東方百合查爾酮異構(gòu)酶基因LhCHI的克隆及表達(dá)1)

竇曉瑩 郎利新 包放 孔瀅 尚宏忠 白錦榮 王乃彥

(北京市輻射中心，北京，100875) (北京師范大學(xué))

東方百合查爾酮異構(gòu)酶基因LhCHI的克隆及表達(dá)1)

竇曉瑩 郎利新 包放 孔瀅 尚宏忠 白錦榮 王乃彥

(北京市輻射中心，北京，100875) (北京師范大學(xué))

利用RT-PCR結(jié)合RACE的方法從東方百合‘索邦’花被片中克隆了查爾酮異構(gòu)酶(CHI)基因，命名為L(zhǎng)hCHI(GenBank登錄號(hào)為KJ784468)。該基因開放閱讀框702 bp，編碼233個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量25 KD，等電點(diǎn)(pI)為4.7。同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，LhCHI基因編碼的氨基酸序列具有查爾酮異構(gòu)酶典型的催化活性保守位點(diǎn)，與百合科郁金香(Tulipafosteriana)查爾酮異構(gòu)酶序列一致性為83.3%。半定量PCR和熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果表明，LhCHI基因在百合的根、莖、葉片、鱗莖、開放花被片、花藥以及柱頭中均有表達(dá)，花器官中相對(duì)表達(dá)量較高，花發(fā)育后期的柱頭、花柱、花被片等組織中LhCHI基因表達(dá)水平普遍高于花發(fā)育早期。

百合；查爾酮異構(gòu)酶；LhCHI基因

The geneLhCHIencoding chalcone isomerase (CHI) involved into flavonoids synthesis was cloned from inner tepals of Oriental hybrid lily ‘Sorbonne’ (LhCHI, GenBank accession No. KJ784468). The cDNA ofLhCHIwas obtained by RT-PCR and Rapid Amplification of cDNA Ends techniques. The open reading frame ofLhCHIwas 702 bp in length, encoding a protein polypeptide of 233 amino acids with a predicted molecular weight of 25 kD and a theoreticalpI of 4.7. The deduced amino acid sequence ofLhCHIshared 83.3% identity with CHI fromTulipafosteriana, and contained typical conserved catalytic chalcone elements. Quantitative real-time PCR analyzed the expression profiles ofLhCHIin different tissues.LhCHIwas constitutively expressed in root, stem, leaf, bulb, tepal, anther, style and stigma with particularly high expression in flowers. The expression level ofLhCHIin later stage flowers is generally higher than that in the early stage flowers.

百合(Liliumspp.)花色豐富、花型碩大，是重要的商品化切花。在百合育種中，花色改良具有十分重要的意義?；ㄇ嗨剀?anthocyanidin)是大部分植物花器官的主要顯色物質(zhì)，由類黃酮代謝分支途徑合成[1-2]。近年來(lái)，科學(xué)家們通過對(duì)百合類黃酮代謝途徑結(jié)構(gòu)類基因和調(diào)節(jié)類基因的克隆和研究，對(duì)百合花青素合成途徑的分子調(diào)節(jié)機(jī)制已經(jīng)有了一定的了解[3]。在結(jié)構(gòu)類基因中，目前已分離出類黃酮代謝早期關(guān)鍵基因查爾酮合酶(CHS)[4]、黃烷酮-3-羥基化酶(F3H)、類黃酮-3’-羥基化酶(F3’H)、二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)等基因[5-6]。在調(diào)節(jié)類基因中，Nakatsuka et al.[7]從亞洲百合中分離出了basic-helix-loop-helix(bHLH)型轉(zhuǎn)錄因子LhbHLH1和LhbHLH2，發(fā)現(xiàn)LhbHLH2與LhDFR的表達(dá)相關(guān)。R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子LhMYB12的轉(zhuǎn)錄水平影響著花被片中色素物質(zhì)的積累水平[8]，對(duì)花青素合成途徑早期和晚期的相關(guān)結(jié)構(gòu)類基因的轉(zhuǎn)錄有調(diào)節(jié)作用[6]。LhMYB12的等位基因LhMYB12-Lat控制著百合花被片斑點(diǎn)中色素的形成[9]。

