IDH1突變和MGMT基因啟動(dòng)子甲基化在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)及關(guān)聯(lián)度分析☆

朱瀟鵬唐軍海黃國(guó)浩徐慶福臧振樂(lè)趙邦云王彬呂勝青

·論 著·

IDH1突變和MGMT基因啟動(dòng)子甲基化在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)及關(guān)聯(lián)度分析☆

朱瀟鵬*唐軍海*黃國(guó)浩*徐慶福*臧振樂(lè)*趙邦云*王彬△呂勝青*

目的探討腦膠質(zhì)瘤中異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenases 1，IDH1)突變和O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及二者之間的關(guān)聯(lián)性。方法收集手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的腦膠質(zhì)瘤組織133例，采用巢式甲基化特異性PCR（nested methyla?tion-specific PCR，nMSP）法和甲基化特異性PCR（methylation specific PCR,MSP）法聯(lián)合變性高效液相色譜分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤中的MGMT基因啟動(dòng)子甲基化情況，直接測(cè)序法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤中IDH1基因的突變情況。采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行IDH1突變和MGMT基因啟動(dòng)子甲基化關(guān)聯(lián)度的統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果133例腦膠質(zhì)瘤患者中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化88例（66.17%），IDH1突變62例（46.62%）。IDH1突變和MGMT基因啟動(dòng)子甲基化存在關(guān)聯(lián)（P=0.01）。結(jié)論腦膠質(zhì)瘤中IDH1突變和MGMT基因啟動(dòng)子甲基化之間關(guān)聯(lián)顯著，提示兩者在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中可能存在相互調(diào)節(jié)的作用；IDH1突變和MGMT基因啟動(dòng)子甲基化是腦膠質(zhì)瘤的重要疾病相關(guān)因素。

IDH1突變 MGMT甲基化 腦膠質(zhì)瘤

腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤。研究顯示：腫瘤耐藥影響患者化療療效，是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良的因素之一[1]。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransfer?ase，MGMT）作為人體細(xì)胞內(nèi)普遍存在的DNA修復(fù)蛋白，可通過(guò)還原DNA上的烷基化鳥嘌呤，逆轉(zhuǎn)烷化劑對(duì)DNA的損害[2]。研究顯示：經(jīng)替莫唑胺治療的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，MGMT基因啟動(dòng)子甲基化組患者生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于非甲基化組，提示MGMT基因沉默是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤化療效果好的因素之一[3]。異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenases 1，IDH1）催化異檸檬酸氧化脫羧形成a-酮戊二酸，是細(xì)胞三羧酸循環(huán)能量代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶[4]。在同一級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中伴有IDH1突變患者的存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于野生型IDH1患者[5]，提示IDH1突變是腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后重要指標(biāo)。Molenaar RJ[6]對(duì)98例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者分析發(fā)現(xiàn)：IDH1突變和MGMT基因啟動(dòng)子甲基化聯(lián)合能更好的預(yù)測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存時(shí)間。MGMT基因啟動(dòng)子甲基化和IDH1突變之間是否相關(guān)，進(jìn)而相互調(diào)控，對(duì)闡明兩者在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后評(píng)估中具有重要意義。本研究對(duì)133例腦膠質(zhì)瘤患者M(jìn)GMT基因啟動(dòng)子甲基化及IDH1突變情況進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步探討分析他們之間的關(guān)聯(lián)性，以期為膠質(zhì)瘤患者的診治提供更多理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象收集第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院神經(jīng)外科2011年7月至2014年4月期間手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本，共計(jì)133例。男77例，女56例，年齡7～87歲，平均（44.77± 15.88）歲。根據(jù)WHO（2007）神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[7]，其中WHO I級(jí)2例，WHO II級(jí)44例，WHO III

