懸浮紅細胞對異體T淋巴細胞增殖的影響及機制

趙學濤，楊從容，任曉亮，李 明，解曉元，巨紅妹

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

懸浮紅細胞對異體T淋巴細胞增殖的影響及機制

趙學濤，楊從容，任曉亮，李 明，解曉元，巨紅妹

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

目的體外觀察懸浮紅細胞對異體T淋巴細胞增殖的影響并探討其可能機制。方法采用Ficoll低密度離心法和免疫磁珠法從人外周血中分離純化出CD3+T淋巴細胞，給予CD3/CD28抗體共刺激，并分別與異體非去白懸浮紅細胞或去白懸浮紅細胞混合培養(yǎng)72h。采用H3-胸腺嘧啶核苷摻入法檢測各組T淋巴細胞增殖的情況。采用流式細胞儀檢測各組培養(yǎng)體系中CD4+/CD8+及CD4+CD25+/CD4+細胞亞群比例。結果與陰性對照組(細胞培養(yǎng)液組)對比，非去白懸浮紅細胞組和去白懸浮紅細胞組T淋巴細胞增殖明顯受到抑制，CD4+/CD8+細胞亞群比例下降(P<0.01)，而CD4+CD25+/CD4+細胞亞群比例明顯增加(P<0.01)。與去白懸浮紅細胞相比，非去白懸浮紅細胞的作用更明顯(P<0.05)。結論懸浮紅細胞可能通過上調CD4+CD25+調節(jié)性T細胞比例抑制異體T淋巴細胞增殖，而這種作用可能主要取決于懸浮紅細胞內殘留的白細胞。

懸浮紅細胞；異體T淋巴細胞；CD4+/CD8+細胞亞群；CD4+CD25+Treg

臨床研究證實，同種異體血輸注(allogenic blood transfusion，ABT)可以誘導受血者產生免疫抑制，并由此可增加術后感染率和惡性腫瘤的復發(fā)率[1-2]。目前，這種輸血相關免疫抑制的確切機制仍不清楚。CD4+CD25+T細胞是最近才被人們認識的一類免疫調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)，高表達CD25和CD4，參與機體的免疫抑制和免疫無能。成分血中何種因素引起了免疫抑制，以及這種免疫抑制機制是否與CD4+CD25+Treg有關目前國內外尚未見報道。為此，本研究以懸浮紅細胞為研究對象，探討其中哪種成分可影響異體T淋巴細胞的增殖，并從CD4+CD25+Treg角度進一步分析其可能的機制。

1 實驗資料

1.1試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；人淋巴細胞分離液購自挪威AXIS SHIELD公司；CD3+T細胞磁珠分選試劑盒購自Miltenyi Biotec公司；抗CD3單克隆抗體、抗CD28單克隆抗體購自Becton Dickinson公司；抗CD4-FITC、抗CD8-PE和抗CD25-PE熒光抗體均購自eBioscience公司。

1.2血液樣品 外周全血取自健康自愿獻血者。去白懸浮紅細胞和非去白懸浮紅細胞由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院輸血科提供。

1.3方法

1.3.1外周血單個核細胞(PBMC)的分離 取無菌肝素鈉抗凝全血，用生理鹽水將其等倍稀釋，稀釋后的血標本緩慢加入人淋巴細胞分離液液面上，比例為1∶1，4℃下2000r/min離心15min，輕輕吸取第2層環(huán)狀乳白色單個核細胞層，以PBS液洗滌2次，所得白色細胞沉淀即為PBMC，計數細胞后備用。

1.3.2磁珠分離純化T淋巴細胞 取1×107個PBMC，用PBS調整細胞溶液體積至50μL；加入CD3抗體磁珠溶液10μL，混勻，4～8℃孵育20min；加入150μL PBS洗滌細胞，4℃下3000r/min離心10min；收集細胞，重懸細胞并調整細胞懸液體積至500μL；將分選柱固定于磁柱上，用500μL PBS預濕分選柱；將結合磁珠的細胞懸液加入分選柱內，洗滌3次，每次1000μL PBS；將分選柱從磁柱分開，加入1000μL PBS，收集流出液，4℃下3000r/min離心10min，所得沉淀物即為富集的T淋巴細胞，以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸，計數備用。

