血栓性疾病蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展

劉曉霞，康　婭，劉　聰，倪　艷，岳永花(綜述)，郝旭亮(審校)

(山西省中醫(yī)藥研究院中藥方劑研究所，太原 030012)

血栓性疾病蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展

劉曉霞△，康婭，劉聰，倪艷，岳永花(綜述)，郝旭亮※(審校)

(山西省中醫(yī)藥研究院中藥方劑研究所，太原 030012)

摘要：血栓性疾病是目前人類死亡的最主要原因之一，由于其發(fā)病機(jī)制尚未明確，以致病死率居高不下。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以高通量地對(duì)比健康、疾病及給藥后蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，有效地進(jìn)行疾病標(biāo)志物及藥物靶點(diǎn)的篩選和鑒定。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法的建立和發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在動(dòng)脈血栓、靜脈血栓疾病的診斷、治療等方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。該文就血栓性疾病蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的研究進(jìn)展予以綜述。

關(guān)鍵詞:血栓性疾??；動(dòng)脈血栓；靜脈血栓；蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

血栓形成和血栓栓塞兩種病理過(guò)程所引起的疾病，臨床上稱為血栓性疾病，主要包括動(dòng)脈粥樣硬化血栓、靜脈血栓、外周動(dòng)脈血栓[1]。由于目前血栓性疾病發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此對(duì)其的早期診治還不十分滿意。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為血栓性疾病提供了新的診斷方法和治療策略。每一種疾病的發(fā)生都是特定蛋白質(zhì)群體在不同時(shí)間和空間出現(xiàn)，并發(fā)揮不同作用的結(jié)果。從血栓性疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的整體、動(dòng)態(tài)、網(wǎng)絡(luò)研究探討血栓性疾病發(fā)生過(guò)程中蛋白質(zhì)的所有特征性變化，從而更加深入地探索其發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物，研發(fā)新藥等。現(xiàn)就近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)在血栓性疾病方面的研究進(jìn)展予以綜述。

1動(dòng)脈血栓

動(dòng)脈血栓形成主要累及心血管、腦血管和外周動(dòng)脈血管(下肢動(dòng)脈、腎動(dòng)脈等)，這些部位的血栓大多是在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂的基礎(chǔ)上形成的，即血管內(nèi)壁損傷使血小板聚集導(dǎo)致血栓形成，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致心肌梗死、腦梗死和急性下肢缺血、壞死等[1]。

1.1動(dòng)脈粥樣硬化血栓已有研究證實(shí)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化與破骨細(xì)胞相關(guān)受體(osteoclast-associated receptor，OSCAR)密切相關(guān)[2]。Goettsch等[3]采用細(xì)胞穩(wěn)定氨基酸同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)OSCAR的功能進(jìn)行研究，成功檢測(cè)到4975個(gè)特征蛋白；OSCAR過(guò)表達(dá)調(diào)節(jié)145，沉默調(diào)節(jié)110，這些蛋白主要參與細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；研究結(jié)果表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生的OSCAR參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)信號(hào)通路和單核細(xì)胞的黏附。STAT3在血管損傷重構(gòu)時(shí)，能促進(jìn)上皮細(xì)胞再生并增加肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的抗凋亡活性[4]，抑制內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和長(zhǎng)期攝入酒精后引起的炎癥[5]，即激活OSCAR所產(chǎn)生的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用可能通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3的激活發(fā)揮作用。de la Cuesta等[6]采用激光顯微切割分離內(nèi)膜，通過(guò)差異熒光凝膠電泳分析比較粥樣硬化前后的冠狀動(dòng)脈和橈動(dòng)脈，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有13個(gè)蛋白表達(dá)發(fā)生變化(7個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，6個(gè)下調(diào))，這些差異表達(dá)蛋白涉及血管平滑肌細(xì)胞的遷移能力、細(xì)胞外基質(zhì)成分、固縮、凋亡、熱激反應(yīng)和內(nèi)部斑塊出血沉積等，說(shuō)明動(dòng)脈血管內(nèi)膜的蛋白變化可以作為早期診斷動(dòng)脈粥樣硬化的依據(jù)。早在2008年，Arias-Salgado等[7]進(jìn)行了動(dòng)脈血栓和缺血性動(dòng)脈血栓患者血小板蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，結(jié)果顯示，大多數(shù)差異蛋白與細(xì)胞骨架的改變有關(guān)，其中患者血小板蛋白質(zhì)組中有3個(gè)蛋白表達(dá)減少，4個(gè)蛋白表達(dá)增加。Banfi等[8]采用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，研究冠狀動(dòng)脈疾病血小板蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)了能量代謝蛋白(lactate dehydrogenase、2-OXO-glutarate dehydrogenase)、細(xì)胞支架(lambda actin、coronin 1β、PPpieckstrin)和蛋白降解(psb8)共6個(gè)差異蛋白。Moxon等[9]采用二維電泳和免疫印跡的方法對(duì)動(dòng)脈血栓的血小板蛋白進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，整合素連接激酶、果糖二磷酸醛縮酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶在動(dòng)脈血栓患者血小板中表達(dá)減少，肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白、p57、非肌層肌球蛋白重鏈、M2丙酮酸激酶同工酶、磷酸甘油酸激酶表達(dá)增加，這些蛋白與細(xì)胞骨架組織的穩(wěn)定性和蛋白水解的增加有關(guān)，提示這些蛋白變化可能與冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。