級(jí)45例，WHO IV級(jí)42例。

1.2 直接測(cè)序法檢測(cè)IDH1基因突變根據(jù)EZ?NA Tissue DNA Kit（OMEGA，美國(guó)）的操作手冊(cè)抽提腫瘤組織DNA。分光光度計(jì)衡量所提DNA純度和含量。選取A260/280在1.7～1.9的DNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。根據(jù)人IDH1基因組序列（GenBank登記號(hào)：NM005896）設(shè)計(jì)IDH1引物，上游引物序列：5’-CGGTCTTCAGAGAAGCCATT-3'，下游引物序列：5’-GCAAAATCACATTATTGCCAAC-3'。退火溫度：60oC，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度：129bp。DNA的純化和測(cè)序由英濰捷基公司生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 巢式甲基化特異性PCR（nested methyla?tion-specific PCR，nMSP）檢測(cè)MGMT基因啟動(dòng)子甲基化采用DNA甲基化試劑盒（EZ DNA MethylationTMKit）對(duì)1μg基因組DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾。然后以MGMT啟動(dòng)子區(qū)引物MGMT-O進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。上游引物序列：5'GGATAT?GTTGGGATAGTT3'，下 游 引 物 序 列 ：5' CCAAAAACCCCAAACCC 3'。以第1輪PCR擴(kuò)增出的MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)目的條帶的PCR產(chǎn)物為模板，用MGMT基因甲基化引物（MGMT-M）和非甲基化引物（MGMT-U）進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增。甲基化引物上游引物序列：5'TTTCGACGTTCGTAG?GTTTTCGC 3'，甲 基 化 下 游 引 物 序 列 ：5' GCACTCTTCCGAAAACGAAACG 3'；非甲基化引物上游引物序列：5'TTTGTGTTTTGATGTTTGTAG?GTTTTTGT 3'，非甲基化下游引物序列：5'AACTC?CACACTCTTCCAAAAACAAAACA 3'。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外光凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照。僅MGMT-U引物擴(kuò)增出相應(yīng)片段，判斷為未甲基化；僅MGMT-M引物擴(kuò)增出相應(yīng)片段或MGMT-U引物和MGMT-M引物均擴(kuò)增出相應(yīng)片段，判斷為甲基化。

1.4 甲基化特異性PCR結(jié)合變性高效液相色譜法（MSP-DHPLC）檢測(cè)MGMT基因啟動(dòng)子甲基化

常規(guī)脫水，制作石蠟切片，寄送中國(guó)人民解放軍空軍航空醫(yī)學(xué)研究所附屬醫(yī)院分子病理中心。石蠟切片DNA的提取，DNA的修飾，MSP以及DHPLC結(jié)果分析都依托該中心完成[8]。MGMT-M擴(kuò)增產(chǎn)物和MGM-U擴(kuò)增產(chǎn)物等比混勻，取5μL上樣。PCR產(chǎn)物進(jìn)樣DNASep核酸分析柱（美國(guó),Transge?nomic），Navigator軟件分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較兩組分子標(biāo)記發(fā)生率之間的差異及MGMT甲基化和IDH1突變關(guān)聯(lián)度，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 IDH1突變的檢測(cè)結(jié)果通過(guò)DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，133例不同級(jí)別膠質(zhì)瘤患者中檢測(cè)出IDH1基因突變62例，總突變率為46.62%，其中61例樣本存在IDH1基因的R132H突變，1例樣本存在IDH1基因的R132S突變。WHO I級(jí)中無(wú)IDH1突變，WHO II、WHO III、繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中IDH1突變率分別為75%、51.11%、50%和8.33%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)組中WHO II(χ2= 32.91，P＜0.001)、WHO III(χ2=14.89，P＜0.001)和繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中(χ2=4.29，P=0.038)IDH1突變率顯著高于原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。IDH1各級(jí)別突變的具體情況見(jiàn)表1。典型的IDH1基因R132H突變見(jiàn)圖1。

2.2 MGMT基因啟動(dòng)子甲基化的檢測(cè)結(jié)果在133例患者中，MGMT基因啟動(dòng)子甲基化患者88例（66.17%）。nMSP法對(duì)98例樣本進(jìn)行MGMT基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)，其中65例（66.33%）腦膠質(zhì)瘤組織中發(fā)生MGMT基因啟動(dòng)子甲基化（圖2）。用MSP-DHPLC法對(duì)35例樣本進(jìn)行檢測(cè)，其中23例（65.71%）存在MGMT基因啟動(dòng)子甲基化（圖3）。WHO I級(jí)、WHO II級(jí)、WHO III級(jí)、WHO IV級(jí)原發(fā)性和WHO IV級(jí)繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中MG?MT基因啟動(dòng)子甲基化比率分別為50%、77.27%、64.44%、52.78%、83.33%。具體情況見(jiàn)表1。