查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase，CHI)是類黃酮合成早期關(guān)鍵酶，廣泛分布于高等植物中，和查爾酮合酶(CHS)共同調(diào)控類黃酮代謝途徑[10]。很多植物中的查爾酮異構(gòu)酶都已經(jīng)得到分離，如矮牽牛[11]、玉米[12]、水稻[13]、水母雪蓮[14]、葡萄[15]。發(fā)現(xiàn)查爾酮異構(gòu)酶在果實(shí)發(fā)育、花器官中色素積累、葉片對(duì)抗紫外損傷等方面都發(fā)揮著重要作用[14-19]。目前，百合中類黃酮代謝途徑部分結(jié)構(gòu)類關(guān)鍵基因已得到分離和研究，但還未見百合查爾酮異構(gòu)酶的基因序列及其功能研究的相關(guān)報(bào)道。

東方百合‘索邦’(Oriental hybrid lily ‘Sorbonne’)花被片主體呈粉色，其色素類物質(zhì)主要為花青素苷，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，‘索邦’花器官中的顏色受到類黃酮代謝途徑的調(diào)節(jié)[3，20]。本試驗(yàn)以‘索邦’作為研究材料，利用RACE技術(shù)在其開放的內(nèi)輪花被片中分離了查爾酮異構(gòu)酶編碼區(qū)序列，分析查爾酮異構(gòu)酶基因在‘索邦’各組織中的表達(dá)模式以及在花發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律，以期為開展百合花色改良的分子育種奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為百合花色形成機(jī)理的研究提供參考資料。

1 材料與方法

供試百合品種‘索邦’購(gòu)自荷蘭，栽植于北京市輻射中心種質(zhì)資源圃，分別于2013年5、6、7月份采集不同發(fā)育時(shí)期的根、鱗莖、莖生葉、莖、開放花的內(nèi)外輪花被片、花藥、柱頭等組織，液氮速凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。百合花發(fā)育分為9個(gè)時(shí)期：St.1～5期和花朵開放后的1～4期。St.1～5期基于花被片著色或花形態(tài)變化進(jìn)行劃分，St.1期，完全未著色的花蕾；St.2期，花被片內(nèi)側(cè)開始出現(xiàn)斑點(diǎn)；St.3期，開始著色的花蕾；St.4期，完全著色未開放的花蕾；St.5期，完全開放的花。本研究取百合花發(fā)育的St.1～5期的內(nèi)外輪花被片、柱頭、花柱和花藥，液氮速凍后保存于-80 ℃。以上材料用于基因克隆、RT-PCR和qRT-PCR分析所需的RNA提取，其中qRT-PCR用不同批次材料重復(fù)3次。

RNA提取及cDNA合成：參照文獻(xiàn)[21]中所用的CTAB法提取百合各組織中的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取RNA的完整性，并用NanoDrop微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop Technologies Inc，Delaware，USA)檢測(cè)樣品純度和濃度。

用ReverTra qPCR RT Master Mix gDNA remover(TOYOBO公司)試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增或存于-20 ℃。

LhCHI基因克隆：從GenBank下載已登錄的水稻(Oryzasativa,Os03g0819600)、郁金香(Tulipafosteriana,AGJ50586.1)、矮牽牛(Petunia×hybrida,P11651.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana,AEE79342.1)和葡萄(Vitislabrusca,ACS36662.1)的CHI同源蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物CHI-1和CHI-2(表1)，以反轉(zhuǎn)錄的‘索邦’花被片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。電泳檢測(cè)后回收與預(yù)期片段大小一致的條帶，連接到克隆載體pEASY-Blunt Cloning Vector(TransGen Biontech公司)后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell，TransGen Biontech公司)，經(jīng)氨芐青霉素抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆后交送Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果和SMARTer RACE cDNA Amplication說(shuō)明書中引物設(shè)計(jì)原則在序列上游設(shè)計(jì)特異性引物L(fēng)hCHI-GSP3-1、LhCHI-GSP3-2(表1)；序列下游設(shè)計(jì)特異性引物L(fēng)hCHI-GSP5-1、LhCHI-GSP5-2(表1)。按照SMARTer RACE cDNA Amplication試劑盒操作步驟進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄以及3’、5’末端cDNA的擴(kuò)增，電泳檢測(cè)后回收清晰且特異的條帶，連接pEASY-Blunt載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序片段進(jìn)行拼接，設(shè)計(jì)引物L(fēng)hCHI-F和LhCHI-R(表1)，用KOD-Plus-Neo聚合酶(TOYOBO公司)擴(kuò)增LhCHI基因cDNA全長(zhǎng)，對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測(cè)序。本研究中引物合成及基因測(cè)序均委托Invitrogen公司進(jìn)行。