1.3腦梗死有學(xué)者采用表面增強(qiáng)激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜及蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對(duì)腦梗死患者與健康對(duì)照者的血漿蛋白質(zhì)進(jìn)行比較研究，實(shí)驗(yàn)中以發(fā)現(xiàn)的13個(gè)潛在標(biāo)志物組成的血漿蛋白質(zhì)譜為診斷模型,可很好地區(qū)分腦梗死組與正常對(duì)照組，具有較高的敏感性和特異性；其中由質(zhì)荷比分別為2667，5914及6890的3個(gè)潛在標(biāo)志物所組成的診斷模型,能100%區(qū)分急性腦梗死患者與正常對(duì)照者，為急性血栓性疾病的標(biāo)志物研究奠定了基礎(chǔ)[12-13]。

2靜脈血栓栓塞

靜脈血栓栓塞包括深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis，DVT)和肺栓塞。由于早期臨床表現(xiàn)少，靜脈血栓栓塞的發(fā)病率很高，而發(fā)現(xiàn)率非常低，往往會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。

2.1DVTFlores-Nascimento等[14]利用強(qiáng)陽(yáng)離子柱分離和電噴霧質(zhì)譜技術(shù)，研究自發(fā)近端靜脈血栓患者與健康者的血漿蛋白表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)患者血漿蛋白中含有C4a血漿蛋白酶(參與炎癥和免疫反應(yīng)，有可能參與DVT過(guò)程)、間α胰蛋白酶抑制劑(與DVT患者炎性狀態(tài)有關(guān))、重鏈H抑制劑和血清淀粉酶A(在有炎癥反應(yīng)時(shí)比正常情況增加1000倍，導(dǎo)致炎性因子腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1和白細(xì)胞介素6增加)。鄧晉京[15]采用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)分析比較大鼠肢體創(chuàng)傷后血栓形成組和無(wú)血栓組血清中蛋白質(zhì)組的變化情況，發(fā)現(xiàn)并鑒定出7個(gè)差異蛋白，即補(bǔ)體因子B、視黃醇結(jié)合蛋白、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶3前體、補(bǔ)體C4、補(bǔ)體因子C3、A鏈大鼠甲狀腺素和α-2U球蛋白前體。姚黎清[16]用雙向凝膠電泳及酶聯(lián)免疫吸附等技術(shù)研究大鼠股靜脈血管壁組織和人血液中的血栓性蛋白,發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6、分析組織蛋白酶D、分析組織蛋白酶G、α2巨球蛋白表達(dá)上調(diào)與DVT形成高度相關(guān)。這些蛋白可能為DVT及其并發(fā)癥的診斷提供一定的依據(jù)。為了研究微粒與血栓疾病的關(guān)系，Ramacciotti等[17]采用同位素絕對(duì)與相對(duì)定量聯(lián)合雙向電泳-液相-質(zhì)譜/質(zhì)譜技術(shù)對(duì)DVT微粒的蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在DVT患者血漿中半乳糖凝集素3結(jié)合蛋白、α2巨球蛋白表達(dá)增加，而包括纖維蛋白原β和γ鏈前體的9種蛋白表達(dá)明顯減少。這些蛋白可能通過(guò)放大炎癥反應(yīng)、微粒生成、抑制纖維蛋白溶解影響血栓形成。Diaz等[18]也發(fā)現(xiàn)，半乳凝集素3結(jié)合蛋白在DVT微粒中高表達(dá)，且P選擇素與DVT的形成密切相關(guān)。Piersma等[19]采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)血小板來(lái)源顆粒及細(xì)胞微粒蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，共鑒定出716種可能參與腫瘤侵襲、血管重構(gòu)等重要過(guò)程的蛋白質(zhì)，如胸苷磷酸化酶和玻連蛋白都是促進(jìn)血管生成的蛋白質(zhì)，血管生成素1能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，為其Tie-2受體的特異性配體?？梢?jiàn)，血小板來(lái)源細(xì)胞微?？赡軈⑴c炎癥過(guò)程、血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化等過(guò)程[20]。