2.3 IDH1突變與MGMT基因啟動(dòng)子甲基化的關(guān)聯(lián)分析133例腦膠質(zhì)瘤樣本中IDH1突變和MG?MT基因啟動(dòng)子甲基化結(jié)果見(jiàn)表2。運(yùn)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析，IDH1突變與MGMT基因啟動(dòng)子甲基化關(guān)聯(lián)顯著（χ2=6.57，P=0.01），列聯(lián)系數(shù)C= 0.217，二者低度相關(guān)。

3 討論

表1 腦膠質(zhì)瘤患者IDH1突變與MGMT甲基化情況

表2 IDH1突變和MGMT基因啟動(dòng)子甲基化結(jié)果比較（χ2檢驗(yàn)）

圖1 IDH1基因突變檢測(cè)圖。A：IDH1基因R132H突變；B：IDH1基因未突變

MGMT作為一種人體細(xì)胞內(nèi)普遍存在的DNA修復(fù)蛋白，能逆轉(zhuǎn)烷化劑對(duì)DNA的損害，是膠質(zhì)瘤對(duì)烷化劑治療效果較好的因素之一[2]，也是臨床上替莫唑胺（temozolomide，TMZ）化療藥物敏感的重要依據(jù)，MGMT基因啟動(dòng)子高甲基化的患者對(duì)TMZ療效明顯[9]。本組133例腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，MGMT基因啟動(dòng)子甲基化的總發(fā)生率為66.17%。WHO I、WHO II、WHO III、原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的MGMT甲基化率分別為50%、77.27%、64.44%、52.78%、83.33%。之前研究發(fā)現(xiàn)，隨著低級(jí)別星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤逐步演變?yōu)槔^發(fā)性GBM，腫瘤中發(fā)生甲基化的比例也隨之增高。本組實(shí)驗(yàn)中WHO III級(jí)的MGMT突變率要低于WHO II和繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，這可能和本實(shí)驗(yàn)未分腫瘤類型有關(guān)，也可能由于MGMT基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生于腫瘤形成的早期階段所造成。

圖2 nMSP法檢測(cè)MGMT基因啟動(dòng)子甲基化。A：MGMT基因啟動(dòng)子甲基化；B：MGMT基因啟動(dòng)子未甲基化

圖3 MSP-DHPLC法檢測(cè)MGMT基因啟動(dòng)子甲基化。A：MGMT基因啟動(dòng)子甲基化；B：MGMT基因啟動(dòng)子未甲基化

有研究表明：IDH1突變好發(fā)于年輕膠質(zhì)瘤患者，該突變?cè)缬赥P53的發(fā)生，是膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展

中的早期分子事件，IDH1突變的患者預(yù)后相對(duì)較好[10]。在本研究中采用直接測(cè)序法對(duì)133例膠質(zhì)瘤進(jìn)行IDH1基因突變檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：89例WHO II-III膠質(zhì)瘤患者中，56例（62.92%）存在IDH1的突變，5例繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中3例（60%）存在IDH1突變，36例原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，3例（8.33%）存在IDH1突變。WHO II級(jí)、WHO III級(jí)膠質(zhì)瘤中IDH1的突變率均高于原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的IDH1突變率顯著高于原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。并且，IDH1突變?cè)诩?jí)別之間無(wú)遞增關(guān)系。

