情志護(hù)理聯(lián)合補(bǔ)腎中藥對(duì)SD大鼠PTSD胎損的母子兩代行為遺傳學(xué)研究

張 輝，張先庚，曹 冰，劉祥敏，龍芋君，曹 俊，謝汶倚，劉 爽

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

論 著

情志護(hù)理聯(lián)合補(bǔ)腎中藥對(duì)SD大鼠PTSD胎損的母子兩代行為遺傳學(xué)研究

張 輝，張先庚，曹 冰，劉祥敏，龍芋君，曹 俊，謝汶倚，劉 爽

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

目的 研究中醫(yī)調(diào)護(hù)干預(yù)創(chuàng)傷后壓力心理障礙癥(PTSD)孕鼠對(duì)子鼠生長(zhǎng)發(fā)育、行為的宏觀表征影響。方法 按照隨機(jī)數(shù)字表法將12只受孕SD母鼠分為空白對(duì)照組、PTSD組、情志中藥組。采用單一長(zhǎng)期應(yīng)激(SPS)法造成PTSD模型；情志中藥組造模后給予金匱腎氣丸混合飼料補(bǔ)腎，同時(shí)放在優(yōu)裕環(huán)境鼠籠構(gòu)造情志護(hù)理；重復(fù)觀測(cè)各組存活子鼠的體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、曠場(chǎng)試驗(yàn)(OFT)表現(xiàn)及糖水消耗情況。結(jié)果 PTSD組子鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)最慢，而中藥情志組體質(zhì)量增長(zhǎng)較快，且優(yōu)于空白對(duì)照組(P<0.05)。PTSD組曠場(chǎng)試驗(yàn)得分低于空白對(duì)照組和情志中藥組(P均<0.05), 而空白對(duì)照組與中藥情志組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PTSD組糖水消耗量小于空白對(duì)照組和情志中藥組(P均<0.05), 而空白對(duì)照組與中藥情志組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 母鼠孕期PTSD可以遺傳到子代,延緩子代的生長(zhǎng)發(fā)育；金匱腎氣丸聯(lián)合優(yōu)裕環(huán)境情志護(hù)理可糾正母鼠PTSD導(dǎo)致的子鼠發(fā)育遲緩,且可促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育,為進(jìn)一步揭示PTSD胎損的遺傳和調(diào)護(hù)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

PTSD；SPS；胎損；情志護(hù)理；補(bǔ)腎中藥；金匱腎氣丸

創(chuàng)傷后壓力心理障礙癥(post-traumatic stress disorder，PTSD)指人在遭遇或?qū)怪卮髩毫?，其心理狀態(tài)產(chǎn)生失調(diào)之后遺癥，這些壓力包括生命遭到威脅、嚴(yán)重物理性傷害、身體或心靈上的脅迫[1]。PTSD作為一種精神創(chuàng)傷性事件后高發(fā)的、后果嚴(yán)重的精神疾病,在戰(zhàn)爭(zhēng)、社會(huì)暴力事件、重大交通事故和自然災(zāi)害等創(chuàng)傷意外事件中有著很高的發(fā)生率[2]。PTSD患者多伴有失業(yè)、家庭不穩(wěn)定、健康等問(wèn)題，具有嚴(yán)重的社會(huì)危害性，已引起了全社會(huì)的關(guān)注，而防治PTSD消耗著巨大的醫(yī)療資源和社會(huì)資源，成為一個(gè)迫切需要解決的科學(xué)與社會(huì)問(wèn)題。中醫(yī)調(diào)護(hù)方法已經(jīng)廣泛運(yùn)用于PTSD的治療，如魏品康等[3]研究顯示中藥白龍解郁顆?？筛纳?.12地震后救援軍人PTSD引起的軀體障礙；陳赟等[4]臨床研究顯示中藥清心解郁湯聯(lián)合西藥、心理療法等綜合療法治療創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙療效確切。本課題選擇具有鮮明中醫(yī)特色的中醫(yī)調(diào)護(hù)措施(情志、中藥)設(shè)計(jì)了隨機(jī)對(duì)照研究，以期獲得中醫(yī)調(diào)護(hù)改善PTSD胎損的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)，繼承和發(fā)展中醫(yī)藥的經(jīng)典理論和豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取初次受孕、體質(zhì)量224.5～260.5g的SD雌性大鼠12只，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(川)2008-24。

