豬丹毒檢測方法的對比與分析

劉俐君，張 見，趙小波，林 潔，田益明，邢云云

（1.四川省達(dá)州市動物疫病預(yù)防控制中心四川達(dá)州635000；2.南京仕必得生物技術(shù)有限公司江蘇南京211000）

豬丹毒檢測方法的對比與分析

劉俐君1，張 見2，趙小波2，林 潔2，田益明2，邢云云1

（1.四川省達(dá)州市動物疫病預(yù)防控制中心四川達(dá)州635000；2.南京仕必得生物技術(shù)有限公司江蘇南京211000）

豬丹毒是由豬丹毒桿菌引起的，通常與生產(chǎn)中的豬只高死亡率和低生長性能息息相關(guān)。由于該病的持續(xù)傳播，世界范圍內(nèi)大約有30%～50%的生豬在扁桃體和淋巴結(jié)都攜帶有丹毒桿菌。近年來，豬丹毒在我國大有卷土重來的趨勢，雖然實驗證明青霉素類和頭孢類抗菌藥物對豬丹毒仍有顯著療效，使用豬丹毒G4T10株弱毒疫苗也可產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)力，但豬丹毒往往呈急性經(jīng)過，且無特征性病理變化，導(dǎo)致不能及時對癥治療，免疫失敗更是時常發(fā)生。所以只有實時監(jiān)測疫苗免疫效果和及時進(jìn)行早期診斷才能有效防治豬丹毒。本文就豬丹毒的檢測方法研究進(jìn)展進(jìn)行了簡要概述。

1 豬丹毒的檢測樣品

豬群可以通過攝入污染的飼料和水或者皮膚擦傷感染豬丹毒。亞臨床感染豬被認(rèn)為是豬丹毒急性暴發(fā)的容器，一旦感染，動物就會通過糞便、尿液、唾液和鼻腔分泌物散布該菌，并且能成功分離到丹毒桿菌。其分布數(shù)量與病程和器官特性有關(guān)。根據(jù)豬丹毒桿菌在各臟器的分布情況，通常采取病豬的血液、腎臟、脾臟、肝臟、心血、淋巴結(jié)、病變關(guān)節(jié)、病變皮膚、扁桃體等進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。有研究表明，病料中以腎臟的分離率最高。但通常采集病豬血液或血清進(jìn)行檢測居多。另外血漿樣本也可替代血清樣本，Eric J.等（2008）經(jīng)ELISA試驗檢測豬丹毒抗體的研究發(fā)現(xiàn)，血清和血漿的OD值沒有顯著差異?？谇灰后w也可作為診斷和監(jiān)測樣本。Luis G等（2013）通過懸掛棉繩采集豬唾液成功用于豬丹毒檢測方法的比對。相對于血清樣本，該取樣方法一個人便可以操作，對人沒有攻擊性，豬亦沒有應(yīng)激反應(yīng)，成本相對低，有利于大量監(jiān)測研究和多個病原體的研究的采樣。

2 豬丹毒的檢測方法

由于豬丹毒對養(yǎng)豬生產(chǎn)造成的危害較大，所以用于豬丹毒診斷、免疫評價及監(jiān)測的方法研究從未間斷。常用的是從可疑病灶進(jìn)行細(xì)菌分離，但是由于豬丹毒桿菌菌落小，生長緩慢以及頻繁的污染，豬丹毒桿菌很難被分離，加上抗生素的大量使用，臨床采集樣品也不容易分離出病原體。因此尋找更為先進(jìn)、簡便快速、敏感特異的檢測方法的研究工作仍在繼續(xù)。

3.1 凝集試驗

凝集試驗中，由于凝集價與機(jī)體的免疫力有較強(qiáng)的相關(guān)性，培養(yǎng)凝集試驗經(jīng)多次改進(jìn)后廣泛用于動物血清抗體的檢測和疫苗免疫效果的評價。多位研究者對培養(yǎng)凝集試驗、血凝抑制試驗和試管凝集試驗的可靠性進(jìn)行了比較，結(jié)果證明培養(yǎng)凝集試驗?zāi)軌虼_切反映出豬的免疫水平，并且能區(qū)分免疫豬和非免疫豬。另外有試驗證明，間接血凝試驗與培養(yǎng)凝集試驗同樣可靠，并且有快速的特點。由此法改進(jìn)的反向間接血凝試驗也同樣特異、敏感，其檢出率從85.7%至100%不等。但該試驗對條件要求嚴(yán)格，必須提供高免血清，采樣等需無菌操作。

3.2 沉淀試驗

沉淀試驗主要用作該菌血清型的鑒定。我國學(xué)者馬聞天（1963）、崔治中（1979）、楊瑋云（1983）、佘永建（1984）等也先后成功用此法進(jìn)行了菌株的血清型鑒定。而日本赤澤（1952）曾試圖用此法進(jìn)行臨床診斷，但發(fā)現(xiàn)難以區(qū)分病豬與健康豬，因此中斷應(yīng)用。

3.3 變態(tài)反應(yīng)試驗

豬丹毒桿菌系兼性胞內(nèi)寄生菌，能刺激機(jī)體產(chǎn)生心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎等變態(tài)反應(yīng)，變態(tài)反應(yīng)診斷法

由此而來。雖有試驗證明該病能產(chǎn)生炎性反應(yīng)，但也有學(xué)者認(rèn)為其診斷結(jié)果不準(zhǔn)確，所以未廣泛使用。

3.4 補(bǔ)體結(jié)合試驗

自補(bǔ)體結(jié)合試驗創(chuàng)建后，Bercorich等改進(jìn)了抗原的制法，建立了一種在V型微量滴定板上進(jìn)行的補(bǔ)體結(jié)合試驗。此法可以區(qū)分臨床感染豬與預(yù)防接種豬，并在數(shù)小時內(nèi)得出結(jié)果，比生長抑制試驗具有更高的敏感性和特異性。