2.2肺栓塞李圣青[21]采用大鼠急性肺栓塞模型,利用雙向電泳技術(shù)串聯(lián)生物質(zhì)譜鑒定技術(shù),尋找肺栓塞前后肺組織和血清中差異表達(dá)蛋白,應(yīng)用圖像分析得到的46個(gè)差異表達(dá)蛋白中有32個(gè)得到鑒定,它們分別與肺組織的血管和氣道平滑肌收縮、肺組織內(nèi)膠原代謝、組織細(xì)胞損傷、毒性物質(zhì)代謝、血壓調(diào)節(jié)、紅細(xì)胞的分化、有氧代謝、維持機(jī)體酸堿平衡密切相關(guān)。這些差異表達(dá)蛋白分子的鑒定為進(jìn)一步明確肺栓塞病理生理變化的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。Watts等[22]應(yīng)用一維電泳和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)肺栓塞后的微粒蛋白進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)纖連蛋白前體、纖維蛋白原α，β、γ血管假性血友病因子和一些巨噬蛋白在肺栓塞后的微粒蛋白中高表達(dá)，觸珠蛋白前體蛋白低表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)更進(jìn)一步說(shuō)明了肺栓塞與微粒蛋白的特征變化關(guān)系。這些特征蛋白也許可以作為肺栓塞的早期標(biāo)志物，也可能成為治療的新靶點(diǎn)。

3蛋白質(zhì)組學(xué)在血栓性疾病的應(yīng)用前景

應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)生理和病理狀態(tài)下血栓性疾病導(dǎo)致的蛋白變化，從細(xì)胞分子水平上闡明血栓性疾病的發(fā)病機(jī)制，為疾病治療和新藥研發(fā)提供新的手段和思路。盡管現(xiàn)在很多血栓性疾病特征性蛋白的發(fā)現(xiàn)，為臨床診斷、治療帶來(lái)了希望，但是，這些特異性蛋白要真正成為血栓性疾病的臨床診斷指標(biāo)還需要經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的臨床驗(yàn)證過(guò)程。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,修飾蛋白質(zhì)組學(xué)、亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)等在血栓性疾病中的廣泛應(yīng)用，血栓性疾病研究的深入和臨床驗(yàn)證工作的進(jìn)一步開展，相信會(huì)有高特異性、高敏感性蛋白應(yīng)用于臨床，為重大疾病發(fā)病機(jī)制的探討、疾病診斷和治療、鑒別分期及藥物治療監(jiān)測(cè)等提供幫助[23]。現(xiàn)在，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的蛋白靶點(diǎn)與單克隆抗體結(jié)合用于治療疾病的研究已經(jīng)展開[24-25]。

4小結(jié)

隨著基因組測(cè)序的完成，蛋白質(zhì)組學(xué)熱浪掀起了后基因組時(shí)代的序幕，也逐漸成為研究者研究各類疾病的關(guān)鍵方法。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步以及在血栓性疾病中的廣泛應(yīng)用，血栓性疾病的發(fā)病機(jī)制將得到更深入的了解，并可能從蛋白質(zhì)水平找到干預(yù)疾病發(fā)生和發(fā)展的新途徑，為臨床早期診斷和用藥提供依據(jù)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用將為血栓性疾病的治療開拓一個(gè)全新的領(lǐng)域。

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Progress of Research into Proteomics of Thrombotic Disease

LIUXiao-xia,KANGYa,LIUCong,NIYan,YUEYong-hua,HAOXu-liang.

(ResearchInstituteofMateriaMedicaFormulas，TraditionalChineseMedicineInstituteofShanxiProvince，Taiyuan030012，China)

Abstract:Thrombotic disease is one of the main causes of human death in the world.It has high mortality due to the limitation of the understanding of the pathogenesis.Proteomic techniques can realize high-throughput contrast of the protein expression spectrum between the healthy,ill and postmedication state.It can screen and identify the markers of thrombotic disease efficiently.Along with the establishment and development of proteomics research methods，proteomic techniques are playing an increasingly important role in the diagnosis of arterial thrombosis，venous thrombosis,mechanism and drug treatment.Here is to make a review of the application of proteomic techniques in the research of thrombotic disease.

Key words:Thrombotic disease; Arterial thrombosis； Vein thrombosis； Proteomics technology

收稿日期：2014-08-15修回日期：2014-10-31編輯：鄭雪

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81274132)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.10.006

中圖分類號(hào):R543

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)10-1743-03