PJ34對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注腦組織MMP-9、Claudin-5表達(dá)的影響

吳捧蓮，李巖，付新慧，杜良鶴，王東玉

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧省錦州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000）

·論著·

PJ34對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注腦組織MMP-9、Claudin-5表達(dá)的影響

吳捧蓮1，李巖2，付新慧1，杜良鶴1，王東玉2

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧省錦州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000）

目的探討多聚ADP核糖聚合酶1（PARP-1）抑制劑PJ34對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后缺血側(cè)皮層金屬蛋白酶9（MMP-9）和Claudin-5表達(dá)的影響。方法采用線栓法制備大鼠局灶腦缺血再灌注模型，腹腔注射PJ34，用伊文思藍(lán)（EB）法檢測(cè)血腦屏障通透性變化，采用2，3，5-三氨基苯甲四氮唑（TTC）染色檢測(cè)腦梗死體積變化，免疫組化和Western blot方法檢測(cè)腦缺血側(cè)皮層MMP-9和Claudin-5表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，隨缺血再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，模型組MMP-9表達(dá)、EB含量、腦梗死體積逐漸增加，48 h達(dá)峰；Claudin-5的表達(dá)、EB含量、腦梗死體積逐漸減少，48 h最低（P均＜0.05）。與模型組比較，PJ34組MMP-9表達(dá)、EB含量、腦梗死體積在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯降低，Claudin-5的表達(dá)、EB含量、腦梗死體積在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯增高（P均＜0.05）。結(jié)論P(yáng)J34通過(guò)抑制MMP-9的表達(dá)，增加Claudin-5的表達(dá)來(lái)維持血腦屏障通透性，對(duì)腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用。

PJ34；金屬蛋白酶9；Claudin-5；血腦屏障；缺血再灌注

PARP-1的抑制劑PJ34［N-（6-氧代-5，6二氫-菲-2-基）-N，N-二甲基乙酰胺］，為水溶性菲啶酮類化合物，主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性阻斷多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase-1，PARP-1）分子上NAD+結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮作用，在缺血再灌注損傷和帕金森病、癌癥的動(dòng)物模型中取得較好治療效果［1］。PJ34對(duì)缺血再灌注損傷血腦屏障通透性的研究機(jī)制尚未完全清楚。近年研究表明金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）可以降解基底膜蛋白、層黏連蛋白、膠原蛋白和緊密連接蛋白（Claudin-5和occludin），破壞血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）通透性。

本實(shí)驗(yàn)研究建立在上述研究的基礎(chǔ)上，采用線栓法制備局灶性腦缺血再灌注模型，選用PJ34作為干預(yù)因素，觀察PJ34對(duì)大鼠局灶腦缺血再灌注BBB通透性變化、缺血側(cè)腦組織MMP-9、Claudin-5蛋白表達(dá)的影響，探討PJ34減輕腦缺血再灌注損傷的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

健康Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠120只，體質(zhì)量250～300 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK［遼］2010-0001）。隨機(jī)均分為3組：假手術(shù)組、模型組、PJ34組。各組分別在缺血再灌注24 h、48 h取材。PJ34組在缺血再灌注時(shí)及再灌注后2 h分別給予PJ34（10 mg/kg），假手術(shù)組、模型組在相同時(shí)間點(diǎn)給予等量生理鹽水。PJ34購(gòu)自Selleck.cn公司；兔抗鼠MMP-9多克隆抗體、生物素標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗鼠Claudin-5多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司。

1.2 大鼠局灶性大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型制備

參照Longa等［2］的實(shí)驗(yàn)方法，制作大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血再灌注模型。采用直徑2 mm的魚(yú)線，長(zhǎng)約5.8 cm，一端用酒精燈稍加熱使魚(yú)線頭部直徑約為0.25～0.28 mm，備用。大鼠10%水合氯醛（300 mg/kg，腹腔注射）麻醉后，固定，消毒，頸部正中切口，分離頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)、外動(dòng)脈，勿損傷迷走神經(jīng)，于頸總動(dòng)脈近心端、頸外動(dòng)脈根部結(jié)扎，在頸總動(dòng)脈分叉近心端處剪一小口，插入魚(yú)線，進(jìn)線（1.8±0.5）cm，感到有阻力時(shí)，即栓線到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始處及大腦前動(dòng)脈近心端，從而阻斷大腦中動(dòng)脈血流，結(jié)扎固定魚(yú)線?？p合筋膜、皮膚。栓塞2 h后使血流再通。假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程與模型組相同，不插魚(yú)線。大鼠麻醉后約2 h開(kāi)始蘇醒，于再灌注時(shí)判斷其神經(jīng)功能缺損情況，按照l(shuí)onga評(píng)分法［3］進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分1～3分納入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，0分、4分剔除，符合評(píng)分但有蛛網(wǎng)膜下腔出血、術(shù)后死亡作為缺失值剔除，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)足，術(shù)后保持環(huán)境溫度25～30℃。