表1 PCR引物序列

LhCHI基因生物信息學(xué)分析：將獲得的LhCHI基因序列在NCBI的ORF finder預(yù)測(cè)開放閱讀框，并在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast上進(jìn)行序列比對(duì)和同源基因查詢，應(yīng)用DNAMAN 8軟件對(duì)序列一致性進(jìn)行分析，使用MEGA 6.0軟件建立CHI蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹；通過http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/分析蛋白質(zhì)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)；通過http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/分析蛋白跨膜域。

LhCHI基因表達(dá)模式分析：以百合LhActin基因(基因登錄號(hào)：AB438963)作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異性引物L(fēng)hActin-RT1、LhActin-RT2(表1)；根據(jù)LhCHI基因cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物L(fēng)hCHI-RT1、LhCHI-RT2(表1)。半定量RT-PCR以‘索邦’根、莖、葉、鱗莖、花被片、花藥、柱頭RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增體系為10 μL 2×EasyTaq?PCR Super Mix，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，無(wú)菌水8.5 μL；擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)，結(jié)果通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行調(diào)整和檢測(cè)。qRT-PCR以‘索邦’根、莖、葉、鱗莖、花被片、花藥、花柱、柱頭等組織RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，參照KOD SYBR qPCR Mix(TOYOBO公司)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，通過ABI7500熒光定量PCR儀檢測(cè)LhCHI基因在各組織中的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，每輪擴(kuò)增采用不同批次樣品，重復(fù)3次。應(yīng)用Origin 8.0和Microsoft Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和處理，采用2-ΔΔCt法(Forkmann and Dangelmayr,1980)分析基因的相對(duì)表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 LhCHI基因克隆與序列分析

以‘索邦’開放內(nèi)輪花被片RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模版，利用簡(jiǎn)并引物CHI-1和CHI-2擴(kuò)增得到一個(gè)長(zhǎng)度為321 bp的中間片段(圖1A)，之后用RACE法分別獲得447 bp的5’末端以及635 bp的3’末端片段(圖1B)，序列拼接后在NCBI的ORF finder預(yù)測(cè)開放閱讀框，設(shè)計(jì)特異性引物L(fēng)hCHI-F和LhCHI-R擴(kuò)增編碼區(qū)(圖1C)，得到702 bp的ORF序列，推測(cè)其編碼的蛋白由233個(gè)氨基酸殘基組成(圖2)，等電點(diǎn)4.7，相對(duì)分子質(zhì)量25 KD。經(jīng)TMHMM預(yù)測(cè)該蛋白無(wú)跨膜域，SignalP 4.1分析顯示該蛋白無(wú)信號(hào)肽。將該基因命名為L(zhǎng)hCHI(Liliumhybrid chalcone isomerase)，GenBank登錄號(hào)KJ784468。

圖1 LhCHI基因中間序列、3’末端、5’末端及基因編碼區(qū)擴(kuò)增結(jié)果

黑色方框中ATG為起始密碼子,方框中TGA(*)為終止密碼子。

2.2 LhCHI蛋白序列分析

通過DNAMAN軟件將百合LhCHI基因編碼的氨基酸序列與其他植物查爾酮異構(gòu)酶序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)百合LhCHI氨基酸序列與同為百合科的郁金香ThCHI序列一致性最高，達(dá)到83.3%，與水稻、矮牽牛、擬南芥、葡萄中查爾酮異構(gòu)酶序列相似性分別為61.8%、64.1%、63.4%和64.6%(圖3)，它們都具有保守的查爾酮催化結(jié)構(gòu)域。在百合LhCHI氨基酸序列中，屬于查爾酮異構(gòu)酶催化活性保守位點(diǎn)氨基酸分別為Thr48、Tyr106、Asn113和Ser190(圖3“*”號(hào)標(biāo)記的氨基酸)。

進(jìn)行序列比對(duì)的蛋白名稱、所屬物種及基因登陸號(hào)：LhCHI.百合(Lilium‘Sorbonne’)，KJ784468；TfCHI.郁金香(Tulipafosteriana)，AGJ50586.1；OsCHI.水稻(Oryzabrachyantha)，Os03g0819600；PhCHI-A.矮牽牛(Petunia×hybrida)，P11650.1；AtCHI.擬南芥(Arabidopsisthalianna)，AT3G55120；VvCHI1葡萄(Vitisvinifera)，A5ANT9.1。帶*的氨基酸代表位于活性中心的保守氨基酸位點(diǎn)。