3.5 酶免疫試驗

Kirchhoff首創(chuàng)間接酶免疫試驗用于檢測試驗感染豬和鼠血清以及田間采集豬血清樣品中的豬丹毒抗體。在此基礎(chǔ)上，多位學(xué)者對ELISA的包被抗原進(jìn)行了改進(jìn)。Sato,H等提純豬丹毒64 kDa蛋白抗原用于ELISA，其結(jié)果和乳膠凝集試驗及生長凝集試驗結(jié)果高度一致，證明ELISA可以用于監(jiān)測抗體的動態(tài)變化。Imada采用豬丹毒表面蛋白SpaA416作為抗原建立ELISA成功用于疫苗接種的保護(hù)性抗體、母源抗體和感染性抗體的監(jiān)測。肖國生等以豬丹毒CD3004(1a型)和C43-12(2型)菌株為抗原提取菌株，EDTA滲透法提取的抗原作為膜載抗原，創(chuàng)建了Dot－PAA－ELISA檢測豬丹毒抗體。作者認(rèn)為適合基層檢疫單位和養(yǎng)豬企業(yè)用于豬群免疫監(jiān)測和豬丹毒流行病學(xué)調(diào)查。Luis G認(rèn)為以rSPaA415抗原建立的ELISA比商業(yè)的試劑盒更敏感。

3.6 免疫組化試驗

已有研究者用免疫組化方法（IHC）從試驗攻毒豬丹毒桿菌的豬關(guān)節(jié)中檢測出抗原，但未得到推廣。為將這種方法作為常規(guī)診斷手段，Tanja等用IHC法檢測石蠟組織切片上的豬丹毒抗原，證明此法具有高度的特異性和敏感性。對于經(jīng)抗生素治療的動物病料或皮膚損傷中的豬丹毒抗原，細(xì)菌分離培養(yǎng)為陰性時尤其實用。

3.7 熒光免疫試驗

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為熒光抗體檢測法特異性強(qiáng)，敏感性高，檢驗時間短，但早年因其方法復(fù)雜未廣泛應(yīng)用。宣華等（1982）用直接熒光法檢測病料中的丹毒絲菌，此法的敏感性僅次于或與培養(yǎng)和動物接種試驗一樣，而用時僅需1～2h。

微粒子免疫檢測技術(shù)(microbead immuno assay， MIA)是一種微粒子及捕捉免疫熒光相結(jié)合的方法，此法可以檢測蛋白質(zhì)和核酸，具有敏感、特異、快速、穩(wěn)定、高處理量、可進(jìn)行多重測定、樣品用量少的優(yōu)勢。Luis G.（2012）等在表面蛋白SPA的基礎(chǔ)上重組多肽rSpaA415作為抗原，建立了熒光微粒子免疫檢測技術(shù)（FMIA）用于檢測抗豬丹毒的IgG抗體。結(jié)果顯示該方法比傳統(tǒng)的ELISA商業(yè)試劑盒更敏感，尤其是感染和免疫初期。它可以在一個反應(yīng)孔里同時檢測多個病原體或抗原的血清抗體。當(dāng)篩選大量樣品的時候，大大節(jié)省了人力和時間及成本。作者認(rèn)為以rSpaA415為載體的熒光微粒體免疫檢測技術(shù)作為ELISA的替代品具有良好的發(fā)展前景。

3.8 分子生物學(xué)方法

Makino S（1994）基于16S rRNA序列建立了PCR方法用于檢測小鼠關(guān)節(jié)和脾臟中的丹毒桿菌，試驗在6個小時內(nèi)完成，能區(qū)別出E.Rhusiopathiae和E.Tonsillarum2個種屬。奠定了豬丹毒桿菌分子生物學(xué)檢測方法的基礎(chǔ)。Takeshi K（1999）改進(jìn)的PCR方法用于屠宰場豬丹毒的篩選，特異性強(qiáng)，能夠區(qū)分4個種屬的丹毒桿菌。從患病動物采樣檢測與分離培養(yǎng)方法相比，PCR檢測在5個小時內(nèi)完成，特異性和耗時都有所改進(jìn)。

Pal,N（2009）等創(chuàng)建了多重RT-PCR方法用于檢測試驗攻毒和疑似自然感染豬豬丹毒桿菌，并且與傳統(tǒng)PCR方法和富集分離培養(yǎng)法相比較，結(jié)果證明該方法簡單、快速、重復(fù)性好，特異性強(qiáng)，敏感性高。與PCR方法比減少了DNA提取之前繁瑣冗長的培養(yǎng)提取步驟，更有利于實驗室快速檢測診斷豬丹毒。

4 小結(jié)

豬丹毒的檢測方法，除了準(zhǔn)確性的要求，其臨床實用性的要求也是至關(guān)重要的。只有選擇合適的檢測方法，才能有效的對該病進(jìn)行監(jiān)測和早期治療。各種檢測方法各有利弊，Luis G.（2013）等比較了細(xì)菌分離培養(yǎng)、ELISA、FMIA和RT-PCR四種方法，認(rèn)為RT-PCR和FMIA兩種方法結(jié)合是豬丹毒感染最好的監(jiān)測或診斷方法。用RT-PCR和/或FMIA方法IgM檢測為陽性，IgG陰性則認(rèn)為是感染的急性階段，僅有IgG陽性則認(rèn)為是疾病的慢性階段。因此，何種方法會在今后的臨床應(yīng)用中得到最為廣泛的推廣，還需要臨床實踐的進(jìn)一步檢驗。■（編輯：狄慧）