1.3 伊文思藍(lán)（Evans blue，EB）BBB通透性測(cè)定

每亞組隨機(jī)抽取5只大鼠，在取腦前30 min經(jīng)尾靜脈注射2%EB。麻醉后用肝素化生理鹽水心臟灌流至右心房流出液體為清亮。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取腦組織，稱重，置于甲酰胺中（100 mg/mL），45℃水浴24 h，離心取上清液。分光光度計(jì)波長(zhǎng)為620 mm測(cè)定上清液吸光度（optical density，OD）值，腦組織EB含量計(jì)算公式：腦組織EB含量（μg/g）=待測(cè)樣品EB含量（μg/mL）×甲酰胺溶液（mL）/腦濕重（g），待測(cè)樣品EB含量是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求得。

1.4 腦梗死體積測(cè)定（TTC染色法）

每亞組隨機(jī)抽取5只大鼠，斷頭取腦，快速經(jīng)枕骨大孔取出腦組織，洗凈腦組織，-20℃冰箱速凍30 min。腦組織從額極向后以2 mm間距冠狀切成5片。腦片置于37℃水浴箱避光染色15～30 min，注意中間翻片使切片均勻接觸染色液，10%多聚甲醛中固定。鼠腦切片用數(shù)碼相機(jī)拍照，用眼科鑷分離白色區(qū)與紅色區(qū)，分別稱重，以梗死組織重量占缺血側(cè)腦組織重量的百分比作為梗死體積的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 免疫組化染色檢測(cè)MMP-9、Claudin-5在腦組織的表達(dá)

每亞組隨機(jī)抽取5只大鼠10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，快速打開(kāi)胸腔，經(jīng)左心室穿刺插管入主動(dòng)脈，灌注4℃生理鹽水250 mL，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，4%多聚甲醛250 mL緩慢灌注至液體清亮斷頭取腦，固定液中保存。常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，連續(xù)冠狀切片，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行MMP-9、Claudin-5免疫組化染色。切片染色后每個(gè)樣本選取5張切片，每張切片于400倍光鏡下系統(tǒng)隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算平均積分光密度值（mean oprieal density，MOD）。圖像分析MMP-9、Claudin-5在腦組織額頂葉皮層的表達(dá)，用Image-ProPlus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行圖像分析。

1.6 Western blot檢測(cè)MMP-9、Claudin-5在腦組織的表達(dá)

每亞組隨機(jī)抽取5只大鼠，斷頭取腦，冰上迅速分離額頂葉皮層，放入EP管中，-80℃冰箱保存。組織標(biāo)本加入適量裂解液，進(jìn)行超聲波粉碎，低溫離心取上清液。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度定量，沸水煮5 min，離心備用。制備分離膠和濃縮膠，加樣，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗：兔抗大鼠多克隆MMP-9抗體（1∶300）和Claudin-5（1∶300）4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗，5 min× 3次，加二抗（山羊抗兔IgG，1∶3 000）孵育2 h。TBST漂洗，5 min×3次，ECL發(fā)光，X線曝光、顯影、定影，計(jì)算機(jī)圖像分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PJ34對(duì)血腦屏障通透性的影響

用EB法檢測(cè)血腦屏障通透性，EB含量變化來(lái)評(píng)價(jià)血腦屏障通透性變化。與假手術(shù)組比較，模型組與PJ34組均明顯增高（P＜0.05），EB含量在再灌注后48 h達(dá)峰。與模型組比較，PJ34組能降低血腦屏障的破壞，使EB含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 PJ34對(duì)大鼠EB含量的影響（μg/g濕重）Tab.1 Influence of PJ34 on EB content in rats（μ g/g wet weight）

2.2 梗死體積百分比測(cè)定

用TTC染色法檢測(cè)腦梗死體積。與假手術(shù)組比較，模型組與PJ34組均明顯增高（P＜0.05），腦梗死體積在再灌注后48 h達(dá)峰。與模型組比較，PJ34組腦梗死體積明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)表2。

表2 大鼠腦梗死體積百分比比較（%）Tab.2 Comparison of the percentage of infarct volume in rats（%）

2.3 MMP-9和Claudin-5的分布和表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，MMP-9在缺血側(cè)額頂葉皮層胞質(zhì)中呈棕褐色或棕黃色陽(yáng)性表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組、PJ34組MMP-9的MOD值在再灌注后24 h增加，48 h達(dá)高峰，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，PJ34組MMP-9的MOD值在再灌注后減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖1。Claudin-5在缺血側(cè)額頂葉皮層中沿微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕褐色或棕黃色表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組和PJ34組Claudin-5在再灌注后24 h MOD值降低，48 h MOD值降低最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，PJ34組Claudin-5在再灌注后MOD值均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖2。