圖3 LhCHI與其他植物CHI氨基酸序列比對(duì)圖

將LhCHI與NCBI檢索到的其他物種CHI蛋白進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明(圖4)，LhCHI與郁金香TfCHI遺傳距離最近，其次為美洲油棕及大花美人蕉。由系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，單雙子葉植物中的CHI蛋白在進(jìn)化上分成了兩個(gè)并列的分支，百合中的LhCHI蛋白與單子葉植物中的CHI蛋白親緣關(guān)系較近。

2.3 LhCHI基因表達(dá)模式分析

通過半定量RT-PCR分析LhCHI基因在不同組織的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示，LhCHI基因在百合根、莖、莖生葉、鱗莖、開放花被片、花藥、花柱、柱頭中均有表達(dá)，但表達(dá)程度不同，在葉片、開放花被片、花柱及柱頭中較高，實(shí)時(shí)定量qRT-PCR分析結(jié)果與RT-PCR結(jié)果基本一致，各組織對(duì)應(yīng)的相對(duì)表達(dá)量數(shù)值分別為根中5.31、莖中1.00、葉片中54.7、鱗莖中3.91、開放的花被片中263.1、花藥中4.56、花柱中146.02、柱頭中186.97。說(shuō)明LhCHI基因在開放花被片中表達(dá)水平最高，其次是柱頭、花柱、葉片、根、花藥、鱗莖和莖。

標(biāo)尺代表遺傳距離；各節(jié)點(diǎn)處數(shù)字代表從1000次重復(fù)計(jì)算得到的bootstrap值。

圖5 RT-PCR分析LhCHI基因在‘索邦’不同組織中的表達(dá)模式

‘索邦’花發(fā)育的St.1～5期，內(nèi)外花被片顏色、花藥顏色以及柱頭顏色都逐漸加深，說(shuō)明色素類物質(zhì)積累也在逐漸增多，文中通過qRT-PCR分析了LhCHI基因在花發(fā)育不同階段和組織中的相對(duì)表達(dá)量。在‘索邦’花蕾的內(nèi)輪花被片和外輪花被片中，LhCHI基因表達(dá)量在St.2期開始顯著升高，在St.4期達(dá)到頂峰，St.5期略有下降，在St.2～5期外輪花被片LhCHI基因表達(dá)量略高于內(nèi)輪花被片(表2)；在花柱中，St.1～3期LhCHI基因的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，St.4期開始升高，其相對(duì)表達(dá)量約為前3期平均值的4倍，到St.5期達(dá)到最高；在柱頭中，LhCHI基因表達(dá)量從St.3期開始上升，到St.5期達(dá)到最高；在花藥中，St.1～5期LhCHI基因的表達(dá)量一直處于較低的水平，并沒有隨著花藥成熟出現(xiàn)明顯變化(表2)。

由此可見，LhCHI基因主要在百合花器官發(fā)育后期的花被片、花柱、柱頭等組織中表達(dá)，并受到生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的影響。

3 結(jié)束語(yǔ)

CHI是類黃酮合成途徑早期的關(guān)鍵酶，根據(jù)催化反應(yīng)底物的不同，將查爾酮異構(gòu)酶分成兩類，Type I和Type II型[22]。Type I型查爾酮異構(gòu)酶普遍存在于大部分植物中，而Type II型查爾酮異構(gòu)酶主要存在于豆科植物中，這兩類CHI均具有保守的查爾酮催化結(jié)構(gòu)域[10]。通過對(duì)苜蓿中II型CHI蛋白結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，在它的活性位點(diǎn)上有4個(gè)非常重要的保守氨基酸殘基(Thr48、Tyr106、Asn113、Thr190)[23-24]。本研究通過分析LhCHI的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，LhCHI具有與苜蓿II型CHI蛋白同樣的Thr48、Tyr106、Asn113保守氨基酸殘基，而Thr190在豆科植物中較為保守，在百合、郁金香、水稻、擬南芥和葡萄中該位點(diǎn)變?yōu)镾er190。