1.2 儀器 標(biāo)準(zhǔn)大鼠盒2套(60cm×60cm×60cm)，為塑料邊框。盒底和盒蓋為不銹鋼絲網(wǎng)，盒下有塑料托盤(pán)；優(yōu)裕環(huán)境情志護(hù)理鼠籠1套(100cm×100cm×100cm)，配有有洞假房、滑繩、云梯、供孕鼠啃咬的木頭等，電子天平1臺(tái)，直尺1把。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將12只受孕母鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、PTSD組以及中藥情志組，每組4只，各組孕鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.2 動(dòng)物造模及干預(yù) 3組孕鼠放進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中飼養(yǎng)，每天給予足夠的飼料和飲水。PTSD組及中藥情志組從孕7d開(kāi)始，采用通行的單一長(zhǎng)期應(yīng)激(SPS)法進(jìn)行PTSD造模，即大鼠禁錮2h后,立即強(qiáng)迫游泳20min(水深40cm，水溫25℃)，反復(fù)進(jìn)行。SPS大鼠模型能夠很好地模擬人類PTSD行為學(xué)與病理生理學(xué)改變，為國(guó)際公認(rèn)的PTSD大鼠造模方式。造模成功后中藥情志組孕鼠給予混有金匱腎氣丸(北京同仁堂，研粉，0.5～0.6g/d)的飼料[5]，放置于寬敞(100cm×100cm×100cm)的鼠籠中飼養(yǎng)，籠中擺放大鼠喜居的窩穴、通路、洞穴、云梯、滑繩、秋千、滾球、線團(tuán)、錄音機(jī)和供孕鼠啃咬的木頭。每天給予足夠的飼料和水分以及老鼠喜好的花生和葵瓜籽，每天8：00和18：00播放胎教音樂(lè)各1h，鼠籠周保持環(huán)境溫度18～20℃，空氣濕度55%～75%，直至生產(chǎn)。保持空氣流通，自然光線照明，每天12h∶12h進(jìn)行明暗交替，晝夜循環(huán)[6]。PTSD組每天給予足夠的飼料和飲水。

1.4 宏觀表征與行為學(xué)觀察

1.4.1 身長(zhǎng)、體質(zhì)量、尾長(zhǎng)的測(cè)量 子代大鼠出生后第1，5，10，15，20，25，30天分別測(cè)量子鼠身長(zhǎng)、體質(zhì)量和尾長(zhǎng)。用電子天平稱取體質(zhì)量，以g計(jì)數(shù)。將子鼠平放桌上，背面向上，使身體伸直，用尺子量取鼠頭部至鼠尾根部的長(zhǎng)度為大鼠的身長(zhǎng)，長(zhǎng)度單位以cm計(jì)算。使子鼠尾部伸直，貼于桌面，用直尺量取鼠尾根部至鼠尾尖部的長(zhǎng)度，單位以cm計(jì)算。

1.4.2 曠場(chǎng)測(cè)試 空格測(cè)試指在120cm×120cm木板上畫(huà)出正方形(15cm×15cm)，將10d、20d、30d齡的子鼠分別逐個(gè)置于紙板中央，用秒表計(jì)算2min內(nèi)爬行的格數(shù)；以4只腳進(jìn)入一格計(jì)算1分。

1.4.3 糖水試驗(yàn) 取30d齡子鼠，將子鼠禁水24h，然后給予1%蔗糖水溶液，同時(shí)禁食，24h后稱量蔗糖水瓶的質(zhì)量，計(jì)算子鼠在24h內(nèi)蔗糖水的消耗量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布資料采用單因素方差分析和多因素方差分析，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用一般線性模型(GLM)中的重復(fù)度量模塊與廣義線性模型(GEE)中的廣義估計(jì)方程模塊分析。

2 結(jié) 果

2.13組不同測(cè)量時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)比較 在對(duì)子鼠體質(zhì)量、身長(zhǎng)和尾長(zhǎng)測(cè)量數(shù)據(jù)中Mauchly的球形度檢驗(yàn)W值分別為0.002，0.143，0.07，P均<0.05,資料不滿足Sphericity假設(shè)，需要自由度進(jìn)行校正，且選取Greenhouse-Geisser2校正[7]，見(jiàn)表1。天數(shù)(體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng))以及天數(shù)×體質(zhì)量、天數(shù)×身長(zhǎng)、天數(shù)×尾長(zhǎng)的P均<0.05，說(shuō)明時(shí)間因素以及時(shí)間因素和分組的交互作用具有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)隨時(shí)間變化的趨勢(shì)隨分組不同而不同，見(jiàn)表2。PTSD組體質(zhì)量增長(zhǎng)最慢，而中藥情志組體質(zhì)量增長(zhǎng)較快，且優(yōu)于空白對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。PTSD組身長(zhǎng)與尾長(zhǎng)均增長(zhǎng)最慢，而中藥情志組身長(zhǎng)與尾長(zhǎng)均增長(zhǎng)較快，且優(yōu)于空白對(duì)照組(P均<0.05)，見(jiàn)圖2及圖3。