1.3.3混合培養(yǎng) 取上述T淋巴細胞懸液加入到含有CD3抗體(2μg/mL)和CD28抗體(5μg/mL)包被的96孔板中[1×105個/(100μL·孔)]，然后分為3組：A組于上述T細胞懸液中加入細胞培養(yǎng)液100μL/孔作為陰性對照，B組加入非去白懸浮紅細胞2×105個/(100μL·孔)，C組加入去白懸浮紅細胞2×105個/(100μL·孔)，每組終體積200μL，設3個復孔。于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4T淋巴細胞增殖實驗 采用H3-胸腺嘧啶核苷摻入(3H-TdR)法檢測T淋巴細胞增殖情況。將上述各組細胞混合培養(yǎng)72h，在終止培養(yǎng)前16h每孔加入3H-TdR 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)16h，用多頭細胞收集器將每孔培養(yǎng)物分別吸收于直徑24mm的玻璃纖維濾紙上，抽氣過濾并用蒸餾水充分洗滌。將濾紙片放在80℃烘干約1h，然后將濾紙片浸入加了10mL脂溶性閃爍液的閃爍杯中，置于β-液體閃爍記數儀中測定每個樣品的每分鐘脈沖數(cpm值)。

1.3.5CD4+/CD8+細胞亞群比例檢測 混合培養(yǎng)72h后，收集各組細胞，用PBS洗滌2次，調整每管細胞數為2×105個，分別加入抗CD4-PE和抗CD8-FITC熒光抗體及相應同型對照，4℃避光孵育30min，用PBS洗滌3次，將細胞重懸至200μL，采用BD LSRⅡ流式細胞儀檢測。

1.3.6CD4+CD25+/CD4+細胞亞群比例檢測 混合培養(yǎng)72h后，收集各組細胞，調整每管細胞數為2×105個，分別加入抗小鼠CD25+-FITC熒光抗體、抗小鼠CD4+-PE熒光抗體及相應同型對照，冰上孵育30min，加入2% FBS-PBS液洗滌去除未結合抗體，1300r/min離心6min，洗2次，將細胞重懸至200μL，采用BD LSRⅡ流式細胞儀檢測。

2 結 果

2.1各組異體T淋巴細胞增殖情況 3H-TdR摻入實驗顯示，A、B、C組T淋巴細胞數分別為2718±63.20，1584±46.88，1878±82.35，與A組相比，B組和C組均顯著地抑制了CD3/CD28刺激引起的T淋巴細胞增殖(P均<0.01)，且B組較C組抑制作用更明顯(P<0.05)。

2.2各組CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比例比較 流式細胞分析結果顯示：與A組相比，B組和C組CD4+及CD4+/CD8+比例均明顯降低(P均<0.01)，且B組低于C組(P<0.05)。見表1。

表1 各組CD4+/CD8+T細胞亞群情況比較

注：①與A組比較，P<0.01；②與C組比較，P<0.05。

2.3各組CD4+CD25+/CD4+比例比較 流式細胞分析結果顯示：B組和C組CD4+CD25/CD4+比例均高于A組(P均<0.01)，B組高于C組(P<0.05)。見圖1～3。