表2 LhCHI基因在St.1～5期內(nèi)輪花被片、外輪花被片、花藥、花柱及柱頭中的相對(duì)表達(dá)量

CHI基因的cDNA序列首次通過抗血清方法從菜豆中克隆[10，25]，之后通過同源克隆的方法在多種植物中分離得到了CHI基因。本試驗(yàn)從百合中獲得LhCHI基因，推測(cè)的LhCHI蛋白與其他植物的CHI高度一致，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，百合LhCHI與單子葉的郁金香、美洲油棕、玉米、水仙等聚為一類，而矮牽牛、煙草、葡萄等雙子葉植物CHI蛋白聚為一類。這表明單子葉植物和雙子葉植物CHI蛋白聚為兩大類，其中LhCHI與單子葉植物親緣關(guān)系更近，CHI在單、雙子葉之間存在明顯區(qū)別，因此，推測(cè)CHI基因可能發(fā)生在單子葉與雙子葉植物的進(jìn)化之后。

文中通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)百合LhCHI基因在花被片、花柱、柱頭等組織中表達(dá)水平明顯高于其他組織，在花蕾未著色的St.1期已有表達(dá)，在花即將開放或完全開放時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。在花被片中，LhCHI基因的表達(dá)水平?jīng)]有在完全開放的St.5期達(dá)到最高，而是在開放前的St.4期達(dá)到最高，推測(cè)原因可能由于LhCHI基因位于類黃酮代謝早期，在St.4期時(shí)，LhCHI基因轉(zhuǎn)錄水平的積累已足夠推動(dòng)下游反應(yīng)進(jìn)行，故到St.5期時(shí)轉(zhuǎn)錄水平開始略有下降，但并不影響花青素合成下游基因的表達(dá)，因此，開放花瓣花色素物質(zhì)的積累并沒有隨著LhCHI基因表達(dá)水平的下降而減少。已有研究表明，CHI基因的表達(dá)水平與植物花色密切相關(guān)，如矮牽牛中CHI-A表達(dá)水平下降會(huì)使花粉由黃色變?yōu)榫G色[26]；在煙草中抑制CHI基因的表達(dá)會(huì)使花粉和花瓣顏色變淡[18]，CHI基因與植物花色的關(guān)系可能是LhCHI基因在花器官中高表達(dá)的原因。但在St.1～5期的花藥中LhCHI基因表達(dá)量較低，說(shuō)明在百合中該基因可能并不主要在花藥中發(fā)揮功能。在葉片中檢測(cè)到LhCHI基因的表達(dá)水平高于根、莖等其他營(yíng)養(yǎng)組織，有研究證明，日光和紫外線UV-A會(huì)誘導(dǎo)CHI基因的表達(dá)，百合LhCHI基因在葉片中的高表達(dá)可能是由于葉片需要合成類黃酮以抵抗紫外線輻射[10]。

花色是影響百合觀賞性狀的重要因素，傳統(tǒng)雜交育種培育新花色存在著周期長(zhǎng)和遠(yuǎn)緣雜交不親和等弊端，基因工程技術(shù)為培育新花色品種提供了新的途徑。通過基因工程改變CHI基因的表達(dá)以改變植物類黃酮物質(zhì)積累的研究已有大量報(bào)道，抑制康乃馨和仙客來(lái)中CHI基因的表達(dá)會(huì)使花瓣中積累大量的查爾酮，花朵變?yōu)辄S色[27-28]，將洋蔥中CHI基因失活，植株中高水平積累查爾酮，導(dǎo)致出現(xiàn)黃色球莖[10，29]。本試驗(yàn)克隆了LhCHI基因并研究了其表達(dá)模式，為繼續(xù)通過轉(zhuǎn)基因等手段研究該基因在百合花色形成過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and Expression Analysis of Chalcone Isomerase GeneLhCHIin Oriental Hybrid Lily (Liliumspp.)//

Dou Xiaoying, Lang Lixin, Bao Fang, Kong Ying, Shang Hongzhong, Bai Jinrong

(Beijing Radiation Center, Beijing 100875, P. R. China); Wang Naiyan(Beijing Normal University)//Journal of Northeast Forestry University，2015,43(9)：6-11,17.

Lilium; Chalcone isomerase;LhCHI

竇曉瑩，女，1983年4月生，北京市輻射中心，助理研究員。E-mail:douxiaoying@126.com。

白錦榮，北京市輻射中心，副研究員。E-mail:bjr301@126.com。

2015年4月22日。

Q946.2；Q949.71+8.23

1)“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題(2013BAD01B0706)、北京市科學(xué)技術(shù)研究院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃(IG201404N)、北京市科學(xué)技術(shù)研究院青年骨干計(jì)劃(201524)。

責(zé)任編輯：任 俐。