2.2 曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)廣義線性模型中的廣義估計(jì)方程分析可知重復(fù)觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)綜合分析[8],空白對(duì)照組及中藥情志組的曠場(chǎng)試驗(yàn)得分均優(yōu)于PTSD組，中藥情志組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Wald2=2.182,df=1,P=0.140>0.05)。3組曠場(chǎng)試驗(yàn)得分比較見(jiàn)圖4及表3。

表1 體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)Mauchly的球形度檢驗(yàn)

2.3 糖水試驗(yàn) PTSD組糖水消耗量為(20.7535±15.7973)g，空白對(duì)照組為(32.3816±11.2534)g，中藥情志組為(28.6556±10.4965)g。經(jīng)ANOVA分析可知,空白對(duì)照組糖水消耗量多于PTSD組(P=0.043<0.05);中藥情志組糖水消耗量亦多于PTSD組(P=0.035<0.05);而空白對(duì)照組與中藥情志組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.497>0.05)。

表2 主體內(nèi)效應(yīng)的檢驗(yàn)

圖1 3組不同時(shí)間觀測(cè)點(diǎn)體質(zhì)量增長(zhǎng)圖

圖2 3組不同時(shí)間觀測(cè)點(diǎn)身長(zhǎng)增長(zhǎng)圖

圖3 3組不同時(shí)間觀測(cè)點(diǎn)尾長(zhǎng)增長(zhǎng)圖

圖4 3組曠場(chǎng)試驗(yàn)得分比較

表3 曠場(chǎng)試驗(yàn)得分廣義估計(jì)方程分析

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為胎兒與孕母有著直接和密切的關(guān)系，“母病及子”，故母親的任何有關(guān)氣血變化都會(huì)波及胎兒的正常發(fā)育，導(dǎo)致胎兒損傷如出生后疾病、出生缺陷，甚至墮胎等[9]。中醫(yī)“母病及子”觀點(diǎn)表明母子作為一個(gè)整體，氣血息息相通，精神因素對(duì)母體的作用會(huì)間接地影響到胎兒。當(dāng)前PTSD治療主要以西藥中的精神類藥物為主，但均有不同程度的不良反應(yīng)，尤其對(duì)PTSD孕婦引起的不良反應(yīng)就更明顯。中醫(yī)特色調(diào)護(hù)神志疾病已有悠久歷史，療效確切,價(jià)格低廉，且無(wú)毒副作用。中醫(yī)認(rèn)為PTSD的發(fā)生是內(nèi)外因共同作用的結(jié)果，外因主要為來(lái)自外界的災(zāi)難性的刺激,大驚大恐比如地震；內(nèi)因主要是指素體稟賦不足所導(dǎo)致的臟腑功能失調(diào)，主要病機(jī)為肝氣郁結(jié)與腎陽(yáng)不足,治療上應(yīng)內(nèi)外兼治[3，10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PTSD組的體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)增加最為緩慢，說(shuō)明母鼠孕期PTSD干預(yù)可阻礙子鼠生長(zhǎng)發(fā)育，而補(bǔ)腎中藥聯(lián)合情志護(hù)理可促進(jìn)體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)的發(fā)育。曠場(chǎng)試驗(yàn)是公認(rèn)的反映子鼠行為癥狀的基本指標(biāo)，其得分大小可反映大鼠的探索能力，故而這些指標(biāo)一起則可以用來(lái)評(píng)價(jià)子鼠生長(zhǎng)發(fā)育的情況[11]。本研究發(fā)現(xiàn)SPS法母鼠PTSD造模后子鼠出生第10，20，30天連續(xù)曠場(chǎng)試驗(yàn)得分低于空白對(duì)照組，說(shuō)明母鼠PTSD可導(dǎo)致子鼠的行為表現(xiàn)變差，降低子鼠的活動(dòng)能力。該結(jié)果正好印證了“腎者，做強(qiáng)之官，伎巧出焉”的理論[12]。本試驗(yàn)主要采用糖水?dāng)z入量,即對(duì)糖水的偏嗜程度來(lái)反映大鼠對(duì)食物愉快感的變化。結(jié)果PTSD組子鼠糖水?dāng)z入量明顯少于空白對(duì)照組,表現(xiàn)出了對(duì)糖水獎(jiǎng)賞刺激的低敏感,類似于人類抑郁癥的快感缺失[13]。而中藥情志組干預(yù)后糖水?dāng)z入量增加,接近空白對(duì)照組,與PTSD組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與文獻(xiàn)[14]報(bào)道結(jié)果類似,提示補(bǔ)腎中藥聯(lián)合情志護(hù)理可增加大鼠對(duì)食物獎(jiǎng)賞刺激的敏感性, 改善大鼠的快感缺失。大量研究表明，金匱腎氣丸是一個(gè)經(jīng)典的補(bǔ)腎方劑，有利于恢復(fù)恐懼導(dǎo)致腎虛的生理和行為紊亂[7-8，15]。