圖1 免疫組化法檢測(cè)大鼠缺血側(cè)皮層MMP-9的表達(dá) ×400Fig.1 Expressions of MMP-9 measured by immunohistochemistry assay in the ischemic cerebral cortex of rats×400

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)免疫組化法檢測(cè)MMP-9蛋白和Claudin-5蛋白的MOD值比較Tab.3 Comparison of the MOD values of MMP-9 and Claudin-5 protein in each group at different time points in rats by Immunohistochemistry

圖2 免疫組化法檢測(cè)缺血側(cè)微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Claudin-5的表達(dá) ×400Fig.2 Expressions of claudin-5 measured by immunohistochemistry assay in the ischemic brain microvessel endothelial cells of rats ×400

2.4 Claudin-5和MMP-9蛋白的表達(dá)

采用Western blot法進(jìn)一步證實(shí)假手術(shù)組、模型組和PJ34組中Claudin-5和MMP-9蛋白表達(dá)的影響。與假手術(shù)組比較，模型組出現(xiàn)MMP-9特異性條帶，24 h增高，48 h達(dá)峰；與模型組比較，PJ34組 MMP-9特異性條帶均減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組Claudin-5特異性條帶24 h降低，48 h降低最明顯；與模型組比較，PJ34組Claudin-5特異性條帶均增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4、圖3。

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)MMP-9蛋白和Claudin-5蛋白相對(duì)含量的比較（%）Tab.4 Comparison of the relative content of MMP-9 and Claudin-5 protein in each group at different time points in rats by Western blot（%）

圖3 Western blot法檢測(cè)缺血側(cè)皮層MMP-9、Claudin-5的表達(dá)Fig.3 The expressions of MMP-9 and Claudin-5 were measured by Western blot analysis in the ischemic cerebral cortex of rats

3 討論

PARP-1抑制劑在心腦血管疾病、癌癥、內(nèi)分泌疾病和炎癥中的作用已經(jīng)成為全球研究和關(guān)注的熱點(diǎn)，但較少見(jiàn)其對(duì)血腦屏障通透性方面的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要觀察了PARP-1抑制劑PJ34對(duì)MMP-9、Claudin-5在腦缺血再灌注損傷中表達(dá)的影響，旨在探討PJ34對(duì)血腦屏障通透性影響的研究機(jī)制。

PARP-1是一種DNA損傷效應(yīng)酶，主要分布細(xì)胞核內(nèi)，對(duì)DNA損傷修復(fù)起重要作用。當(dāng)機(jī)體發(fā)生DNA損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，PARP-1被激活，應(yīng)用PARP-1抑制劑PJ34，可以抑制PARP-1的表達(dá)，能充分恢復(fù)ATP水平，減少神經(jīng)細(xì)胞死亡，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用［4］。研究表明在大鼠局灶腦缺血再灌注損傷中，PJ34干預(yù)使腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達(dá)減少，降低TNF-α對(duì)MMP-9mRNA合成的誘導(dǎo)，從而降低MMP-9的表達(dá)［5，6］。Koh等［7］通過(guò)研究PARP抑制劑3-氨基苯甲酰胺（3-aminobenzamide，3-AB）的治療效果，PARP抑制劑3-AB治療組各時(shí)間點(diǎn)血漿及腦內(nèi)MMP-9的水平、核轉(zhuǎn)錄因子kB（nuclear factor-kappa B，NF-kB）的活性顯著減少。TNF-α通過(guò)NF-kB基因的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，誘導(dǎo)MMP-3的表達(dá)，MMP-3能激活MMP-9。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，在腦缺血再灌注損傷24 h時(shí)，MMP-9表達(dá)明顯升高，48 h時(shí)達(dá)高峰，PJ34干預(yù)腦缺血再灌注后，缺血側(cè)皮層MMP-9的活性降低、表達(dá)減少，梗死體積減少，神經(jīng)缺損有所改善。