IDH1在WHO II級(jí)、WHO III級(jí)膠質(zhì)瘤和繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的突變率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在原發(fā)性多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（pGBM）中的發(fā)生頻率。這種分布特征與膠質(zhì)瘤特有的CpG島甲基化表型（Glioma-CpG Island Methylator Phenotype, G-CIMP)的分布特征具有很高的一致性[11]。Tur?can[12]將IDH1突變基因轉(zhuǎn)入人永生化星形膠質(zhì)細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入突變IDH1基因的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過(guò)50代培養(yǎng)形成了G-CIMP。說(shuō)明離體實(shí)驗(yàn)中，IDH1基因突變能夠引起高甲基化狀態(tài)。在我們的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)95例WHO II-III和繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：68例（71.58%）檢測(cè)出MGMT基因啟動(dòng)子甲基化，高于36例原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的19例（52.78%）。通過(guò)檢測(cè)患者的IDH1突變以及MGMT甲基化狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，IDH1突變和MGMT基因啟動(dòng)子甲基化之間存在關(guān)聯(lián)。而這種關(guān)系有可能是突變的IDH1催化合成2-羥基戊二酸（2-hy?droxyglutarate，2-HG），大量積聚的2-HG抑制了DNA甲基雙加氧酶(ten-eleven translocation 2，TET2)的活性,最終導(dǎo)致了MGMT基因啟動(dòng)子甲基化[12]。MGMT甲基化狀態(tài)和IDH1突變之間關(guān)聯(lián)性的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤中MGMT甲基化狀態(tài)和IDH1突變存在明顯關(guān)聯(lián)，在腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中，IDH1基因突變及MGMT甲基化狀態(tài)可能存在相互調(diào)節(jié)的作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。二者結(jié)合對(duì)判斷患者預(yù)后，指導(dǎo)臨床為患者制定更合理的化療方案具有重要的參考意義。

[1]邢鵬輝，呂中強(qiáng)，張學(xué)新，等.HIF-1、MGMT、CD133在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)的相關(guān)性研究[J].中國(guó)精神神經(jīng)疾病雜志，2013，39(9):523-527.

[2]Pegg AE.Repair of O(6)-alkylguanine by alkyltransferases[J]. Mutat Res，2000，462(2-3):83-100.

[3]Hegi ME,Diserens AC,Godard S,et al.Clinical trial substanti?ates the predictive value of O-6-methylguanine-DNA methyl?transferase promoter methylation in glioblastoma patients treat?ed with temozolomide[J].Clin Cancer Res，2004，10(6): 1871-1874.

[4]Zhao S,Lin Y,Xu W,et al.Glioma-derived mutations in IDH1 dominantly inhibit IDH1 catalytic activity and induce HIF-1-al?pha[J].Science，2009，324(5924):261-265.

[5]Sanson M,Marie Y,Paris S,et al.Isocitrate dehydrogenase 1 co?don 132 mutation is an important prognostic biomarker in glio?mas[J].J Clin Oncol，2009，27(25):4150-4154.

[6]Molenaar RJ,Verbaan D,Lamba S,et al.The combination of IDH1 mutations and MGMT methylation status predicts survival in glioblastoma better than either IDH1 or MGMT alone[J].Neu?ro Oncol，2014，16(9):1263-1273

[7]楊學(xué)軍.解讀《世界衛(wèi)生組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類（2007年）》[J].中國(guó)精神神經(jīng)疾病雜志，2007，33(9):513-518.

[8]閆瑾,方旭前,任長(zhǎng)慶,等.MSP-DHPLC技術(shù)檢測(cè)MGMT基因甲基化的應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].分子診斷與治療雜志，2011，03 (1):6-9.

[9]Stupp R,Hegi ME,Mason WP,et al.Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiothera?py alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study:5-year analysis of the EORTC-NCIC trial[J].Lancet On?col，2009，10(5):459-466

[10]Watanabe T,Nobusawa S,Kleihues P,et al.IDH1 mutations are early events in the development of astrocytomas and oligo?dendrogliomas[J].Am J Pathol，2009，174(4):1149-1153.

[11]Noushmehr H,Weisenberger DJ,K D,et a1.Identifcation of a CpG island methylator phenotype that defnes a distinct sub?group of glioma[J].Cancer Cell，2010，17(5):510-522．

[12]Turcan S,Rohle D,Goenka A,et al.IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype[J].Nature，2012，483(7390):479-483.

R739.41

A

2014-11-19）

（責(zé)任編輯:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.02.010

☆ 國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81272783）和重慶市衛(wèi)生局科研課題（編號(hào)：2012-2-305）資助

* 第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院神經(jīng)外科（重慶 400037）

△ 重慶市永川區(qū)人民醫(yī)院