圖1 A組CD4+CD25+/CD4+流式細胞圖

圖2 B組CD4+CD25+/CD4+流式細胞圖

圖3 C組CD4+CD25+/CD4+流式細胞圖

3 討 論

同種異體輸血發(fā)揮臨床治療作用的同時，也會并發(fā)免疫相關的不良反應，如惡性腫瘤復發(fā)率增加、術后感染率上升、慢性病毒感染急性發(fā)作等，這些輸血引起的一系列涉及免疫調節(jié)的反應稱為輸血相關性免疫調節(jié)(transfusion-associated immunomodulation,TRIM)[3]。目前，引起TRIM的具體機制仍不明確。Vamvalas等[4]認為白細胞(WBC)、血小板分泌并隨著儲存時間延長而蓄積的可溶性生物反應遞質可能是引起TRIM的機制。Dzik等[5]也指出TRIM非特異性效應的產生可能是血液制品中的WBC引起的。如果TRIM效應確實由WBC源性可溶性分子介導產生，那么實行血制品儲存前WBC濾過技術應該可以消除其相關的有害臨床效應，因為在可溶性分子釋放到血制品之前就已將WBC濾除。為此本研究通過體外實驗比較了去白懸浮紅細胞和非去白懸浮紅細胞與異體T淋巴細胞共培養(yǎng)后對T細胞增殖及CD4+/CD8+T細胞亞群比例的影響，結果顯示：懸浮紅細胞可抑制異體T淋巴細胞的增殖，并降低CD4+/CD8+T淋巴細胞比例，而非去白懸浮紅細胞組的作用更明顯。CD4+/CD8+比值為一重要的免疫指標，正常情況下相對恒定，此比值顯著降低常視為疾病嚴重和預后不良。本研究結果提示去除懸浮紅細胞內殘留的WBC可能會減輕但無法消除對異體T淋巴細胞的免疫抑制作用；同時也提示，紅細胞懸液中除了WBC還有其他因素引起TRIM。國外早期一些臨床隨機對照實驗顯示，輸注未去WBC的紅細胞懸液會使術后感染率升高，而在歐美國家在臨床上廣泛實行去WBC的紅細胞懸液輸注政策后，研究者們將大量去WBC和未去WBC的病例做了回顧性的調查，分析結果顯示除心臟手術外，去WBC的血液制品并未降低術后感染率和術后病死率[6-8]，與本研究結果不符，分析原因可能是懸浮紅細胞內殘留的WBC較少，輸入體內后被稀釋，對異體T淋巴細胞的免疫抑制作用不占主導地位，因此去白血液制品對術后感染率和術后病死率影響不明顯，在體內環(huán)境中對異體的免疫抑制起主導作用的可能是血液制品中其他因素。既往研究發(fā)現，在儲存期間紅細胞本身的生化功能及形態(tài)也會發(fā)生變化，細胞形態(tài)由圓盤狀向球狀改變，紅細胞懸液中的ATP、2，3-DPG、磷脂均會減少，細胞浮密度、滲透溶血的易感性等會增加[9]，這些變化都有可能是引起TRIM的原因。這也是本課題組下一步研究的重點。

異體血輸注是通過何種途徑引起免疫抑制目前尚不明確，CD4+CD25+Treg細胞具有抑制T細胞增殖活化的作用早已得到公認，于是本研究進一步檢測了CD4+T細胞中的調節(jié)性細胞亞群CD4+CD25+細胞是否成比例地增加。結果顯示：與陰性對照組相比，兩懸浮紅細胞組CD4+CD25+Treg細胞比例明顯增加，而與去白懸浮紅細胞相比，非去白懸浮紅細胞的這種作用更明顯一些。提示懸浮紅細胞可能通過上調CD4+CD25+Treg細胞比例起到免疫抑制作用，在體外環(huán)境下這種作用主要依賴于懸浮紅細胞內殘留的WBC。

綜上所述，去白懸浮紅細胞和非去白懸浮紅細胞均可抑制異體T細胞增殖，而在體外環(huán)境下非去白懸浮紅細胞的抑制作用更加明顯，并且首次證實這種抑制作用與上調CD4+CD25+Treg細胞表達有關。實驗同時提示除WBC外，懸浮紅細胞中還存在其他因素介導T淋巴細胞免疫抑制，在臨床用血中，去白懸浮紅細胞輸注可能并不能避免TRIM的發(fā)生，但具體是何種成分起作用還有待進一步研究。