腦缺血再灌注后激活的膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元及浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞均能釋放MMP-9，MMP-9可以攻擊腦毛細(xì)血管基底膜和緊密連接（tight junction，TJ）蛋白，導(dǎo)致白細(xì)胞浸潤(rùn)、血腦屏障開(kāi)放、血管源性水腫、缺血后出血性轉(zhuǎn)化［8］。Claudin-5是構(gòu)成TJ蛋白的骨架蛋白，是決定TJ蛋白屏障通透性的主要蛋白，維護(hù)大鼠的BBB完整性。TJ蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成腦和血液之間物質(zhì)交換的第一道屏障，BBB是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵。因此，MMP-9可以降解Claudin-5蛋白。研究表明在大鼠缺血再灌注損傷模型組，MMP-9表達(dá)升高，Claudin-5表達(dá)減少，PARP抑制劑3-AB（10 mg/kg）治療組顯著上調(diào)Claudin-5的蛋白表達(dá)［9］。再灌注損傷中血腦屏障通透性破壞的一個(gè)重要機(jī)制是MMP-9降解Claudin-5［10，11］。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致，應(yīng)用PJ34干預(yù)后MMP-9表達(dá)減少，Claudin-5表達(dá)增加。MMP-9和Claudin-5在調(diào)節(jié)血腦屏障通透性和血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性中起重要作用［12］。大鼠腦缺血損傷后，MMP-9被激活，激活的MMP-9通過(guò)降解Claudin-5，增加血腦屏障通透性。應(yīng)用MMP-9抑制劑后，Claudin-5表達(dá)下調(diào)，血腦屏障通透性減少［13］。MMP-9降解Claudin-5的機(jī)制可能為：缺血再灌注損傷使炎性因子增加，導(dǎo)致NF-kB磷酸化，NF-kB的激活能上調(diào)MMP-9的表達(dá)［14］。Claudin-5的降解和血腦屏障通透性增加是MMP-9通過(guò)NF-kB/MMP-9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究也提示，在腦缺血再灌注后，MMP-9的表達(dá)下降可以增加Claudin-5的表達(dá)。

本研究采用大腦中動(dòng)脈栓塞制備局灶腦缺血再灌注模型，在缺血再灌注后24 h，MMP-9的表達(dá)增加，Claudin-5的表達(dá)減少，血腦屏障通透性增加，梗死體積增加。在48 h時(shí)間點(diǎn)MMP-9的表達(dá)達(dá)峰，Claudin-5的表達(dá)最低，血腦屏障通透性達(dá)峰，腦梗死體積進(jìn)一步增加，表明MMP-9參與血腦屏障的破壞，Claudin-5對(duì)血腦屏障有保護(hù)作用。應(yīng)用PJ34干預(yù)后，MMP-9的表達(dá)減少，Claudin-5的表達(dá)增加，從而改善血腦屏障通透性，減少梗死體積，減少缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損。

綜上所述，PJ34通過(guò)降低MMP-9的表達(dá)，減少Claudin-5的降解，使Claudin-5的表達(dá)增加，改善血腦屏障通透性，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

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（編輯 武玉欣）

Influence of PJ34 on the Expression ofMMP-9 and Claudin-5 in Ratwith FocalCerebral Ischemia Reperfusion Injury

WUPeng-lian1，LIYan2，F(xiàn)UXin-hui1，DU Liang-he1，WANG Dong-yu2
（1.Graduate SchoolofLiaoning MedicalUniversity，Jinzhou 121001，China；2.DepartmentofNeurology，Jinzhou CentralHospital，Jinzhou 121000，China）

Objective To investigate the effectsofPJ34，a poly ADP-ribose polymerase（PARP）inhibitor，on the expression ofmatrix metalloproteinases-9（MMP-9）and Claudin-5 in ischemic cortex of rats with focal cerebral ischemia-reperfusion（I/R）injury.MethodsThe focal cerebral ischemia-reperfusion model of middle cerebral artery occlusion（MCAO）was established by intraluminal suture.PJ34 was injected intraperitoneally.Blood-brain barrier（BBB）permeability was quantitatively determined by Evansblue assay.Infarctvolume changes were observed by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloridedyeing（TTC）staining.The expression ofthe MMP-9 and Claudin-5 in rats ofcerebralcortex were measured by immunohistochemistry assay and Western blotanalysis.ResultsCompared with sham group，the expression ofMMP-9，the contents ofEB and infarctvolume increased progressively over time after I/R，and reached maximum levels at 48 h（P＜0.05）；The expression of Claudin-5，the contents of EB and infarct volume reduced significantly over time after I/R，and reached the minimum levels at 48 h in model group（P＜0.05）.Compared with model group，the expression of MMP-9，the contents of EB and infarct volume was reduced significantly and the expression of Claudin-5，the contents ofEB and infarctvolume was increased atthe same time pointin PJ34 group（P＜0.05）.ConclusionPJ34 maintained the blood-brain barrierpermeability by inhibiting the expression ofMMP-9，and increasing the expression ofClaudin-5，which had neuroprotection on cerebralischemiareperfusion injury.

PJ34；matrix metalloproteinases-9；Claudin-5；blood-brain barrier；ischemia-reperfusion

R743.3

A

0258-4646（2015）08-0694-05

遼寧省自然科學(xué)基金（201102074）

吳捧蓮（1988-），女，碩士研究生.

王東玉，E-mail：1448219167@qq.com

2015-02-24

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