體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)是反映子鼠生理變化的基本指標(biāo)，而曠場(chǎng)試驗(yàn)、糖水試驗(yàn)則是反映子鼠行為癥狀的基本指標(biāo)[5]。以往研究表明孕鼠若遭到壓力情境，子鼠可表現(xiàn)出回應(yīng)母代壓力的遺傳學(xué)變化[8],其內(nèi)在機(jī)制可能與母鼠PTSD的不良影響通過(guò)表觀遺傳因素作用于子代有關(guān)[1]。研究表明表觀遺傳在PTSD發(fā)生、行為遺傳與神經(jīng)生物學(xué)改變中扮演“橋接”的關(guān)鍵角色，也是“恐傷腎”“腎主生長(zhǎng)發(fā)育”“母病及子”的經(jīng)典論述的具體體現(xiàn)[1，16]。

本實(shí)驗(yàn)不足之處在于未將補(bǔ)腎中藥與情志護(hù)理分別作為干預(yù)因素研究，但是結(jié)合臨床，對(duì)PTSD的治療和護(hù)理往往不是采用某一措施，需要藥物、心理等多手段調(diào)護(hù)。為了更好地說(shuō)明對(duì)PTSD的干預(yù)效果，課題組將進(jìn)一步細(xì)化研究。

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Study on the effect of TCM nursing combined with tonifying kidney Chinese medicine on behavioral genetics of maternal SD rats with PTSD and their offspring

ZHANG Hui, ZHANG Xiangeng, CAO Bing, LIU Xiangmin, LONG Yujun, CAO Jun, XIE Wenyi, LIU Shuang

Chengdu University of TCM, Chengdu 611137, Sichuan, China)

Objective It is to find out the influence of TCM nursing combined with tonifying kidney Chinese medicine on behavioral genetics of maternal SD rats with post-traumatic stress disorder (PTSD) and their offspring with fetus injury.Methods 12pregnant rats were randomly divided into 3groups: blank control group, PTSD group, and emotion-medicine group.PTSD models were established by single prolonged stress (SPS).After the models were established, the rats in emotion-medicine group were given Jin Kui Shenqi Wan mixed into conventional feed to supple their kidney and given emotional nursing through enriched environmental cage.Repeat measurements included body weight, body length, tail length, open-field test (OFT) performance, and saccharose water consumption were performed on.Results The body weight increase of the offsprings in PTSD group were slowest, and the increase was faster in emotion-medicine group which was better than that in the control group (P<0.05).In OFT, PTSD group showed the lowest score (P<0.05) while there was no statistical difference between the control group and emotion-medicine group (P>0.05).In saccharose water consumption tests, the consumption of sugar water in PTSD group was the least compared with the other two groups (P<0.05), while there was no statistical difference between the control group and emotion-medicine group (P>0.05).Conclusion The negative influence derived from maternal PTSD could be handed down to the offsprings resulting in growth and development retardation.Kidney-supplementing remedy and emotional nursing could recover the retardation and even promote growth and development.Our findings might lay a foundation for further study on the genetic mechanism and treatment and prevention facing PTSD fetus injury.

PTSD; SPS; fetus injury; emotional nursing; Kidney-supplementing remedy; Jin Kui Shen Qi Pill

張輝，男,講師，碩士研究生，主要從事中醫(yī)心理學(xué)與中醫(yī)護(hù)理學(xué)研究。

張先庚，E-mail:xiangengzhang666@sina.com

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373710)；成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金項(xiàng)目(ZRMS201348)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.17.001

R-332

A

1008-8849(2015)17-1825-04

2014-11-30