[1] Bilgin YM,van de Watering LM,Versteegh MI,et al.Effects of allogeneic leukocytes in blood transfusions during cardiac surgery on inflammatory mediators and postoperative complications[J].Crit Care Med,2010,38(2):546-552

[2] Linder BJ,Frank I,Cheville JC,et al.The impact of perioperative blood transfusion on cancer recurrence and survival following radical cystectomy[J].Eur Urol,2013,63(5):839-845

[3] Vamvakas EC,Blajchman MA.Deleterious clinical effects of transfusion-associated immunomodulation:fact or fiction?[J].Blood,2001,97(5):1180-1195

[4] Vamvakas EC.Possible mechanisms of allogeneic blood transfusion-associated postoperative infection[J].Transfus Med Rev,2002,16(2):144-160

[5] Dzik WH.Apoptosis,TGF beta and transfusion-related immunosuppression:Biologic versus clinical effects[J].Transfus Apher Sci,2003,29(2):127-129

[6] Titlestad IL,Ebbesen LS,Ainsworth AP,et al.Leukocyte-depletion of blood components does not significantly reduce the risk of infectious complications.Results of a double-blinded, randomized study[J].Int J Colorectal Dis,2001,16(3):147-153

[7] Garancini M,Degrate L,Carpinelli MR,et al.Impact of pre-storage and bedside filtered leukocyte-depleted blood transfusions on infective morbidity after colorectal resection:a single-center analysis of 437patients[J].Surg Infect (Larchmt),2013,14(4):374-380

[8] Rahbari NN,Holoch J,Michalski I,et al.Leucocyte-depleted blood transfusion is an independent predictor of surgical morbidity in patients undergoing elective colon cancer surgery-a single-center analysis of 531patients[J].Ann Surg Oncol,2011,18(5):1404-1411

[9] 尹建平，張慶武，王曦,等.貯存過期紅細胞的生化功能及形態(tài)的恢復研究[J].中國輸血雜志,2005,18(2):106-109

Effect of red blood suspension on proliferation of allogene T lymphocytes and it’s mechanisms

ZHAO Xuetao, YANG Congrong, REN Xiaoliang, LI Ming, XIE Xiaoyuan, JU Hongmei

(The Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011,Hebei,China)

Objective It is to explore the effect of red blood suspension on proliferation of allogene T lymphocytes in vitro and to explore its possible mechanisms.Methods CD3+T cells from human peripheral blood were isolated and purified by Ficoll density gradient centrifugation combined with adherence MACS selection.Purifed human T cells were stimulated with anti-CD3/anti-CD28and then exposed to allogene leukocyte-containing red blood suspension or leukocyte-depleted red blood suspension for 72h.T cell proliferation was determined by 3H-thymidine.The ratios of CD4+/CD8+and CD4+CD25+/CD4+subgroup from different co-culture systems were detected by flow cytometry.Results Compared with that of negative group (culture media), the proliferations of allogene T lymphocytes were greatly suppressed，the ratio of CD4+/CD8+subgroup decreased, but the ratio of CD4+CD25+/CD4+subgroup increased in leukocyte-containing group and leukocyte-depleted group (P<0.01), while the influences were more obvious in leukocyte-containing group (P<0.05).Conclusion Red blood suspension could suppress significantly allogene T cell proliferation by up regulation of CD4+CD25+regulatory T (Treg) cells.This regulation, to a large extent, depending on the the remaining white blood cells in red blood suspension.

red blood suspension; allogene T lymphocytes; CD4+/CD8+subgroup; CD4+CD25+Treg cells

趙學濤，男，主管技師，博士，從事輸血與腫瘤免疫研究工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.19.006

R0457.13

A

1008-8849(2015)19-2071-03

2015-01-20