptor of a molecular include co-immunoprecipitation，phage display,yeast two-hybrid system,molecular docking simulation,glutathione S-transferase pull-down,and tandem affinity purification.Here is to introduce the fundamental theory,procedure,merits and demerits of these methods,in order to provide reference for the related research.

Key words:Co-immunoprecipitation； Phage display； Yeast two-hybrid system； Molecular docking simulation； Tandem affinity purification

收稿日期：2014-08-14修回日期：2014-11-03編輯：鄭雪

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31270955)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.10.007

中圖分類號(hào)：R33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)10-1745-04